CN113817626A - 一种油菜假单胞杆菌y1及其培养方法和应用，土壤改良剂 - Google Patents

一种油菜假单胞杆菌y1及其培养方法和应用，土壤改良剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种油菜假单胞杆菌Y1及其培养方法和应用，土壤改良剂。本发明首次公开了一种油菜假单胞杆菌Y1(Pseudomonas brassicacearum)，保藏编号为CGMCC No.20127。该油菜假单胞杆菌Y1具有较强的解磷解硅解钾、固氮和产IAA及耐盐碱的能力，它还能产铁载体ACC脱氨酶，以及具有氧化酶和过氧化氢酶活性、弱硝酸还原酶活性；并且对一些植物病原菌有一定的拮抗作用。该油菜假单胞杆菌Y1与木霉菌及其它组分复配得一种土壤改良剂，该土壤改良剂能促进土壤中有效磷、硅、钾等营养元素的增加，促使作物营养均衡吸收。通过试验表明对我国沙漠土壤具有明显改良作用。

Description

一种油菜假单胞杆菌Y1及其培养方法和应用，土壤改良剂
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一种油菜假单胞杆菌Y1及其培养方法和应用，土壤改良剂。
背景技术
我国沙漠化国土面积172.12万km2(2014年)，占国土面积的17.93％，荒漠化面积261.16万km2，占国土面积的27.25％。这些土地是重要的可开发的耕地资源，若能利用起来，不仅缓解我国耕地资源的紧张，而且能充分使各种废弃物资源化，做到资源的循环利用，这也将对我国西北干旱区修复脆弱的生态环境起到关键性作用。如何将其转化为耕地，就需要对这些有障碍的土地进行改良，土壤改良技术还需要改良物质的配合，这类物质称为土壤改良剂(soil amengment)。土壤改良剂又称土壤调理剂(soilcondition)，主要用于改良土壤的物理、化学和生物性质，使其更适宜于植物生长。
有益微生物制剂类土壤改良剂能促进土壤有机养分的分解和作物养分的吸收，促进团粒结构的形成，促进土壤酶活性的提高，最终达到改良土壤结构，增加土壤有机质含量，促进土壤养分释放和提高肥料利用率，促进耕地可持续利用，达到产量增加、成本降低、持续发展的目的。有益微生物制剂类土壤改良剂也取得了一些研究成果，例如：授权公告号CN 102391876B 公开了由：经过筛选和诱变处理获得的高效菌株拟康氏木霉及枯草芽孢杆菌发酵液、水溶性甲壳素、黄腐酸钾、腐熟有机质制成无公害绿色高效土壤改良剂，用于打破土壤板结，降低土壤容重。申请公布号为CN 102505010 A 公开了一种木霉菌多功能土壤改良剂，含哈茨木霉、稻壳、硅藻土和麸皮组分。主要用于改良蔬菜种植土壤初生和次生盐渍化、降解有机磷农药残留。申请公布号CN 107828422A公开了由含杆菌、木霉菌、光合细菌、乳酸菌及酵母菌组成的复合微生物干粉、沸石粉、泥碳粉制成的一种土壤改良剂，用于解决土壤板结、酸化、盐渍化。申请公布号CN 108383661A公开了由煤矸石、生物炭、尿素、硫酸铵、磷矿粉、生石灰、含芽孢杆菌、根瘤菌、固氮菌、纤维素分解菌和光合菌中的一种或多种组成的复合微生物菌剂制成的一种土壤改良剂，用于改善土壤通透性。
虽然，经过多年的研究与应用，市面上有不少土壤改良剂产品，但其应用还存在一定的问题：1)天然改良剂效果一般，施加量较大且易失效，后期需要补加；部分天然改良剂还会对土壤产生重金属毒害或污染等环境问题；2)人工合成改良剂使用成本较高，且目前多关注于改良剂对沙土的即时效果，而对于改良剂对土壤及植物是否存在副作用没有深入研究；3)不同土壤改良剂复配使用可能会达到比单独施加累加更好的效果，但不同改良剂的组合方式及比例还有待研究。
发明内容
有鉴于此，针对现有土地状况，本发明提供一种油菜假单胞杆菌Y1及其应用，以及用于制备土壤改良剂。
本发明第一方面提供了一种油菜假单胞杆菌Y1，所述油菜假单胞菌Y1 分类命名为油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.20127。
保藏编号为CGMCC No.20127的油菜假单胞杆菌Y1从新疆伊犁哈萨克自治州特克斯县野胡桃树下筛选培育出。
进一步，本发明中油菜假单胞菌Y1的具体特征如下：
菌体形态特征：细胞大小约为0.7×0.5μm，菌体呈杆状，革兰氏染色阴性，菌落形态特征为圆形、边缘光滑、表面湿润、颜色为浅黄色。胞外多糖比较多，能在温度0～40℃和pH5.0～9.0下生长，最适温度为28℃，最适pH为7.0。其生长过程中产酸、产气。
