CN113816990A - 修饰的氨基酸及其在adc中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及修饰的氨基酸及其在ADC中的应用。本发明的修饰的氨基酸为R1‑L1‑N(R2)‑R3所示的磷酰胆碱基团修饰的氨基酸，其中，R1、L1、N、R2和R3如文中所定义。本发明还提供含有所述修饰的氨基酸的肽。用这类修饰的氨基酸或修饰的肽制得的ADC具有明显提高的溶解度。

Description

修饰的氨基酸及其在ADC中的应用
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及抗体药物偶联物(ADC)，更具体涉及修饰的氨基酸及其在ADC中的应用。
背景技术
抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate，ADC)是通过一个化学链接将具有生物活性的小分子药物连接到单抗上，单抗作为载体将小分子药物靶向运输到目标细胞中。
ADC药物结构较为复杂，且不同ADC药物设计之间存在较大的差异。即使同一靶点的不同药物，由于识别位点、连接位点、连接子及所连接小分子的不同，其毒性的差异显而易见。
发明内容
本文第一方面提供下式I所示的磷酰胆碱基团修饰的氨基酸：
R1-L1-N(R2)-R3 (I)
式I中：
R1为磷酰胆碱基团；
N代表氨基酸分子上的氮原子；
R2为H、C1-C4烷基或-L1-磷酰胆碱基团；
各L1独立为连接基团；
R3代表氨基酸分子上除所示N原子外的其余部分，所述其余部分任选地被保护基团保护。
本文第二方面提供一种磷酰胆碱修饰的肽，所述肽至少包括一个磷酰胆碱基团，所述磷酰胆碱基团与所述肽所含的1个或多个氨基酸的N原子和/或氧原子经由连接基团共价连接。
本发明第三方面提供具有下式II所示结构的连接子化合物：
R4-L2-P-R5 (II)
式中：
R4为可与蛋白中的半胱氨酸残基中的巯基或赖氨酸残基上的游离氨基发生反应、从而将式II连接到蛋白的基团；
L2为连接基团；
P为权利要求1-3中任一项所述的氨基酸或权利要求4-8中任一项所述的肽；所述氨基酸或肽与L2和R5共价连接；
R5为：
Figure BDA0002987342630000021
其中，R6为H、卤素、C1-10烷基、C3-C8环烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C3-C8环烯基、6-14元芳基、芳烷基、5-10元杂芳基或4-10元杂环基；R9为H、-C(O)-N(R7)-(CH2)n-NHR8或硝基取代的苯氧基羰基；R7为H或C1-6烷基；R8为H或C1-6烷基；和n为1-6的整数。
本文第四方面提供下式III所示的与本发明任一实施方案所述的连接子化合物共价连接的药物：
R4-L2-P-R5-D (III)
式中：R4、L2、P和R5如本文任一实施方案所述；D表示药物分子去除了一个H原子后获得的基团，与R5共价连接；优选地，药物分子通过与R5形成碳酸酯键(-OCO-)或氨基甲酸酯(-OCNH-)而与R5相连。
本文第五方面提供一种ADC，其结构式如下式IV所示：
A-R4-L2-P-R5-D (IV)
式中，R4、L2、P和R5如本文任一实施方案所述，D如如本文任一实施方案所述，A为抗体或其抗原结合片段；其中，所述抗体或其抗原结合片段通过其所含有的巯基与R4共价连接。
本文第六方面还提供本文任一实施方案所述的氨基酸、肽、连接子化合物以及药物在制备ADC中的应用，或在改善抗体溶解性中的应用，或者在制备用于改善抗体溶解性的制剂中的应用。
本发明第七方面还提供一种组合物，其含有本文任一实施方案所述的氨基酸、肽、连接子化合物或与连接子化合物共价连接的药物。组合物中可含有其它合适的辅料，如溶剂等。
本文各方面的详细内容如下文所详述。
附图说明
图1：LA003的HIC-HPLC图。
图2：LA004的HIC-HPLC图。
图3：LA005的HIC-HPLC图。
图4：LA006的HIC-HPLC图。
图5：LA006的SEC-HPLC图。
图6：LA009的HIC-HPLC图。
图7：LA003、LA004、LA005和LA006的HIC-HPLC对比图。从图中可以得出以下结论：DAR值均为4的四个ADC，小分子部分带有两个磷脂酰胆碱的ADC的亲水性更强，烷基形式的磷脂酰胆碱的亲水性强于酰胺形式的磷脂酰胆碱。
图8：含磷酰胆碱修饰的HER2ADC对人SK-BR-3，HCC1954和MDA-MB-468乳腺癌细胞系的细胞毒活性。(A)Val-Lys二肽连接子内的Lys侧链进行含磷酰胆碱修饰；(B)对Gly/Ser-Val-Cit三肽连接子内的Gly或Ser进行直接修饰；(C)Lys的侧链，并直接连接到Ser-Val-Lys三肽连接子中的Ser，(D)Lys的侧链和/或在Val-Lys或Ser-Val-Lys连接子内直接与Ser连接。抗HER2ADC数据点代表至少三次重复的平均归一化细胞生存力±SEM。至少两个独立实验的结果。
图9：LA003、LA005和对照Her2-McVCPABMMAE的HIC图谱。a、b和c分别表示对照、LA003和LA005的HIC图谱。
具体实施方式
本发明旨在提供一种新的修饰的氨基酸或修饰的肽，用这类修饰的氨基酸或修饰的肽制得的ADC具有明显提高的溶解度，同时还保留了所需的生物学活性或药效。具体而言，本发明使用磷酰胆碱来修饰氨基酸，构建修饰的氨基酸或修饰的肽。
术语
除非另有定义，否则本文所有科技术语具有的涵义与权利要求主题所属领域技术人员通常理解的涵义相同。除非另有说明，本文全文引用的所有专利、专利申请、公开材料通过引用方式整体并入本文。
应理解，上述简述和下文的详述为示例性且仅用于解释，而不对本发明主题作任何限制。在本申请中，除非另有具体说明，否则使用单数时也包括复数。必须注意，除非文中另有清楚的说明，否则在本说明书和权利要求书中所用的单数形式包括所指事物的复数形式。还应注意，除非另有说明，否则所用“或”、“或者”表示“和/或”。此外，所用术语“包括”以及其它形式，例如“包含”、“含”和“含有”并非限制性，其可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”之义。
可在参考文献(包括Carey and Sundberg"ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 4THED."Vols.A(2000)and B(2001),Plenum Press,New York)中找到对标准化学术语的定义。除非另有说明，否则采用本领域技术范围内的常规方法，如质谱、NMR、IR和UV/VIS光谱法和药理学方法。除非提出具体定义，否则本文在分析化学、有机合成化学以及药物和药物化学的有关描述中采用的术语是本领域已知的。可在化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送，以及对患者的治疗中使用标准技术。例如，可利用厂商对试剂盒的使用说明，或者按照本领域公知的方式或本发明的说明来实施反应和进行纯化。通常可根据本说明书中引用和讨论的多个概要性和较具体的文献中的描述，按照本领域熟知的常规方法实施上述技术和方法。在本说明书中，可由本领域技术人员选择基团及其取代基以提供稳定的结构部分和化合物。
当通过从左向右书写的常规化学式描述取代基时，该取代基也同样包括从右向左书写结构式时所得到的在化学上等同的取代基。举例而言，-CH2O-等同于-OCH2-。
在本文中定义的某些化学基团前面通过简化符号来表示该基团中存在的碳原子总数。例如，C1-6烷基是指具有总共1至6个碳原子的如下文所定义的烷基。简化符号中的碳原子总数不包括可能存在于所述基团的取代基中的碳。
除前述以外，当用于本申请的说明书及权利要求书中时，除非另外特别指明，否则以下术语具有如下所示的含义。
在本申请中，术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
“羟基”是指-OH基团。
“羟基烷基”是指被羟基(-OH)取代的如下文所定义的烷基。
“羰基”是指-C(＝O)-基团。
“硝基”是指-NO2。
“氰基”是指-CN。
“氨基”是指-NH2。
“羧基”是指-COOH。
在本申请中，作为基团或是其它基团的一部分，“烷基”指完全饱和的直链或支链的烃链基，仅由碳原子和氢原子组成、具有例如1至10个(优选为1至8个，更优选为1至6个)碳原子，且通过单键与分子的其余部分连接。烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、正己基、庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、辛基、壬基和癸基等。在一些实施方案中，烷基是C1-C4烷基。
在本申请中，作为基团或是其它基团的一部分，“烯基”指仅由碳原子和氢原子组成、含有至少一个双键、具有例如2至10个(优选为2至8个，更优选为2至6个，更优选2至4个)碳原子且通过单键与分子的其余部分连接的直链或支链的烃链基团。烯基包括但不限于乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基等。
在本申请中，作为基团或是其它基团的一部分，“炔基”指仅由碳原子和氢原子组成、含有至少一个三键、具有例如2至10个(优选为2至8个，更优选为2至6个，更优选2至4个)碳原子且通过单键与分子的其余部分连接的直链或支链的烃链基团。炔基包括但不限于乙炔基、丙炔基等。