生理生化特性：油菜假单胞菌Y1能够水解纤维素，明胶和柠檬酸盐，其具有氧化酶和过氧化氢酶和脲酶活性，能够还原硝酸盐，能利用葡萄糖产生丙酮。具有较强的解磷解硅解钾、固氮和产IAA，它还能产铁载体ACC 脱氨酶。能够同时拮抗植物病原菌马铃薯晚疫病病原菌(Phytophthora infestans)、白粉病病原菌(Blumeria graminisf.sp.tritici,Bgt)和向日葵菌核病病原菌(Sclerotinia sclerotiorum)，能够显著促进小麦、油菜和马铃薯等植物的生长。可以对土壤中有害物质进行氧化无害化，并可以改善土壤结构，降低土壤盐碱度，培肥土壤。
上述油菜假单胞杆菌Y1的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将油菜假单胞杆菌Y1接种至斜面培养基，在温度25-30℃活化培养10-16小时，制得活化菌株；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于一级种子培养基中，在温度 25-30℃、转速160-240r/min条件下培养10-16小时，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液接种于二级种子培养基中，接种量8-12％ (体积百分比)，在温度25-30℃、转速120-180r/min条件下培养32-40小时，获得油菜假单胞杆菌Y1。
进一步，所述斜面培养基组份如下：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、 NaCl 1％、琼脂2％、pH 7.0。
进一步，所述一级种子培养基组分：淀粉0.05％、葡萄糖0.05％、酵母提取物0.05％、蛋白胨0.05％、(NH4)2SO40.05％、K2HPO40.03％、MgSO4·7H2O 0.005％、pH 7.0。
进一步，所述二级种子培养基组分：糖蜜1％，酵母提取物0.5％， (NH4)2SO40.5％，K2HPO40.3％，MgSO4·7H2O 0.05％，pH 7.0。
本发明第二方面提供了所述油菜假单胞杆菌Y1，或所述的培养方法获得的油菜假单胞杆菌Y1在土壤改良中的应用。
本发明第三方面提供了一种土壤改改良剂，包含权利要求1或2所述油菜假单胞杆菌Y1。
本发明中对于土壤改改良剂针对的土壤类型和具体施用方法不作具体限定，可根据需要选用所述的油菜假单胞杆菌Y1，选择性的添加或不添加其他组分。
进一步优选所述土壤改良剂中，油菜假单胞杆菌Y1(Pseudomonasbrassicacearum Y1)的有效活菌数≥2.0×108cfu/g。
本发明将天然改良剂与自己发现培养的有益微生物菌复配，研发出一种新型土壤改良剂，经应用验证，效果良好，特别是对于我国广大沙土地区，效果更好。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述土壤改改良剂还包括如下组分：煤泥、煤矸石、麸皮、哈茨木霉菌T-22。
进一步优选，所述土壤改良剂按重量份计，包括如下组分：煤泥5.5-7.5 份、煤矸石1.8-3.0份、麸皮0.5-1.5份、油菜假单胞杆菌Y1为0.05-1.0份、木霉菌0.05-1.0份。
进一步，所述土壤改良剂按重量份计，包括如下组分：煤泥6.0-7.0份、煤矸石2.0-2.8份、麸皮0.8-1.2份、油菜假单胞杆菌Y1为0.08-0.5份、哈茨木霉菌T-220.08-0.5份。
煤泥泛指煤粉含水形成的半固体物，是煤炭生产过程中的一种产品。煤泥具有如下特点：1)粒度细、微粒含量多，尤其是小于200目(75微米)的微粒约占70％～90％。2)持水性强，水分含量高。经圆盘真空过滤机脱水的煤泥含水一般在30％以上；折带式过滤机脱水的煤泥含水在26％～29％；压滤机脱水的煤泥含水在20％～24％。3)灰分含量高，发热量较低。按灰分及热值的高低可以把煤泥分成三类：低灰煤泥灰分为20％～32％，热值为 12.5～20MJ/kg；中灰煤泥灰分为30％～55％，热值为8.4～12.5MJ/kg；高灰煤泥灰分>55％，热值为3.5～6.3MJ/kg。4)黏性较大。由于煤泥中一般含有较多的黏土类矿物，加之水分含量较高，粒度组成细，所以大多数煤泥黏性大。煤泥的这些特性，正适合沙土的改良。
煤矸石是在成煤过程中与煤共同沉积的有机化合物和无机化合物混合在一起的岩石，含碳20％～30％，有些含腐殖酸，其化学成分组成的百分率： SiO2为52～65；Al2O3为16～36；Fe2O3为2.28～14.63；CaO为0.42～2.32； MgO为0.44～2.41；TiO2为0.90～4；P2O5为0.007～0.24；K2O+Na2O为1.45～ 3.9；V2O5为0.008～0.03。煤矸石中SiO2、Fe2O3、Al2O3的总含量在80％以上，它是一种天然的粘土质原料，是一种适合用作沙土改良的物料。
麦麸的具体特征如下：每100克小麦麸含：能量220千卡，蛋白质15.8 克，脂肪4克，碳水化合物61.4克，膳食纤维31.3克，维生素A20微克，胡萝卜素120微克，硫胺素0.3毫克，核黄素0.3毫克，烟酸12.5毫克，维生素E4.47毫克，钙206毫克，磷682毫克，钾862毫克，钠12.2毫克，镁 382毫克，铁9.9毫克，锌5.98毫克，硒7.12微克，铜2.03毫克，锰10.85 毫克。可见麦麸营养丰富且全面，使微生物菌的绝佳食料。
木霉菌是广泛存在于自然界中的一种微生物，哈茨木霉菌是木霉菌中应用的一个菌种，哈茨木霉菌T-22株系是人工修饰的株系，可以在沙壤土和粘性土壤中良好的定植繁殖，可以用来预防由腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌、黑根霉、柱孢霉、核盘菌、齐整小核菌等病原菌引起的植物病害。其作用机制表现为：1)竞争作用：哈茨木霉菌T-22在植物的根围、叶围可以迅速生长，抢占植物体表面的位点，形成一个保护罩，阻止病原真菌接触到植物根系及叶片表面，以此来保护植物根部、叶部免受上述病原菌的侵染，并保证植株能够健康地成长。2)重寄生作用：在木霉与病原菌互作的过程中，寄主菌丝分泌一些物质，被木霉寄生物所识别，使木霉趋向寄主真菌生长，建立寄生关系，木霉菌丝沿寄主菌丝平行生长和螺旋状缠绕生长，并产生附着胞状分枝吸附于寄主菌丝上，通过分泌胞外酶溶解细胞壁，穿透寄主菌丝，吸取营养，进而将病原菌杀死。3)抗生素作用：哈茨木霉菌可以分泌一部分抗生素，可以抑制病原菌的生长定植，减轻病原菌的危害。4)植物生长调节作用：木霉菌在植物根系定殖并且产生刺激植物生长和诱导植物防御反应的化合物，改善根系的微环境，增强植物的长势和抗病能力。5)诱导植物抗性、启动植物的防御反应：T-22可以代谢产生木聚糖酶，植物在木聚糖酶作用下，具有明显的防御反应，K+、H+、Ca2+离子通道打开，合成乙烯以及积累PR蛋白等。T-22产生几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶在抗植物病原真菌中发挥重要作用。可以启动植物的防御反应，导致植物产生和积累与抗病性有关的酚类化合物和木质素等。同时T-22产生的蛋白酶能使消解植物细胞壁的病原菌降解，直接抑制病原菌萌发，使病原菌的酶钝化，阻止病原菌侵入植物细胞。
所述土壤改良剂中添加了煤泥、煤矸石为主的矿物质，为作物提供了一定的微最元素营养，可缓解土壤中微量元素不足的情况，可单独用于土壤中，也可广泛用于各种肥料的混配
在本发明一种优选地实施方式中，所述土壤改良剂按重量份计，包括如下组分：所述土壤改良剂按重量份计，包括如下组分：煤泥为6.4份，煤矸石为2.2份，麸皮为1份，油菜假单胞杆菌Y1为0.2份；哈茨木霉菌T-220.2 份。
优选地，所述土壤改良剂有效活菌数≥2.0×108cfu/g，优选大于 4.0×108cfu/g；优选所述油菜假单胞杆菌Y1与木霉菌菌体数之比为1:1-1.2，优选1:1。
上述土壤改良剂能促进土壤中有效磷、硅、钾等营养元素的增加，促使作物营养均衡吸收，产铁载体ACC脱氨酶可阻止乙烯的大量产生，从而延缓植株衰老，对作物生长具有显著促进作用；还具有的氧化酶和过氧化氢酶活性，可以对土壤中有害物质进行氧化而达到无害化，并可以改善土壤结构，降低土壤盐碱度，培肥土壤，
本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
1、本发明提供的油菜假单胞杆菌Y1具有较强的解磷解硅解钾、固氮和产IAA及耐盐碱的能力，还能产铁载体ACC脱氨酶，以及具有氧化酶和过氧化氢酶活性、弱硝酸还原酶活性；并且对一些植物病原菌有一定的拮抗作用；
2、本发明提供的土壤改良剂，通过将所述油菜假单胞杆菌Y1与木霉菌及其它组分复配获得，其中的油菜假单胞杆菌Y1与木霉菌协同作用，提高了油菜假单胞杆菌Y1的快速繁殖，增加了盐碱土壤中油菜假单胞杆菌Y1 的数量，并且促进了难溶性磷酸盐、硅酸盐的溶解；与煤泥、麸皮作用后，可有效降低土壤的pH，有利于油菜假单胞杆菌Y1的耐盐碱耐高温作用机制；
3、本发明提供的土壤改良剂可以肥料一同施用，每亩用量15～300千克，可达到沙土改良成沙壤土的目的，并能有效地解除盐碱地的盐碱危害；通过试验表明对我国沙漠土壤具有明显改良作用；