在本申请中，作为基团或是其它基团的一部分，“环烷基”指仅由碳原子和氢原子组成的稳定的非芳香族单环烃基。环烷基的环碳原子数通常为3-8个。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
在本申请中，作为基团或是其它基团的一部分，“杂环基”指由2至14个碳原子(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个碳原子)以及1至6个选自氮、氧和硫的杂原子组成的稳定的5元至10元非芳香族环状基团。除非本说明书中另外特别指明，否则杂环基可以为单环或双环的环体系。杂环基可为部分或完全饱和。杂环基可以经由碳原子或者杂原子并通过单键与分子其余部分连接。杂环基的实例包括但不限于：氮杂环丁烷基、吡咯烷基、吗啉基、哌嗪基、高哌嗪基、哌啶基、硫代吗啉基、吡喃基、四氢吡喃基、噻喃基、四氢呋喃基、噁嗪基、二氧环戊基、四氢异喹啉基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、喹嗪基、噻唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、二氢吲哚基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基和吡唑烷基等。
在本申请中，作为基团或是其它基团的一部分，“芳基”意指具有6至14个碳原子(优选具有6至10个碳原子，例如6、7、8、9或10个碳原子)的共轭烃环体系基团。芳基可以为单环或双环的环体系。芳基的实例包括但不限于苯基和萘基等。
在本申请中，“芳烷基”是指被上文所定义的芳基所取代的上文所定义的烷基。
在本申请中，作为基团或是其它基团的一部分，“杂芳基”意指环内具有1至15个碳原子(优选具有1至10个碳原子，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子)和1至6个选自氮、氧和硫的杂原子的5元至16元、优选5-10元共轭环系基团。除非本说明书中另外特别指明，否则杂芳基可为单环、双环、三环或更多环的环体系。杂芳基的实例包括但不限于噻吩基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、噁唑基、噁二唑基、异噁唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、苯并咪唑基、苯并吡唑基、吲哚基、呋喃基、吡咯基、三唑基、四唑基、三嗪基、吲嗪基、异吲哚基、吲唑基、异吲唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、二氮萘基、萘啶基、喹噁啉基、蝶啶基、咔唑基、咔啉基、菲啶基、菲咯啉基、吖啶基、吩嗪基、异噻唑基、苯并噻唑基、吡咯并吡啶基、苯并吡咯基、苯并噻吩基、噁三唑基、噌啉基、喹唑啉基、苯硫基、中氮茚基、邻二氮杂菲基、异噁唑基、吩噁嗪基、吩噻嗪基等。
在本申请中，基团可任选地被取代。“任选地”表示随后描述的事件或状况可能发生也可能不发生，且该描述同时包括该事件或状况发生和不发生的情况。例如，“任选取代的芳基”表示芳基被取代或未被取代，且该描述同时包括被取代的芳基与未被取代的芳基。本发明权利要求书和说明书部分所述的“任选”的取代基包括但不限于烷基、烯基、炔基、卤素、卤代烷基、卤代环氧基、卤代烯基、卤代炔基、氰基、环烷基-O-、硝基、氨基、任选取代的氨基、烷氧基、环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环烃基和任选取代的杂环基中的一个或多个。在优选的实施方案中，取代基包括但不限于C1-C6烷基、卤代烷基、环烷基、氨基、C1-C6烷基取代的氨基、卤素、氰基、C3-C8环烷基-O-、芳基和杂芳基中的一个或多个。在本申请中，当被取代时，视被取代的基团的结构，取代基的数量可以是1-5个，如1-3个。例如，苯基可被1-3个选自C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基-O-、卤素和氨基的取代基取代。
本领域技术人员还应当理解，在下文所述的方法中，中间体化合物官能团可能需要由适当的保护基保护。这样的官能团包括羟基、氨基、巯基及羧酸。合适的羟基保护基包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。合适的氨基、脒基及胍基的保护基包括叔丁氧羰基、苄氧羰基等。合适的巯基保护基包括-C(O)-R”(其中R”为烷基、芳基或芳烷基)、对甲氧基苄基、三苯甲基等。合适的羧基保护基包括烷基、芳基或芳烷基酯类。
保护基可根据本领域技术人员已知的和如本文所述的标准技术来引入和除去。保护基的使用详述于Greene,T.W.与P.G.M.Wuts,Protective Groups in OrganiSynthesis,(1999),4th Ed.,Wiley中。在一些实施方案中，本申请的保护基团为氨基的保护基团，如Boc(叔丁氧羰基)。保护基还可为聚合物树脂。
磷酰胆碱基团修饰的氨基酸
本文中，氨基酸或氨基酸分子可互换使用，其具有本领域周知含义。在一些实施方案中，氨基酸为天然氨基酸。本文中，由生物合成的氨基酸统称为“天然氨基酸”。氨基酸分子的例子包括但不限于本领域周知的甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、硒半胱氨酸、吡咯赖氨酸和鸟氨酸。
本申请提供修饰的氨基酸，其一个氮原子被基团R2和基团R1-L1-取代。本申请的修饰的氨基酸可为下式I所示的化合物：
R1-L1-N(R2)-R3 (I)
式I中：
R1为磷酰胆碱基团；
N代表氨基酸分子上的氮原子；
R2为H、C1-C4烷基或-L1-磷酰胆碱基团；
各L1独立为连接基团；
R3代表氨基酸分子上除所示N原子外的其余部分，该其余部分任选地被保护基团保护。
式I中，优选地，所述磷酰胆碱基团如下式所示：
Figure BDA0002987342630000081
式中，波浪线表示该磷酰胆碱基团与L1连接的位置。
式I中，优选地，所述各L1可独立表示为-La-Lb-，其中La选自C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基或C2-C6亚炔基；Lb不存在，或者为羰基、酯基(-COO-)、-O-SO2-或-NH-SO2-。优选地，Lb不存在或为羰基。优选地，L1通过Lb与所述N共价连接。在一些实施方案中，Lb和所示的N形成酰胺基或磺酰氨基。在优选的实施方案中，各L1独立为C1-C6亚烷基或C1-C6亚烷基羰基。
式I中，优选地，R3所述的氨基酸分子选自：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、硒半胱氨酸、吡咯赖氨酸和鸟氨酸。优选地，所述氨基酸分子选自：赖氨酸、鸟氨酸、缬氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸。更优选地，所述氨基酸分子选自：缬氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸、甘氨酸和瓜氨酸。更优选地，所述氨基酸分子选自：鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸和甘氨酸。
式I中，优选地，所述N不是氨基酸分子中的芳基、杂芳基或杂环基上的环氮原子。在一些实施方案中，所述N不是氨基酸分子中用来形成肽键的氮原子。
本领域周知，部分氨基酸存在游离的氨基，所述游离氨基指通常不与其它氨基酸形成肽键的氨基。具有游离氨基的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺。在本发明提供的磷酰胆碱基团修饰的氨基酸中，当该氨基酸为赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺时，所述游离的氨基可被保护，如与Boc保护基团共价连接，形成“叔丁氧基羰基-NH-”基团。
在一个或多个实施方案中，所述修饰的氨基酸选自LN001至LN010和LN012至LN025所示的化合物。
磷酰胆碱修饰的肽
另一方面，本申请提供一种磷酰胆碱修饰的肽，所述肽至少包括一个磷酰胆碱基团，所述磷酰胆碱基团与所述肽所含的1个或多个氨基酸的N原子和/或氧原子经由连接基团共价连接。应理解，所述肽中的氨基酸残基之间通过肽键连接。所述磷酰胆碱基因可连接至形成肽键的N上，也可连接指未形成肽键的N上；优选不连接于氨基酸残基的芳基、杂芳基或杂环基的环氮原子。
优选地，本申请所述的肽具有2-10个氨基酸残基，更优选具有2-5个氨基酸残基，即所述肽为二肽、三肽、四肽或五肽。
优选地，所述肽为可被病理环境中的酶水解的肽。优选地，所述酶可为蛋白水解酶、蛋白酶或肽酶。更优选地，所述酶选自：半胱氨酸蛋白酶、天冬酰胺蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、明胶酶、金属蛋白酶和天冬酰胺肽裂解酶中的一种或多种。优选地，所述肽可被病理环境中的一种水解，或被多种酶同时水解。所述病理环境可以是本领域周知的各种期望进行治疗的环境，例如肿瘤细胞所存在的病理环境，如癌组织，或者为炎症部位，或者为感染部位，或者为需治疗的其它组织。在优选的实施方案中，所述酶选自天冬酰胺内肽酶(Legumain)。