4、本发明所述的油菜假单胞杆菌Y1及其在制备土壤改良剂用于沙土改良上能提高土壤保水性能，减低土壤pH值和电导率，增加土壤有机质含量，增加土壤团聚体数量，改善土壤结构，以及土壤容重、田间持水量、孔隙度等物理性状，提高作物出苗率，增加作物产量和品质，增加土壤对肥料的吸附作用，提高肥料抗淋溶能力，增加土壤中微生物菌群和数量。
保藏说明
油菜假单胞杆菌Y1(Pseudomonas brassicacearum Y1)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC No.20127，保藏日期：2020年6月22日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1所示为实施例2中油菜假单胞杆菌Y1对马铃薯晚疫病病原菌 (Phytophthorainfestans)的抑制试验结果图。其中，左侧图为处理的菌落半径 RB1＝10.7mm，右侧图为对照的菌落半径Rck1＝45mm。
图2所示为实施例2中油菜假单胞杆菌Y1对亚麻枯萎病病原菌 (Fusariumoxysporum)的抑制试验结果图。其中，左侧图为处理的菌落半径 RB1＝25.3mm，右侧图为对照的菌落半径Rck1＝37.5mm。
图3所示为实施例2中油菜假单胞杆菌Y1对向日葵菌核病病原菌 (Sclerotiniasclerotiorum)的抑制试验结果图。其中，左侧图为处理菌落半径 RB1＝34.6mm，右侧图为对照半径Rck1＝45mm。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
实施例1筛选获得油菜假单胞杆菌Y1
油菜假单胞杆菌Y1的筛选过程如下：
(1)从新疆伊犁哈萨克自治州特克斯县野胡桃树下取回土样，按油菜假单胞杆菌Y1的筛选培养基和条件，筛选油菜假单胞杆菌Y1，并分离纯化，最终获得纯菌株；
筛选培养基为Ashby培养基，组分如下：葡萄糖1％，KH2PO4 0.02％， CaCO30.5％，MgSO4·7H2O 0.02％，NaCl 0.02％，CaSO4·2H2O 0.01％，琼脂2％， pH 7.0
筛选条件：温度28℃培养7天；通过显微镜观察判断是否为纯菌株，采用平板划线法获得纯种；
(2)制备油菜假单胞杆菌Y1菌株的悬浮液
挑取该菌株的单菌落接入简单培养基，组分如下：LB培养基：胰蛋白胨 1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，琼脂2％，pH 7.0。
培养条件：在温度28℃、转速210r/min的条件下恒温摇床上培养12小时，
取5ml培养菌液加到装有玻璃珠和45ml无菌水三角瓶，200r/min震荡培养30min，制成菌悬液；用无菌水稀释至10-4备用
(3)诱变及强解磷硅钾菌株的选育
将步骤(2)制备的菌悬浮液加入到平板中，菌液厚度为0.2cm；20W紫外灯 30cm高处照射3min；
诱变结束后，立即将该菌液涂布在含有SiO2的固体培养基上，培养基组分如下：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl1％，琼脂2％，pH7.0。
培养条件：28℃恒温培养箱中避光培养6d。
选择经紫外线诱变后的菌株，经解磷钾硅活性测定、遗传稳定性检测等，选出一株具有解磷解硅解钾、固氮和产IAA及产铁载体ACC脱氨酶效率高的菌株，命名为油菜假单胞杆菌Y1(Pseudomonas brassicacearum Y1)，菌种保藏编号为：CGMCC No.20127。
(4)菌株特性的测定。(根据前面所定工艺再定测定事项：土壤结构改善、解磷硅钾能力、固氮能力、产IAA、耐盐碱的能力、产铁载体ACC脱氨酶，以及具有氧化酶和过氧化氢酶活性、弱硝酸还原酶活性。
生理生化特征
用API20E生化鉴定试剂盒检测菌株生理生化特征。
结果：氧化酶、过氧化氢酶、精氨酸双水解酶、吲哚实验、脲酶、柠檬酸盐为阳性。
明胶水解、V-P test、七叶灵水解为阴性。
pH耐受性
将供试菌株接种于已灭菌的LB液体培养基中，28℃、160rpm震荡培养 24h采用点接种法，用灭菌的枪头吸取5μL菌液，将各菌株分别接种在pH为 1.0-11.0的LB平板上，每个平板点接3次，每个菌3个平行，于28℃下培养，定期观察并记录生长情况，结果见表1。
表1 pH耐受性实验观察记录
时间 pH 1.0 pH 2.0 pH 3.0 pH 4.0 pH 5.0 pH 6.0 pH 7.0 pH 8.0 pH 9.0 pH 10.0 pH 11.0
12h 无菌落 无菌落 无菌落 无菌落 无菌落 无菌落 有菌落 无菌落 无菌落 无菌落 无菌落