所述肽所含的氨基酸残基可以是本领域周知的各种氨基酸残基，所述氨基酸残基可以是前文R3定义的氨基酸分子中所述的任意一种或多种氨基酸残基。应理解，肽中氨基酸残基的数量及种类的选择可根据该肽将被使用的环境中所存在的酶决定。例如，若病理环境中含有天冬酰胺内肽酶，则优选地，该肽为可被天冬酰胺内肽酶识别并水解/切割以释放出治疗剂的肽。在一些实施方案中，所述肽中的氨基酸残基选自：缬氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸、甘氨酸和瓜氨酸中的一种或多种。
所述连接基团可以为本文任一实施方案所述的L1。
在一个或多个实施方案中，所述肽含有至少一个本文任一实施方案所述的磷酰胆碱基团修饰的氨基酸。优选地，所述肽中的至少一个被磷酰胆碱基团修饰的氨基酸残基选自：LN001至LN010以及LN012至LN025所示的化合物。
在优选的实施方案中，所述肽中磷酰胆碱基团修饰的氨基酸残基选自：鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸和甘氨酸中的一个或多个。在进一步优选的实施方案中，所述肽中被磷酰胆碱基团修饰的氨基酸残基衍生自以下分子中的一种或多种：LN001-LN010、LN022和LN025。所述“衍生”指所述分子的氨基上的一个H以及羧基上的H被去除，以分别与肽中的其它氨基酸残基形成肽键。应理解，当衍生自所述分子的氨基酸残基位于肽的N端或C端时，则该氨基酸残基为单价基团，否则为二价基团。
在一些实施方案中，所述肽为Val-Orn、Val-Lys、Ser-Val-Lys、Gly-Val-Lys、Ser-Val-Cit、Gly-Val-Cit、Gly-Gly-Gly-Val-Lys或Gly-Gly-Val-Lys。优选地，这些肽中的鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸和甘氨酸中的一个或多个被磷酰胆碱基团修饰。在一些实施方案中，所述肽如LN011所示。
在一些实施方案中，所述磷酰胆碱修饰的肽选自：Val-Orn(N-PC)、Val-Lys(N-PC)、Val-Lys(N-PC2)、Val-Lys(N-PC-PC)、Val-Lys(N-Me-PC)、Gly(N-PC)-Val-Lys(N-PC)、Ser(O-PC)-Val-Lys(N-PC)、Ser(O-PC)-Val-Cit、Gly(N-PC)-Val-Cit、Gly(N-PC)-Lys(N-PC)、Gly-Gly-Gly-Val-Lys(N-PC)和Gly-Gly-Val-Lys(N-PC)：
Figure BDA0002987342630000111
Figure BDA0002987342630000121
连接子化合物
本申请提供下式II所示的连接子化合物：
R4-L2-P-R5 (II)
式中：
R4为可与蛋白中的半胱氨酸残基中的S，或-赖氨酸上的氨基发生反应，从而将式II连接到蛋白的基团；
L2为连接基团；
P为本文任一实施方案所述的修饰的氨基酸或修饰的肽；所述修饰的氨基酸或修饰的肽与L2和R5共价连接；
R5为：
Figure BDA0002987342630000131
R6为H、卤素、C1-10烷基、C3-C8环烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C3-C8环烯基、6-14元芳基、芳烷基、5-10元杂芳基或4-10元杂环基；
R9为H、-C(O)-N(R7)-(CH2)m-NHR8或硝基取代的苯氧基羰基；
R7为H或C1-6烷基；
R8为H或C1-6烷基；和
m为1-6的整数。
在一个或多个实施方案中，R4选自：
Figure BDA0002987342630000132
其中，波浪线表示R4与L2连接的位置；F5表示5个氟原子。
式II中，优选地，L2为-La-Lb-，其中La选自C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基或C2-C6亚炔基；Lb不存在，或者为羰基、酯基(-COO-)、-O-SO2-或-NH-SO2-。优选地，Lb不存在或为羰基。优选地，L2通过Lb与所述P共价连接。在一些实施方案中，Lb和P间形成酰胺基或磺酰氨基。在优选的实施方案中，各L2独立为C1-C6亚烷基或C1-C6亚烷基羰基。
因此，在一些实施方案中，所述R4-L2与P以及通过选自酰胺基(-CO-NH-)、酯基(-COO-)、-O-SO2-NH-和-NH-SO2-NH-的连接方式共价连接。优选地，R4-L2与P通过酰胺基共价连接。
R4与L2之间可通过La进行连接。优选地，R4与L2之间可通过选自碳碳单键、酰胺基(-CO-NH-)、酯基(-COO-)、-O-SO2-NH-和-NH-SO2-NH-的连接方式共价连接，优选通过碳碳单键或酰胺基进行共价连接。
优选地，式II中，所述P与R5通过选自酰胺基(-CO-NH-)、酯基(-COO-)、-O-SO2-NH-和-NH-SO2-NH-的连接方式共价连接，优选通过酰胺基共价连接。
优选地，式II中，R5为：
Figure BDA0002987342630000141
优选地，式II中，R6为H或C1-C6烷基。
优选地，式II中，R7为H或C1-C4烷基。
优选地，式II中，R8为H或C1-C4烷基。
优选地，式II中，m为1-4的整数。
在优选的实施方案中，所述式II的结构表示为：
R4-(C1-C6亚烷基)-C(O)-[NH-P-C(O)]-R5。
在一个或多个实施方案中，所述式II化合物如化合物1-8、1-9、2-6、2-7、3-5、3-6、4-4、4-5、5-3、5-4、6-3、6-4、7-4、7-5、8-3、8-4、15-4、15-5、16-3、16-4、23-2或23-3所示。
连接子化合物共价连接的药物
本申请的连接子化合物可用于修饰感兴趣的药物分子。还提供一种与本申请所述的连接子化合物共价连接的药物，其具有下式III所示结构：
R4-L2-P-R5-D (III)
式中：R4、L2、P和R5如前文任一实施方案所定义；D表示药物分子去除了一个H原子后获得的基团。
在一个或多个实施方案中，所述药物分子通过与R5形成碳酸酯键(-OCO-)或氨基甲酸酯(-OCNH-)而与R5相连。
在一个或多个实施方案中，所述药物分子选自：MMAE、Duo-5、DXD、依沙替康、喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、氟脲苷、去氧氟尿苷、阿糖胞苷、依托泊苷、氟达拉滨、卡培他滨、长春新碱、埃坡霉素B、紫杉醇、多烯紫杉醇、柔红霉素、表阿霉素、甲氨蝶呤、吉西他滨、美法仑、尼莫司汀、米托蒽醌、阿霉素和丝裂霉素。
这些药物一般通过通过羟基或氨基与式II中的R5形成碳酸酯键(-OCO-)或氨基甲酸酯(-OCNH-)而与式II连接。
通常，连接子化合物所连接的药物分子上的位置应不影响该药物分子的生物学活性。可根据药物分子的结构功能特性，选择远离其活性中心的位置与连接子化合物共价连接。另外可以考虑的是连接子化合物与药物分子发生反应的便利性。通常，可在方便将连接子化合物连接到药物分子、同时又不影响连接后的药物分子的生物学活性的前提下选择连接的位置，这可由本领域技术人员根据本领域公知技术实施并测试所得的经连接子化合物修饰的药物分子的生物学活性。优选地，本文所述的连接子化合物共价连接的药物分子与未连接的药物分子相比，保留了至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、更优选至少95％以上的生物学活性。
优选地，所述药物如LD001到LD0025所示。
ADC
再一方面，本申请提供一种ADC，其结构式如下式IV所示：
A-(R4-L2-P-R5-D)n (IV)
式中，R4、L2、P、R5和D如前文任一实施方案所定义，A为抗体或其抗原结合片段，n为1-8的整数。
本文中，“抗体”具有本领域周知含义，包括具有所需生物活性的任何形式的抗体，如单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体和骆驼源化单结构域抗体等。
“单克隆抗体”是指获自基本均质抗体群的抗体，即组成该群的各个抗体除可少量存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原表位。相比之下，常规(多克隆)抗体制备物通常包括大量针对不同表位(或对不同表位有特异性)的抗体。
“全长抗体”指在天然存在时包含至少四条肽链的免疫球蛋白分子：两条重(H)链和两条轻(L)链通过二硫键互相连接。每一条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区(在本文中缩写为CH)组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每一条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可被进一步细分为具有高可变性的互补决定区(CDR)和其间隔以更保守的称为框架区(FR)的区域。每一个VH或VL区由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白对宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。
抗体的“抗原结合片段”包括抗体的片段或衍生物，通常包括亲代抗体的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)的至少一个片段，其保持亲代抗体的至少一些结合特异性。抗体结合片段的实例包括但不限于Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；由抗体片段形成的纳米抗体和多特异性抗体。当抗原的结合活性在摩尔浓度基础上表示时，结合片段或衍生物通常保持其抗原结合活性的至少10％。优选结合片段或衍生物保持亲代抗体的抗原结合亲和力的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更高。还预期抗体的抗原结合片段可包括不明显改变其生物活性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。术语“结合化合物”是指抗体及其结合片段两者。
“单链Fv”或“scFv”抗体是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单条多肽链中。Fv多肽一般还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。“结构域抗体”是只含有重链可变区或轻链可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或更多个VH区与肽接头共价连接形成二价结构域抗体。二价结构域抗体的2个VH区可靶向相同或不同的抗原。“二价抗体”包含2个抗原结合部位。在某些情况下，2个结合部位具有相同的抗原特异性。然而，二价抗体可以是双特异性的。“双抗体”是指具有两个抗原结合部位的小抗体片段，所述片段包含在同一多肽链(VH-VL或VL-VH)中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用短得不允许在同一链的两个结构域之间配对的接头，迫使该结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合部位。
优选地，式IV中，抗体通过该抗体所含的半胱氨酸的巯基或赖氨酸的游离氨基与R4相连。
优选地，式IV中，抗体可以是本领域周知的各类具有所需生物学活性的抗体或其抗原结合片段。例如，抗体或其功能性片段可选自：抗-Her2抗体，抗-EGFR抗体，抗-VEGFR抗体，抗-CD20抗体，抗-CD33抗体，抗-PD-L1抗体，抗-PD-1抗体，抗-CTLA-4抗体，抗-TNFα抗体，抗-CD28抗体，抗-4-1BB抗体，抗-OX40抗体，抗-GITR抗体，抗-CD27抗体，抗b-CD40抗体，或抗-ICOS抗体，抗-CD25抗体，抗-CD30抗体，抗-CD3抗体，抗-CD22抗体，抗-CCR4抗体，抗-CD38抗体，抗-CD52抗体，抗-补体C5抗体，抗RSV的F蛋白，抗-GD2抗体，抗-GITR抗体，抗-糖蛋白受体lib/Illa抗体，抗-ICOS抗体，抗-IL2R抗体，抗-LAG3抗体，抗-Integrinα4抗体，抗-lgE抗体，抗-PDGFRa抗体，抗-RANKL抗体，抗-SLAMF7抗体，抗-LTIGIT抗体，抗-TIM-3抗体，抗-VEGFR2抗体，抗-VISTA抗体，抗C-Met抗体，抗BCMA抗体，抗Claudin18抗体、抗Nectin-4抗体，抗CD79b抗体，和抗Trop 2抗体。
式IV中，与抗体辍合的-R4-L2-P-R5-D部分的数量可以为1-8个，该数量一般与抗体中二硫键的数量有关，也与参与偶联反应的基团有关。本领域技术人员可根据抗体的氨基酸序列、参与偶联反应的基团等条件，容易确定n的数量。在一些实施方案中，n为2-6的整数。在一些实施方案中，n为4。
在优选的实施方案中，所述ADC选自LA001至LA025中的任意一个或多个。
制备方法
可参照本申请实施例所述的方法制备本申请的磷酰胆碱基团修饰的氨基酸、磷酰胆碱修饰的肽、连接子化合物、连接子化合物共价连接的药物以及ADC。下文示例性地描述相应的制备方法。
磷酰胆碱基团修饰的氨基酸
可通过将合适保护的氨基酸的氨基和含磷酰胆碱基团的醛(如LN027)进行还原胺化，或由氨基酸侧链上的氨基和含磷酰胆碱基团的羧酸(LN028)形成酰胺，或由氨基酸侧链上的羧基和含磷酰胆碱基团的氨基(LN029)成酰胺制备而得到磷酰胆碱基团修饰的氨基酸。
磷酰胆碱修饰的肽和磷酰胆碱修饰的连接子化合物的制备
为避免多肽缩合对氨基苄醇(PAB)时产生消漩异构体，磷酰胆碱修饰的肽和磷酰胆碱修饰的连接子化合物的制备通常采用将合适保护的氨基酸和对氨基苄醇(PAB)进行缩合反应，生成合适保护的氨基酸的对氨基苄醇(PAB)酰胺，然后脱保护，进行常规的多肽合成。并按需要引入式II中L2和R5的以及式III中的R4和D。
ADC的制备
可使先还原抗体，然后混合还原的抗体与本发明的式III所示的连接子化合物共价连接的药物，室温下静置足够时间后，分离纯化得到本发明的ADC。还原抗体的方法为本领域所周知。还原的目的包括使抗体中的二硫键还原成巯基。合适的还原剂包括TCEP等。可根据不同的抗体种类选自不同的还原剂以及缓冲体系。
药物组合物、用途和疾病的治疗和预防方法
本申请提供一种药物组合物，其含有有效量的本申请任一实施方案所述的ADC和药学上可接受的载体。本申请还提供疾病的治疗或预防方法，包括给予需要的对象治疗有效量或预防有效量的本申请的ADC或其药物组合物。还提供的是本申请所述磷酰胆碱修饰的氨基酸、磷酰胆碱修饰的肽、连接子化合物以及连接子化合物共价连接的药物在制备ADC中的应用，以及本文任一实施方案所述的ADC在制备治疗或预防疾病的药物中的应用。
本文中，“预防”和“预防”包括使病患减少疾病或病症的发生或恶化的可能性；该术语也包括：预防疾病或病症在哺乳动物中出现，特别是当这类哺乳动物易患有该疾病或病症，但尚未被诊断为已患有该疾病或病症时。“治疗”和其它类似的同义词包括以下含义：(i)抑制疾病或病症，即遏制其发展；(ii)缓解疾病或病症，即，使该疾病或病症的状态消退；或者(iii)减轻该疾病或病症所造成的症状。
本文中，“给予”指能够将化合物或组合物递送到进行生物作用的所需位点的方法。本领域周知的给药方法均可用于本发明。这些方法包括但不限于口服途径、经十二指肠途径、胃肠外注射(包括肺内、鼻内、鞘内、静脉内、皮下、腹膜内、肌内、动脉内注射或输注)、局部给药和经直肠给药。本领域技术人员熟知可用于本文所述化合物和方法的施用技术，例如在Goodman and Gilman,The Pharmacological Basis of Therapeutics,currented.；Pergamon；and Remington’s,Pharmaceutical Sciences(current edition),MackPublishing Co.,Easton,Pa中讨论的那些。
本文中，有效量包括治疗有效量和预防有效量，是指本申请的ADC当单独或与其它治疗药物组合给予受试者时，有效预防或改善一种或多种疾病或病况的症状或该疾病或病况的发展的量。治疗有效量还指足以导致症状改善的ADC的量，例如治疗、治愈、预防或改善相关医学病况或者提高这类病况的治疗、治愈、预防或改善的速度的量。具体有效量取决于各种因素，例如待治疗的具体疾病，患者的身体状况，如体重，年龄和性别，治疗的持续时间，共同给药的治疗(如果有的话)，以及使用的具体配方。
药学上可接受的载体指药物制剂或组合物中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于佐剂、载体、赋形剂、助流剂、增甜剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、矫味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。可采用本领域周知的药学上可接受的载体来配制本申请的药物组合物。
本申请的药物组合物可以配制成各种合适的剂型，包括但不限于片剂，胶囊，注射剂等，并且可以通过任何合适的途径给药以达到预期目的。例如，它可以肠胃外，皮下，静脉内，肌肉内，腹膜内，透皮，口服，鞘内，颅内，鼻内或外给药。药物的剂量可取决于患者的年龄，健康状况和体重，并行进行的治疗，以及治疗的频率等。本申请的药物组合物可以施用于任何有此需要的受试者，例如哺乳动物，尤其是人类。
根据ADC中的抗体或其抗原结合片段以及药物，本申请的药物组合物可用于治疗或预防相应的疾病。例如，当所述药物是抗癌药时，本申请的药物组合物可用于治疗该抗癌药可治疗的癌症，包括但不限于膀胱，脑，乳腺，子宫颈，结肠-直肠，食道，肾，肝，肺，鼻咽，胰腺，前列腺，皮肤，胃，子宫，卵巢，睾丸和血液中的癌症等。具体而言，癌症包括膀胱癌，脑癌，乳腺癌，宫颈癌，结直肠癌，食道癌，肾癌，肝癌，肺癌，鼻咽癌，胰腺癌，前列腺癌，皮肤癌，胃癌，子宫癌，卵巢癌，睾丸癌和血癌。