24h 无菌落 无菌落 无菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 无菌落
36h 无菌落 无菌落 无菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 无菌落
48h 无菌落 无菌落 无菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 无菌落
60h 无菌落 无菌落 无菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 无菌落
72h 无菌落 无菌落 无菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 无菌落
表1的结果显示：pH耐受性为pH(4.0-10.0)
盐度耐受性
将供试菌株接种于已灭菌的LB液体培养基中，28℃、160rpm震荡培养24h采用点接种法，用灭菌的枪头吸取5μL菌液，将各菌株分别接种在氯化钠浓度为1％-10％的LB平板上，每个平板点接3次，每个菌3个平行，于28℃下培养，定期观察并记录生长情况，结果见表2。
表2盐度耐受性观察记录
Figure RE-GDA0003353030500000101
Figure RE-GDA0003353030500000111
表2的结果显示：盐度耐受性为盐度(NaCl 0-5％)
温度耐受性
将供试菌株接种于已灭菌的LB液体培养基中，28℃、160rpm震荡培养 24h采用点接种法，用灭菌的枪头吸取5μL菌液，将各菌株接种在LB平板上，每个平板点接3次，每个菌3个平行，分别于4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、 30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃下培养，定期观察并记录生长情况，结果见表3。
表3温度耐受性观察记录
时间 4℃ 10℃ 15℃ 20℃ 25℃ 30℃ 35℃ 37℃ 40℃ 45℃ 50℃
12h 无菌落 无菌落 无菌落 无菌落 有菌落 有菌落 无菌落 无菌落 无菌落 无菌落 无菌落
24h 无菌落 无菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 无菌落 无菌落 无菌落 无菌落
36h 无菌落 无菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 无菌落 无菌落 无菌落 无菌落
48h 无菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 无菌落 无菌落 无菌落
60h 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 无菌落 无菌落 无菌落
72h 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 有菌落 无菌落 无菌落 无菌落
表3的结果显示：温度耐受性为温度(4-37℃)
固氮特性：
用乙炔还原法测定所分离的细菌进行固氮酶活性。
将单菌落接种于体积为10mL装有4.5mL液体的Ashby培养基的青霉素小瓶中。在30℃、120rpm摇床培养24小时后，在无菌条件下(超净工作台中) 将棉塞换成橡胶塞子，并注入10％的高纯乙炔。继续在同等条件下的摇床上培养24小时后，用气相色谱仪测定乙炔的生成量，并以nmolC2H4/H.culture表示固氮酶活性的大小。乙稀标样做三个对照，测三组平行数据，求其平均值。用下列公式计算ARA的大小。
ARA(nmolC2H4/H.culture)＝Vst*Cst*Asa*Vtu/Vsa/Ast/H/22.4*106
其中Vst为标准乙烯进样体积，Cst为标准乙烯浓度，Asa为乙烯峰面积， Vtu为西林瓶体积，Vsa表示样品进样体积，Ast表示标准乙稀峰面积，H表示培养时间。
H＝24h，Vst＝10μL，Cst＝0.792mol/L，Vtu＝10mL，Vsa＝10μL，Ast＝1.568
结果：测得乙稀峰面积分别为：Asa1＝102.546，Asa2＝104.137， Asa3＝103.451。
根据ARA(nmolC2H4/H.culture)＝10μL*0.792mol/L*Asa/10μL/1.568/24/22.4*106
求得固氮酶活性＝(2390.79±0.79)nmolC2H4/H.cultur。
因此菌株有固氮能力。
溶无机磷能力