在一些实施方案中，本申请还提供一种改善ADC溶解性的方法，尤其是改善ADC的水溶性的方法，所述方法包括用磷酰胆碱基团修饰ADC药物中作为连接子的肽链的步骤。更具体而言，所述方法包括使用本发明任一实施方案所述的氨基酸或肽或连接子化合物来制备ADC的步骤。所述制备方法根据所使用的不同的抗体、氨基酸、肽、连接子化合物而不同，但可参照本文所公开的制备方案实施。在其它一些实施方案中，本申请还提供本申请任一实施方案所述的氨基酸、肽、连接子化合物以及与连接子化合物共价连接的药物在改善抗体溶解性(尤其是水溶性)中的应用，或在制备用于改善抗体溶解性(尤其是水溶性)的制剂中的应用，或在制备溶解性(尤其是水溶性)改善的ADC中的应用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
下述实施例中所用的起始物可由化学品销售商如Aldrich、TCI、Alfa Aesar、毕得、安耐吉等处购得，或者可通过已知的方法来合成。
缩写对照表：
Figure BDA0002987342630000211
分离纯化方法：
中压制备方法：
色谱柱Spherical C18,40-75μm，100
流动相A：水(0.05％TFA)；流动相B：乙腈
Figure BDA0002987342630000212
Figure BDA0002987342630000221
高压制备方法：
高压制备：
色谱柱Gemini 5μm NX-C18
Figure BDA0002987342630000222
150*50mm
流动相A：水(0.05％TFA)；流动相B：乙腈
时间[min] 流动相A[％] 流动相B[％] 流速[mL/min]
0.00 90.0 10.0 50.0
6.00 70.0 30.0 50.0
25.00 35.0 65.0 50.0
27 10.0 90.0 50.0
29.0 10.0 90.0 50.0
29.1 90.0 10.0 50.0
31.0 90.0 10.0 50.0
疏水作用色谱法(HIC)谱图分析所用材料和试剂以及分析方法如下：
Figure BDA0002987342630000223
Figure BDA0002987342630000231
尺寸排阻色谱分析(SEC)所用材料和试剂以及分析方法如下：
色谱柱 TSKgel G3000SW<sub>XL</sub> 5μm*7.8mm*300mm
流动相 100mM PBS+100mM NaCl+15％IPA pH7.0
进样量 10μL
检测波长 280nm
柱温 30℃
流速 0.5ml/min
洗脱方式 等度
分析时间 30min
一、磷酰胆碱修饰的氨基酸的合成
实施例一：LN001的合成
Figure BDA0002987342630000232
步骤一：LN001-2的合成：
于250ml的圆底烧瓶中加入Boc-赖氨酸(LN001-1,10g，41mmol)，乙酸叔丁脂(100ml)，搅拌均匀后，再缓慢滴加高氯酸(8.2g,82mmol)，待反应溶清后，常温搅拌过夜。加入乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠调节pH至7左右，分出有机相，水相用乙酸乙酯萃取，合并有机层，用无水硫酸钠干燥，浓缩得到无色油状液体LN001-2，3.0g。ESI-MS(m/z)；303.41。
步骤二：LN001-3的合成：
取化合物LN028(450mg，2.0mmol)加入10ml的圆底烧瓶中，再加入5ml的DMF,搅拌均匀后，加入HATU(760mg，2mmol)，DIPEA(516mg，4mmol)反应混合液搅拌30min以后，加入化合物LN001-2(300mg，1mmol)，反应2h后，LCMS监控反应完全后，将反应混合液直接进行中压反相纯化(乙腈/水)，冻干后得到无色固体LN001-3，180mg.ESI-MS(m/z)；526.56
步骤三：化合物LN001的合成：
于5ml圆底烧瓶中加入上步骤得到的化合物LN001-3(50mg)和1ml的三氟乙酸，常温反应一小时后浓缩得到粗品，将粗品溶于水后，用乙酸乙酯洗涤后，分出水相，冻干得到绿色油状物LN001，35mg。ESI-MS(m/z)：370.32.HNMR(400MHz，D2O)：4.23-4.18(m,4H),3.94(t,1H),3.52(t,2H),3.14(t,2H),3.06(s,9H),1.87-1.78(m,2H),1.48-1.43(m,2H),1.37-1.27(m,2H).
实施例二：化合物LN002的合成：
Figure BDA0002987342630000241
步骤一：(LN002-2)的合成：
于50ml圆底烧瓶中加入LN001-2(1.0g，3.3mmol)，LN027(0.25g，1.1mmol)和甲醇(30ml)。搅拌均匀后，常温条件下分批加入乙酰氧基硼氢化钠(1.0g，4.7mmol),反应2h后，LCMS监控反应，原料消耗完全后，浓缩至2ml反应液，中压反相纯化(乙腈/水)，浓缩后冻干，得到无色固体LN002-2，420mg,ESI-MS(m/z)：512.44。
步骤二：LN002的合成：
于5ml圆底烧瓶中加入化合物LN002-2(50mg)和1ml的三氟乙酸，常温反应一小时后浓缩得到粗品，将粗品溶于水后，用乙酸乙酯洗涤后，分出水相，冻干得到绿色油状物LN002(24mg)。ESI-MS(m/z)：356.32.HNMR(400MHz，D2O)：4.20-4.18(m,2H),4.06-4.05(m,1H),4.01-3.96(m,2H),3.21-3.16(m,2H),3.07(s,9H),3.0-2.96(m,2H)1.92-1.80(m,2H),1.71-1.59(m,2H),1.43-1.37(m,2H).
实施例三：LN003的合成：
Figure BDA0002987342630000251
步骤一：LN003-2的合成：
于50ml圆底烧瓶中加入LN001-2(1.0g，3.3mmol)，LN027(1.5g，6.6mmol)和甲醇(30ml)。搅拌均匀后，常温条件下分批加入乙酰氧基硼氢化钠(2.1g，9.9mmol),反应2h后，LCMS监控反应，原料消耗完全后，浓缩至2ml反应液，中压反相纯化(乙腈/水)，浓缩后冻干，得到无色固体LN003-2，350mg,ESI-MS(m/z)：721.74。
步骤二：LN003的合成：
于5ml圆底烧瓶中加入化合物LN003-2(50mg)和1ml的三氟乙酸，常温反应一小时后浓缩得到粗品，将粗品溶于水后，用乙酸乙酯洗涤后，分出水相，冻干得到LN003，32mg。ESI-MS(m/z)：565.49.HNMR(400MHz，D2O)：4.30-4.28(m,4H),4.24-4.19(m,3H),4.12-4.05(m,3H),3.64-3.62(m,4H),3.55-3.54(m,3H),3.34-3.28(m,2H),3.17(s,18H),2.04-1.92(m,2H),1.83-1.71(m,2H),1.55-1.45(m,2H).
实施例四：LN004的合成
Figure BDA0002987342630000261
步骤一：LN004-2的合成：
于10ml圆底烧瓶中加入化合物LN002-2(200mg，0.39mmol)，甲醛水溶液(0.5ml)和甲醇(5ml)。搅拌均匀后，常温条件下分批加入乙酰氧基硼氢化钠(249mg，1.2mmol),反应2h后，LCMS监控反应，原料消耗完全后，浓缩至2ml反应液，中压反相纯化(乙腈/水)，浓缩后冻干，得到绿色油状物LN004-2，110mg。ESI-MS(m/z)：526.49。
步骤二：LN004的合成：
于5ml圆底烧瓶中加入50mg化合物LN004-2和1ml的三氟乙酸，常温反应一小时后浓缩得到粗品，将粗品溶于水后，用乙酸乙酯洗涤后，分出水相，冻冻干燥得到LN004，18mg。ESI-MS(m/z)：370.32.HNMR(400MHz，D2O)：4.18-4.16(m,2H),4.06-4.05(m,1H),4.0-3.95(m,2H),3.21-3.16(m,2H),3.07(s,9H),3.0-2.96(m,2H),2.88(s,3H),1.92-1.80(m,2H),1.71-1.59(m,2H),1.43-1.37(m,2H).
实施例五：LN005的合成
Figure BDA0002987342630000262
步骤一：LN005-2的合成：
取LN028(264mg，1.18mmol)加入10ml的圆底烧瓶中，再加入5ml的DMF，搅拌均匀后，加入HATU(448mg，1.18mmol)，DIPEA(304mg，2.36mmol)反应混合液搅拌30min以后，加入化合物LN002-2(300mg，0.59mmol)，反应2h后，LCMS监控反应完全后，将反应混合液直接进行中压反相纯化(乙腈/水)，冻干后得到无色固体LN005-2，145mg，ESI-MS(m/z)；735.65。
步骤二：LN005的合成：
于5ml圆底烧瓶中加入60mg化合物LN005-2和1ml的三氟乙酸，常温反应一小时后，LCMS监控反应进程，浓缩得到粗品，将粗品溶于水后，用乙酸乙酯洗涤后，分出水相，冻干得到LN005,18mg。，ESI-MS(m/z)：579.48。1HNMR(400MHz，D2O)：4.72-4.57(m,2H),4.25-4.24(m,1H),4.17-4.11(m,2H),4.02-3.93(m,4H),3.59-3.49(m,4H),3.42-3.39(m,2H),3.35-3.23(m,2H),3.12-3.09(m,18H),1.96-1.84(m,2H),1.73-1.54(m,2H),1.42-1.34(m,2H).