将纯化获得的典型菌落在改良的PVK(葡萄糖10g/L，NaCl 0.2g/L， MgSO4·7H2O0.1g/L，KCl 0.2g/L，(NH4)2SO40.5 g/L，Ca3(PO4)25.0g/L，pH自然)平板上进行划线，倒置于培养箱培养3d，观察菌落生长情况。待培养皿中的菌落都长出后，挑选出能使划线部分变蓝的菌落。利用钼锑抗比色法对菌株溶稱能力进行测定，将菌株接种在LB液体培养基中，然后将其放入28℃摇床中振荡培养过夜。离心收集菌体.制成适当浓度的悬浮液，取5mL菌悬液接种于灭菌的50mLNBRIP(葡萄糖10g/L，MgCl2·6H2O，5.0g/L，MgSO4·H2O 0.25 g/L，KCl0.2g/L，(NH4)2SO40.1 g/L，Ca3(PO4)25.0g/L，pH7.0)培养基中，以接入等体积的无菌水为对照(CK)，30℃，170rpm的摇床培养7d。然后在10000 rpm条件下离心10min。并测其上清液的pH值。取上清液1.25mL于比色管中，再加入2.5mL钼锑抗比色剂，用去离子水定容至刻度，将其摇匀，静置30min。于730nm波长下比色，记录数据，计算菌液含磷量。
结果：
标准曲线Y＝7.808X+62.043R2＝0.9982；Y为含磷量，X为OD 730。
测得OD 730a＝0.654，OD 730b＝0.598，OD 730c＝0.697。
带入标准曲线，在NBRIP液体培养基培养7d，菌液中水溶性磷含量为 (67.12±0.39)μg/mL菌液。
产铁载体能力的测定
挑取单菌落，用灭菌的牙签将菌种点接在CAS蓝色固体检测平板上，一个平板4个点，一个菌3个重复，在28℃培养96h。能分泌铁载体的细菌菌落在 CAS蓝色检测平板上其菌落周围会出现明显的橙色晕圈。记录平板上橙色晕圈的大小及有无，并且测定菌株的产铁载体圈分别为D，再测定菌落直径d，通过计算出铁载体光圈直径与菌落直径的比值＝D/d。
结果：
测得橙色晕圈直径DO1＝8.5mm，菌落直径dB1＝3.5mm。
DO2＝7.5mm，dB2＝3.0mm。
DO3＝6.0mm，dB3＝2.5mm。
因此铁载体能力(橙色晕圈直径与菌落直径比值D/d为2.44±0.05。
ACC脱氨酶活性的定性分析
挑取单菌落接种到8mL LB培养液中，于28℃、160r/min下培养12h；之后取0.2mL培养液转接入8mL DF培养基，于相同条件下再培养24h；然后再取0.2mL培养液转接入8mLADF培养液，并以不含ACC、调整后的ADF培养基作为阴性对照，培养24-48h，测定OD 600处吸光值。每个处理3个重复。
结果：
测得OD 600a＝0.503，D600b＝0.614，OD600c＝0.525。
对应的对照OD 600a＝0.193，D600b＝0.217，OD600c＝0.205。
其吸光值大于对照，因此具有ACC脱氨酶活性
分泌IAA能力的测定
将种子内分离的不同种属菌株接种于50mL液体LB培养基的三角瓶中，每一菌株3个重复。将三角瓶置于28℃摇床，转速为1680r/min，培养4d，然后用分光光度法测定菌悬液的OD 600值，然后将菌悬液10000rpm离心10min，取上清液加入等体积Salkowski比色液，避光静置30min，采用分光光度法测定其OD 530值。计算菌浓度OD 600值为1时，单位体积菌悬液中细菌分泌IAA 的量。标准曲线的绘制采用分析纯的IAA梯度稀释制备。
结果：OD 530a＝0.203，D 530b＝0.214，OD 530c＝0.225，
Y＝6.563X+7.526，菌液中最高IAA浓度可达(8.93±0.007)mg/L。
产NH3鉴定
将菌株转接到含10mL蛋白胨水(10g/L)试管中，28℃培养48-72h，每管加入0.5mLNessler’s试剂。观察颜色变化，结果显示：颜色由褐色转为黄色的表明有NH3产生。
产HCN鉴定
在LB培养基中添加4.4g/L甘氨酸，将细菌划线接种于该平板上，另将浸过2％碳酸钠、0.5％苦味酸溶液(2，4，6-三硝基苯酚)whatman 1号滤纸置于培养基上，密封，28℃培养4d。
结果：滤纸颜色由橘黄色转为红色的说明有HCN产生。
实施例2油菜假单胞杆菌Y1抑制病原真菌的测定
采用两点对峙法：在黑麦蔗糖培养基或PDA培养基平板上距离中心2cm 的两点上分别接种病原真菌和所分离促生菌[在黑麦培养基上接种致病疫霉 (Phytophthorainfestans)；在PDA培养基上分别接种尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)]。每个处理3次重复，以只接病原真菌不接所分离促生菌的平板为对照。18℃(致病疫霉)或25℃(尖孢镰刀菌、核盘菌)暗培养，7d后观察其抑菌效果并计算抑菌率。抑菌率(％)＝(对照菌落半径- 处理菌落半径)/对照菌落半径×100。