采用类似的方法可合成以下分子：
Figure BDA0002987342630000271
实施例六：化合物LN011的合成
Figure BDA0002987342630000281
步骤一：化合物LN011-2的合成
于50ml圆底烧瓶中加入叔丁基N6-((苄氧基)羰基)-L-赖氨酸(1.3g，6.0mmol)，HATU(2.7g，7.2mmol)，DIPEA(2.3g，18mmol)和DCM(15ml)。反应20min后，常温条件下加入LN011-1(2.0g，6mmol)，反应2h后，TLC监控反应，原料消耗完全后，反应液加入20ml的DCM，用水洗后，干燥浓缩，经硅胶柱纯化(PE/EA＝20/1-1/1)，得到白色固体LN011-2共1.8g。ESI-MS(m/z)：536.62。
步骤二：
于50ml圆底烧瓶中加入化合物LN011-2(1.8g，3.4mmol)，Pd/C(360mg)和甲醇(10ml)，抽换气后，在氢气氛围下，常温反应2h。LCMS监控反应完全后，过滤浓缩，得到白色固体LN011-3，1.4g。ESI-MS(m/z)：402.51
步骤三：
取LN028(450mg，2.0mmol)加入10ml的圆底烧瓶中，再加入5ml的DMF,搅拌均匀后，加入HATU(760mg，2mmol)，DIPEA(516mg，4mmol)反应混合液搅拌30min以后，加入化合物LN011-3(400mg，1mmol)，反应2h后，LCMS监控反应完全后，将反应混合液直接进行中压反相纯化(乙腈/水)，冻干后得到无色固体LN011-4(120mg).ESI-MS(m/z)：625.65。
步骤四：于5ml圆底烧瓶中加入化合物LN011-4(40mg)和1ml的三氟乙酸，常温反应一小时后浓缩得到粗品，将粗品溶于水后，用乙酸乙酯洗涤后，分出水相，冻干得到LN011，25mg。LC-MS；469.33.HNMR(400MHz，D2O)：4.34-4.24(m,4H),3.78(d,1H),3.66-3.59(m,2H),3.22-3.19(m,2H),3.14(s,9H),3.12-3.10(m,1H),2.22-2.13(m,2H),1.87-1.71(m,2H),1.53-1.47(m,2H),1.36-1.33(m,2H),0.99-0.96(m,6H).
实施例七：化合物LN012的合成
Figure BDA0002987342630000291
步骤一：LN012-2的合成
将LN012-1(0.4g，1.4mmol)溶于10mL DMF中，加入0.4g(1.67mmol)化合物LN029，加入HATU(0.59g，1.54mmol)和DIPEA(0.45g，3.5mmol)，室温反应1个小时，中压制备纯化得目标产物LN012-2，0.43g，ESI-MS(m/z)：512.3。
核磁：δ(400MHz，D2O)4.23-4.48(m,3H),3.97-4.08(m,2H),3.52-3.78(m,4H),3.28-3.42(m,1H),3.22(s,9H),3.13(s,1.5H),2.92-3.03(m,2.5H),1.48(s,6H),1.43-1.47(m,6H),1.24(s,6H).
步骤二：化合物LN012的合成
将步骤一得到的化合物LN012-2(200mg,0.39mmol)溶于TFA(三氟乙酸)中，常温反应三十五分钟。旋干后加水冻干，得120mg产品(淡黄色固体)LN012，ESI-MS(m/z)：356.2。
氢谱：δ(400MHz，D2O)4.34-4.39(m,1H),4.23-4.32(m,2H),3.98-4.08(m,2H),3.59-3.68(m,4H),3.23-3.41(m,2H),3.21(s,9H),3.11(s,1.5H),2.95(s,1.5H).
实施例八：化合物LN013的合成：
Figure BDA0002987342630000301
步骤一：
于250ml的圆底烧瓶中加入缬氨酸(2.0g)，乙酸叔丁脂(20ml)，搅拌均匀后，再缓慢滴加高氯酸(1.2g)，待反应溶清后，常温搅拌过夜。加入乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠调节pH至7左右，分出有机相，水相用乙酸乙酯萃取，合并有机层，用无水硫酸钠干燥，浓缩得到无色油状液体缬氨酸叔丁酯400mg，ESI-MS(m/z)；174.14
步骤二：
于50ml圆底烧瓶中加入步骤一的产物缬氨酸叔丁酯400mg，化合物LN027 600mg和甲醇(30ml)。搅拌均匀后，常温条件下分批加入乙酰氧基硼氢化钠2.1g,反应2h后，LCMS监控反应，原料消耗完全后，浓缩反应液得到类白色固体LN013-1 3.0g,ESI-MS(m/z)：383.2
步骤三：
于50ml圆底烧瓶中加入步骤二的产物LN013-1 3.0g粗品，加入碳酸钾水溶液20ml，1.2gBoc酸酐的甲醇溶液，慢慢加入反应液中，调节pH值在8.0-10.0之间常温反应，反应1h后，LCMS监控反应，原料消耗完全后，浓缩反应液，经中压制备纯化得到产物LN013-2，230mg,ESI-MS(m/z)：483.3
步骤四：
将步骤三得到的产物LN013-2加入25ml反应瓶中，加入三氟乙酸3mL，常温反应30分钟。旋干后加水冻干，得150mg产品LN013(淡黄色固体)，ESI-MS(m/z)：327.2
采用类似的方法可合成以下分子：
Figure BDA0002987342630000311
Figure BDA0002987342630000321
Figure BDA0002987342630000331
Figure BDA0002987342630000341
实施例九：
A：化合物LN027的合成
Figure BDA0002987342630000342
将甘油磷酰胆碱(100g，389mmol)溶于1.5升水中，用冰水浴降温，分批次加入高碘酸钠(124.7g，583mmol)，控制温度不超过20度，LC-MS中控反应，反应完毕后，减压条件下浓缩，加入甲醇打浆1-2小时，过滤除去固体，有机相浓缩，继续加入乙醇，过滤除去固体，将有机相浓缩后，油泵下干燥，得到化合物LN027，65g，ESI-MS(m/z)：226.1
B：化合物LN028的合成
Figure BDA0002987342630000343
将甘油磷酰胆碱(31g，121mmol)溶于350毫升水中，加入150毫升乙腈，加入0.4g三氯化钌，分批次加入高碘酸钠(110g，514mmol)，控制温度不超过50度，LC-MS中控反应，反应完毕后，减压条件下浓缩，加入甲醇打浆1-2小时，过滤除去固体，有机相浓缩，继续加入醇，过滤除去固体，将有机相浓缩后，油泵下干燥，得到化合物LN028，19g，ESI-MS(m/z)：242.1
实施例十：化合物LN029的合成
Figure BDA0002987342630000351
于100ml圆底烧瓶中加入LN027(1.5g，6.6mmol)，甲胺盐酸盐(440mg，6.6mmol)和甲醇(60ml)。室温搅拌4个小时，分批加入乙酰氧基硼氢化钠(4.2g，19.8mmol),反应2h后，LC-MS中控反应，反应结束后，浓缩，中压反相制备纯化，冷冻干燥得目标化合物，1.2g,ESI-MS(m/z)：241.1。
实施例十一：化合物LN030的合成
Figure BDA0002987342630000352
步骤一：化合物LN030-2的合成
将化合物LN030-1(1.2g，3.5mmol)加入反应瓶中，加入10mL DMF，缓慢加入芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)(1.3g，5.0mmol)，滴加DIPEA(1.1g，8.4mmol)，室温反应12-20小时，中压制备纯化，冷冻干燥得化合物LN030-2，1.5g，ESI-MS(m/z)：563.2。507.2。
步骤二：化合物LN030的合成
将化合物LN030-2(1.5g，2.7mmol)加入反应瓶中，加入10mL三氟乙酸，室温反应4.0小时，LC-MS中控，反应结束后，中压制备纯化，冷冻干燥得化合物LN030，1.1g，ESI-MS(m/z)：507.2。
二、包含细胞生物活性分子和连接体的化合物的合成
实施例十二：化合物LD001的合成
Figure BDA0002987342630000361
步骤一：化合物1-2的合成：
将化合物1-1(5.0g,11.00mmol)加入到DCM(50mL)中，依次加入对氨基苄醇(2.71g，22.00mmol)及EEDQ(5.44g，22.00mmol)。常温反应过夜。浓缩抽滤，固体以少量DCM洗涤，干燥后得3.8g产品。ESI-MS(m/z)：560.3
核磁：δ(400MHz，DMSO-d6)9.95(s,1H),7.82-7.89(m,2H),7.67-7.73(m,1H),7.56-7.60(m,1H),7.47-7.55(m,2H),7.37-7.44(m,2H),7.27-7.34(m,2H),7.19-7.25(m,2H),6.76(t,J＝5.4Hz,1H),5.26(s,1H),4.42(s,2H),4.02-4.30(m,4H),2.87-2.98(m,2H),1.54-1.70(m,2H),1.37-1.52(m,2H),1.34(s,9H).