结果：如图1所示，马铃薯晚疫病病原菌(Phytophthora infestans)的抑制试验中，对照半径Rck1＝45mm，处理菌落半径RB1＝10.7mm；Rck2＝45mm， RB2＝12.3mm；Rck3＝45mm，RB3＝9.2mm。抑制马铃薯晚疫病病原菌 (Phytophthora infestans)的抑菌率为(76.13±3.40)％。
如图2所示，亚麻枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum)的抑制试验中，对照半径Rck1＝37.5mm，处理菌落半径RB1＝25.3mm；Rck2＝42.4mm，RB2＝28.8mm， Rck3＝35.0mm，RB3＝24.0mm。抑制亚麻枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum)的抑菌率为(32.00±0.56)％。
如图3所示，向日葵菌核病病原菌(Sclerotinia sclerotiorum)的抑制试验中，对照半径Rck1＝45mm，处理菌落半径RB1＝34.6mm；Rck2＝43.7mm， RB2＝34.2mm；Rck3＝41.9mm，RB3＝32.8mm。抑制向日葵菌核病病原菌 (Sclerotinia sclerotiorum)的抑菌率为(22.19±0.80)％。
上述结果证明了油菜假单胞杆菌Y1对一些植物病原的拮抗作用。
实施例3
油菜假单胞杆菌Y1(Pseudomonas brassicacearum Y1)的培养方法，包括如下步骤：
(1)取油菜假单胞杆菌Y1接种至斜面培养基，在温度25～30℃活化培养10～16小时，制得活化菌株。
所述斜面培养基组份如下：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，琼脂2％，pH 7.0。
(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于一级种子培养基中，在温度25～ 30℃、转速160～240r/min的条件下培养10～16小时，制得种子液；
一级种子培养基：淀淀粉0.05％、葡萄糖0.05％、酵母提取物0.05％、蛋白胨0.05％、(NH4)2SO40.05％、K2HPO40.03％、MgSO4·7H2O 0.005％、 pH 7.0。
(3)将步骤(2)制得的种子液接种于二级种子培养基中，接种量8～ 12％(体积百分比)，在温度25～30℃、转速120～180r/min的条件下培养32～40小时，获得油菜假单胞杆菌Y1；
二级种子培养基：糖蜜1％，酵母提取物0.5％，(NH4)2SO40.5％，K2HPO4 0.3％，MgSO4·7H2O 0.05％，pH 7.0。
实施例4
一种土壤改良剂，按重量份计包括如下组分：煤泥5.5份，煤矸石3份，麸皮0.5份，油菜假单胞杆菌Y1为1份，木霉菌0.05份。经检测，该土壤改良剂的有效活菌数≥2.0×108cfu/g。
实施例5
一种土壤改良剂，按重量份计包括如下组分：煤泥7.5份，煤矸石1.8 份，麸皮1.5份，油菜假单胞杆菌Y1为0.05份，木霉菌1份。经检测，该土壤改良剂的有效活菌数≥2.0×108cfu/g。
实施例6
一种土壤改良剂，按重量份计包括如下组分：煤泥6份，煤矸石2.5份，麸皮1份，油菜假单胞杆菌Y1为0.3份，木霉菌0.3份。经检测，该土壤改良剂的有效活菌数≥2.0×108cfu/g。
实施例7
一种土壤改良剂，按重量份计包括如下组分：煤泥为6.4份，煤矸石为 2.2份，麸皮为1份，油菜假单胞杆菌Y1为0.2份；木霉菌为0.2份。经检测，该土壤改良剂的有效活菌数≥2.0×108cfu/g。
对比例1
一种土壤改良剂，与实施例7所述的不同之处在于，将油菜假单胞杆菌 Y1替换为等重量的油菜假单胞杆菌X1发酵液(油菜假单胞杆菌X1购自北纳生物，货号BNCC174720)。
对比例2
一种土壤改良剂，与实施例7所述的不同之处在于，将油菜假单胞杆菌 Y1替换为油菜假单胞杆菌X1和油菜假单胞杆菌Y1等体积混合的发酵液。
对比例3
一种土壤改良剂，与实施例7所述的不同之处在于，将0.2份的木霉菌替换为0.05份木霉菌和0.15份水的混合液。
对比例4
一种土壤改良剂，与实施例7所述的不同之处在于，将油菜假单胞杆菌 Y1替换为等质量的水。
实验例
取实施例4-7、对比例1-4所得的土壤改良剂用于内蒙沙土的改良。
供试品种为向日葵HL8193，为包衣种子。试验在内蒙准格尔旗十二连城乡五家尧村靠近黄河河滩盐碱地，选取100亩条件相同的紧邻地块作为试验地，该地块没有种植过向日葵，前茬作物为玉米。
具体步骤如下：
在其它条件相同的情况下，分别用实施例4-7、对比例1-4所得的土壤改良剂作为8个处理设置试验小区，3次重复，随机排列，每个小区面积3.3 亩(含保护行)。
在5月底翻地，晾晒20天，在各小区施入对应改良剂，施入量为80公斤/亩，同时施入25公斤/亩的有机无机复合肥(N:P:K＝15-10-15)，然后旋耕一遍。
旋耕后起垄，垄宽120厘米，垄高25厘米，双行种植，人工点播覆土， 1粒/穴，株距30厘米。
田间管理：因当年降雨适中，没有灌溉，中耕追肥(N:P:K＝18-5-27)8公斤/亩，同时锄草。试验数据如表4所示：
表4土壤改良剂大田试验效果
Figure RE-GDA0003353030500000171
由表4的结果可知，与不施用土壤改良剂的试验相比，本发明的土壤改良剂对向日葵的增产效果显著，具有明显的固氮、解磷、解钾、解硅效果，也能降低土壤的含盐量盒碱化度，对土壤的团粒结构的形成也有帮助。试验结果表明，本发明的土壤改良剂对沙土地的改良效果显著。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种油菜假单胞杆菌Y1，其特征在于，所述油菜假单胞菌Y1分类命名为油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.20127。
2.根据权利要求1所述的油菜假单胞杆菌Y1，其特征在于，所述油菜假单胞菌Y1大小为0.7×0.5μm，菌体呈杆状，革兰氏染色阴性，菌落形态特征为圆形、边缘光滑、表面湿润、颜色为浅黄色。
3.权利要求1或2所述油菜假单胞杆菌Y1的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将油菜假单胞杆菌Y1接种至斜面培养基，在温度25-30℃活化培养10-16小时，制得活化菌株；
（2）将步骤（1）制得的活化菌株接种于一级种子培养基中，在温度25-30℃、转速160-240r/min条件下培养10-16小时，制得种子液；
（3）将步骤（2）制得的种子液接种于二级种子培养基中，接种量8-12 %（体积百分比），在温度25-30℃、转速120-180r/min条件下培养32-40小时，获得油菜假单胞杆菌Y1。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述斜面培养基组份如下：胰蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、NaCl 1%、琼脂2%、pH 7.0；
优选地，所述一级种子培养基组分：淀粉0.05%、葡萄糖0.05%、酵母提取物0.05%、蛋白胨0.05%、(NH4)2SO4 0.05%、K2HPO4 0.03%、MgSO4·7H2O 0.005%、pH 7.0；
优选地，所述二级种子培养基组分：糖蜜1%，酵母提取物0.5%，(NH4)2SO4 0.5%，K2HPO4 0. 3%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 7.0。
5.权利要求1或2所述油菜假单胞杆菌Y1，或权利要求3或4的培养方法获得的油菜假单胞杆菌Y1在土壤改良中的应用。
6.一种土壤改改良剂，其特征在于，包含权利要求1或2所述油菜假单胞杆菌Y1。
7.根据权利要求6所述的土壤改良剂，其特征在于，还包括如下组分：煤泥、煤矸石、麸皮、哈茨木霉菌T-22。
8.根据权利要求7所述的土壤改良剂，其特征在于，所述土壤改良剂按重量份计，包括如下组分：煤泥5.5-7.5份、煤矸石1.8-3.0份、麸皮0.5-1.5份、油菜假单胞杆菌Y1为0.05-1.0份、木霉菌0.05-1.0份。
9.根据权利要求8所述的土壤改良剂，其特征在于，所述土壤改良剂按重量份计，包括如下组分：煤泥6.0-7.0份、煤矸石2.0-2.8份、麸皮0.8-1.2份、油菜假单胞杆菌Y1为0.08-0.5份、哈茨木霉菌T-22 0.08-0.5份；
优选地，所述土壤改良剂按重量份计，包括如下组分：煤泥为6.4份，煤矸石为2.2份，麸皮为1份，油菜假单胞杆菌Y1为0.2份；哈茨木霉菌T-22 0.2份。
10.根据权利要求8或9所述的土壤改良剂，其特征在于，所述土壤改良剂有效活菌数≥2.0×108cfu/g；
优选地，所述油菜假单胞杆菌Y1与木霉菌菌体数之比为1:1-1.2，优选1:1。
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