步骤二：化合物1-3的合成
将化合物1-2(3.7g,6.61mmol)溶于甲醇中，加入盐酸，常温反应半小时。旋干后中压制备(32％乙腈/水)得到1.9g产品(白色固体)，ESI-MS(m/z)：460.2。
核磁：δ(400MHz，DMSO-d6)10.23(s,1H),7.86-7.95(m,4H),7.68-7.76(m,2H),7.55-7.62(m,2H),7.38-7.45(m,2H),7.28-7.37(m,2H),7.20-7.26(m,2H),4.43(s,2H),4.15-4.34(m,4H),2.72-2.86(m,2H),1.75-1.88(m,1H),1.55-1.73(m,3H).
步骤三：化合物1-4的合成：
将化合物LN028(1.3g，5.4mmol)溶于DMF中，加入DIPEA(2.1g，16.2mmol)及HATU(2.3g，6.0mmol)，反应半小时后加入化合物1-3(1.9g，4.1mmol)。常温反应半小时。中压制备得到化合物1-4，2.1g，ESI-MS(m/z)：683.3。
步骤四：化合物1-5的合成：
将化合物1-4(2.0g，2.9mmol)溶于20毫升DMF中，加入5毫升二乙胺。常温反应二十分钟。旋蒸以除去二乙胺，加水冻干后得到产品1.3g，ESI-MS(m/z)：461.2。
步骤五：化合物1-6的合成：
将化合物1-5(1.2g，2.6mmol)及Fmoc-Val-OH(880mg，2.6mmol)溶于15毫升DMF中，加入HATU(1.1g，2.86mmol)及DIPEA(1.0g，7.8mmol)。常温反应十分钟。中压制备(35％乙腈)得到产品1.5g，ESI-MS(m/z)：782.4。
步骤六：化合物1-7的合成：
将化合物1-6(1.2g，1.5mmol)溶于20毫升DMF中，加入5毫升二乙胺。常温反应二十分钟。旋蒸以除去二乙胺，加水冻干后得到产品0.8g，ESI-MS(m/z)：560.3。
步骤七：化合物1-8的合成：
将化合物1-7(0.8g，1.4mmol)溶于10毫升DMF中，加入Mc-OSu(462mg，1.5mmol)。常温反应过夜。中压制备纯化，冷冻干燥得产品0.9g，ESI-MS(m/z)：753.4。
步骤八：化合物1-9的合成：
将化合物1-8(0.5g，0.66mmol)溶于10毫升DMF中，加入二(对硝基苯)碳酸酯(0.4，1.32mmol)及DIPEA(258mg，2.0mmol)。常温反应两小时。中压制备纯化，冷冻干燥得化合物1-9 0.5g，ESI-MS(m/z)：918.4。
核磁：δ(400MHz，DMSO-d6)10.31(s,1H),8.28-8.32(m,2H),8.10-8.20(m,2H),7.93(d,J＝8.8Hz,1H),7.66-7.72(m,2H),7.54-7.59(m,2H),7.37-7.43(m,2H),7.00(s,2H),5.24(s,2H),4.31-4.39(m,1H),4.10-4.22(m,5H),3.55-3.59(m,2H),3.34-3.39(m,2H),3.02-3.22(m,12H),2.08-2.24(m,2H),1.94-2.03(m,1H),1.75-1.86(m,1H),1.42-1.55(m,6H),1.12-1.28(m,3H),0.85(dd,J＝6.8,10.4Hz,6H).
步骤九：化合物LD001的合成
将化合物1-9(0.5g，0.54mmol)溶于5毫升DMF中，依次加入MMAE(390mg，0.54mmol)、HOBT(75mg，0.54mmol)及DIPEA(209mg，1.6mmol)。常温反应四小时。中压制备纯化，冷冻干燥得化合物LD001 0.6g，ESI-MS(m/z)：1496.8。
实施例十三：化合物LD002的合成
Figure BDA0002987342630000391
步骤一：将化合物2-1(52g，10.0mmol)加入反应瓶中，加入二氯甲烷1000mL，缓慢加入芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)(28g，10.8mmol)，滴加三乙胺(13.5g，13.4mmol)，室温反应12-20小时，往反应液中加入MTBE，打浆搅拌1-2小时，过滤，固体在减压条件下干燥得目标化合物2-2，72g。
步骤二：取步骤一得到的化合物2-2(2.1g，2.8mmol)，30ml二氯甲烷和10ml二氯乙酸加入反应瓶中，室温搅拌90分钟，LC-MS中控反应，反应结束后，加入甲基叔丁基醚，析出固体，继续搅拌1个小时后，过滤得到化合物2-3，淡黄色固体，1.3g，ESI-MS(m/z)：474.3[M+H]+。
步骤三：取LN-028(0.5g，2.1mmol)，加入反应瓶中，加入5ml DMF，HATU(0.76g，2.1mmol),DIPEA(0.81g，6.3mmol)，反应半个小时后，加入化合物2-3的DMF溶液，继续反应30分钟，所得反应液直接用中压制备进行纯化，得化合物2-4，0.9g，ESI-MS(m/z)：697.3[M+H]+。
步骤四：将步骤三得到的化合物2-4(0.9g，1.3mmol)加入到25ml单口反应瓶中，加入10毫升DMF，溶清后加入2毫升二乙胺，室温反应30分钟，减压蒸馏，在油泵下真空干燥得到化合物2-5，不用纯化直接用于下一步骤，ESI-MS(m/z)：475.2[M+H]+。
步骤五：将10毫升DMF加入到步骤四得到的化合物2-5的粗品中，加入0.5g(1.62mmol)Mc-OSu，室温反应过夜，用中压制备纯化得到0.85g化合物2-6，ESI-MS(m/z)：668.3[M+H]+。
步骤六：取0.4g(0.60mmol)化合物2-6和5毫升DMF加入反应瓶中，再加入0.3g(1.0mmol)二(对硝基苯)碳酸酯和0.26g(2.0mmol)DIPEA，室温反应2小时，反应结束后，所得反应液直接用中压制备进行纯化，得化合物2-7，0.35g，ESI-MS(m/z)：833.3[M+H]+。
步骤七：取0.2g(0.24mmol)化合物2-7加入25毫升反应瓶中，加入5毫升DMF、(0.1g，0.74mmol)HOBT、0.2g(0.28mmol)MMAE和0.2g(1.56mmol)DIPEA，室温反应1小时，所得反应液直接用高压制备进行纯化，得化合物LD002 0.25g，ESI-MS(m/z)：1411.8[M+H]+。
实施例十四：化合物LD003的合成
Figure BDA0002987342630000411
步骤一：取50g(62.9mmol)化合物3-1加入反应瓶中，加入500毫升二氯甲烷和170毫升二氯乙酸，室温反应1.5小时，将反应液倒入冰水中，剧烈搅拌0.5小时，析出白色固体，过滤得到化合物3-2，真空下干燥得化合物3-2的粗品31g，不用纯化直接用于下一步反应。
步骤二：取化合物LN-028(14.0g，58.1mmol)，加入反应瓶中，加入100毫升DMF，HATU(22.1g,58.1mmol),DIPEA(22.5g,174.3mmol)，反应一个小时，加入10.0g(17.5mmol)化合物3-2的DMF溶液，继续反应30分钟，所得反应液直接用中压制备进行纯化，得到7.9g化合物3-3，ESI-MS(m/z)：796.4[M+H]+
步骤三：取步骤二得到的化合物3-3(7.9g，9.9mmol)加入到250ml单口反应瓶中，加入100毫升DMF，溶清后加入20毫升二乙胺，室温反应30分钟，减压蒸馏，在油泵下除去DMF得到化合物3-4，不用纯化直接用于下一步骤，ESI-MS(m/z)：574.3[M+H]+。
步骤四：将100毫升DMF加入到化合物3-4粗品中，加入Mc-OSu(4.5g，14.6)，室温反应过夜，用中压制备纯化得到4.2g化合物3-5，ESI-MS(m/z)：767.4[M+H]+。
步骤五：取化合物3-5(4.0g，5.2mmol)，50毫升DMF加入反应瓶中，再加入二(对硝基苯)碳酸酯(3.5g，11.5mmol)和DIPEA(3.5g，27mmol)，室温反应2小时，反应结束后，所得反应液直接用中压制备进行纯化，得化合物3-6，3.6g，ESI-MS(m/z)：932.4[M+H]+。
步骤六：取化合物3-6(0.2g，0.21mmol)加入25毫升反应瓶中，加入5毫升DMF、0.1g(0.7mmol)HOBT、0.2g(0.28mmol)MMAE和0.2g(1.55mmol)DIPEA，室温反应1小时，所得反应液直接用高压制备进行纯化，得化合物LD003，0.23g，ESI-MS(m/z)：1510.9[M+H]+。
实施例十五：化合物LD004的合成
Figure BDA0002987342630000421
Figure BDA0002987342630000431
步骤一：取5.0g(8.7mmol)化合物3-2和化合物LN027(3.2g，14.1mmol)加入反应瓶中，加入150毫升甲醇，室温搅拌2个小时，加入1.0eq的STAB，继续反应2个小时后，加入1.0eq的STAB，继续反应2个小时后，加入0.5eq的STAB，继续反应1个小时，浓缩后，加入适量纯化水，中压制备纯化得到化合物4-1，3.6g，ESI-MS(m/z)：782.4[M+H]+。
步骤二：取1.2g(1.5mmol)化合物4-1加入反应瓶中，加入30毫升甲醇，滴加0.1毫升甲醛水溶液，分批加入2.5eq的STAB，反应0.5小时后，浓缩至约5毫升，加入适量纯化水，中压制备纯化得到化合物4-2，1.1g，ESI-MS(m/z)：796.4[M+H]+。
步骤三：取步骤二得到的化合物4-2(1.1g,1.4mmol)加入到50ml单口反应瓶中，加入10毫升DMF，溶清后加入2毫升二乙胺，室温反应30分钟，减压蒸馏，在油泵下将DMF除去得到化合物4-3的粗品，不用纯化直接用于下一步骤，ESI-MS(m/z)：574.3[M+H]+。
步骤四：将10毫升DMF加入到步骤三得到的化合物4-3粗品(0.8g)中，加入Mc-OSu(0.4g，1.3mmol)，室温反应过夜，用中压制备纯化得到0.52g化合物4-4，ESI-MS(m/z)：767.4[M+H]+。
步骤五：取0.5g(0.65mmol)化合物4-4，5毫升DMF加入反应瓶中，再加入0.30gDNPC(1.0mmol)和0.3g(2.3mmol)DIPEA，室温反应2小时，反应结束后，所得反应液直接用中压制备进行纯化，得化合物4-5，0.31g，ESI-MS(m/z)：932.4[M+H]+。
步骤六：取0.2g(0.21mmol)化合物4-5加入5毫升反应瓶中，加入2毫升DMF、80mg(0.59mmol)HOBT、0.2g(0.28)MMAE和0.2g(1.55mmol)DIPEA，室温反应1小时，所得反应液直接用高压制备进行纯化，得化合物LD004 0.22g，ESI-MS(m/z)：1510.9[M+H]+。
实施例十六：化合物LD005的合成
Figure BDA0002987342630000441
步骤一：(化合物5-1)的合成
将化合物3-2(3.0g，5.24mmol)溶于甲醇(40mL)，加入化合物LN027(2.95g，13.10mmol)。反应液常温反应十分钟后，分批次加入三乙酰氧基硼氢化钠(3.33g，15.71mmol)，待加入完毕后常温反应三十分钟。反应液抽滤后中压制备(41％乙腈/水)得到3.2g产品(黄色油状物)。ESI-MS(m/z)：991.5
步骤二：化合物5-2的合成
将化合物5-1(3.1g，3.13mmol)溶于DMF(20mL)中，加入二乙胺(10mL)。常温反应二十分钟。旋蒸以除去二乙胺，加水冻干后得到产品5-2。ESI-MS(m/z)：769.4
步骤三：化合物5-3的合成
将化合物5-2(500mg，0.65mmol)溶于DMF(10mL)中，加入Mc-OSu(401mg，1.30mmol)。常温搅拌过夜。中压制备(35％乙腈/水)得到260mg化合物5-3(黄色固体)。ESI-MS(m/z)：962.63
步骤四：化合物5-4的合成
将化合物5-3(50mg，0.05mmol)溶于DMF(1mL)中，加入DNPC(30mg，0.10mmol)及DIPEA(26mg，0.20mmol)。常温反应30分钟后，LCMS中控反应，中压制备纯化，冷冻干燥后得到化合物5-4，47mg，ESI-MS(m/z)：1127.5
步骤五：化合物LD005的合成
向化合物5-4粗品的DMF溶液中加入MMAE(42mg，0.06mmol)及HOBT(7mg，0.05mmol)，加入DIPEA调节pH至9～11，常温反应过夜。高压制备得12mg产品(白色固体)。ESI-MS(m/z)：1705.6.
实施例十七：LD006的合成
Figure BDA0002987342630000461
步骤一：化合物6-1的合成
将(0.2g，0.83mmol)化合物LN028溶于DMF中，加入DIPEA(0.3g，2，4mmol)及HATU(0.32g，0.83mmol)，反应半小时后加入化合物4-1(0.4g，0.5mmol)。常温反应半小时。中压制备(28％乙腈/水)得到化合物6-1，ESI-MS(m/z)：1005.52
步骤二：化合物6-2的合成
将化合物6-1(1.0g，1.00mmol)溶于DMF(20mL)中，加二乙胺(10mL)。常温反应二十分钟。旋蒸以除去二乙胺，加水冻干后得到600mg化合物6-2。ESI-MS(m/z)：783.40
步骤三：化合物6-3的合成
将化合物6-2(500mg，0.64mmol)溶于DMF(10mL)中，加入Mc-OSu(401mg，1.30mmol)。常温搅拌过夜。中压制备(30％乙腈/水)得到160mg化合物6-3(白色固体)。ESI-MS(m/z)：976.43
步骤四：化合物6-4的合成
将化合物6-3(600mg，0.61mmol)溶于DMF(10mL)中，加入DNPC(374mg，1.23mmol)及DIPEA(159mg，1.23mmol)。常温反应30分钟。中压制备(32％乙腈/水)得560mg化合物6-4(黄色固体)。ESI-MS(m/z)：1141.4
步骤五：化合物LD006的合成
将化合物6-4(0.2g，0.18mmol)溶于DMF中，加入MMAE(0.13g，0.18mmol)和HOBT(25mg，0.19mmol)，加入DIPEA(0.1g，0.78mmol)，常温反应过夜。高压制备得化合物LD1006(白色固体)。ESI-MS(m/z)：1720.8
实施例十八：化合物LD007的合成
Figure BDA0002987342630000471
步骤一：化合物7-2的合成：
将化合物3-4(0.5g，1.31mmol)及化合物7-1(WO2017/30973；(2017))(0.64g，1.31mmol)溶于DMF中，加入HATU(0.55g。1.44mmol)及DIPEA(0.5g，3.9mmol)。常温反应60分钟。中压制备(35％乙腈)得到化合物7-2，0.61g，ESI-MS(m/z)：1048.5。
步骤二：化合物7-3的合成：
将化合物7-2(0.6g，0.71mmol)溶于10毫升DMF中，加入2毫升二乙胺。常温反应二十分钟。旋蒸以除去二乙胺，加水冻干后得到化合物7-3，0.39g，ESI-MS(m/z)：826.4。
步骤三：化合物7-4的合成：
将化合物7-3(0.35g，0.55mmol)溶于DMF中，加入Mc-OSu(0.17g，0.55mmol)。常温反应过夜。中压制备(43％乙腈/水)得到化合物7-4，0.36g，ESI-MS(m/z)：1019.5。
步骤四：化合物7-5的合成：
将化合物7-4(0.35g，0.42mmol)溶于DMF中，加入DNPC(0.26g，0.85mmol)及DIPEA(0.17g，1.3mmol)。常温反应7小时。中压制备(55％乙腈/水)得到化合物7-5，0.27g，ESI-MS(m/z)：1184.5。
步骤五：化合物LD007的合成：
将化合物7-5(0.25g，0.25mmol)溶于DMF中，依次加入MMAE(0.18g，0.25mmol)、HOBT(35mg，0.25mmol)及DIPEA(97mg，0.75mmol)。常温反应5小时。中压制备(43％乙腈/水)得到化合物LD007，ESI-MS(m/z)：1763.0。
实施例十九：化合物LD008的合成
Figure BDA0002987342630000491
步骤一：化合物8-1的合成：
将化合物3-4(0.7g，1.2mmol)及化合物LN030(0.95g，1.9mmol)溶于10毫升DMF中，加入HATU(800mg，2.1mmol)及DIPEA(1.0g，7.8mmol)。常温反应60分钟。中压制备(34％乙腈/水)得到化合物8-1，0.67g，ESI-MS(m/z)：1062.5。
步骤二：化合物8-2的合成：
将化合物8-1(0.65g，0.61mmol)溶于5毫升DMF中，加入1毫升二乙胺。常温反应二十分钟。旋蒸以除去二乙胺，加水冻干后得到化合物8-2，0.43g，ESI-MS(m/z)：840.4。
步骤三：化合物8-3的合成：
将化合物8-2(0.4g，0.48mmol)溶于DMF中，加入Mc-OSu(0.2g，0.65mmol)。常温反应过夜。中压制备(43％乙腈/水)得到化合物8-3，0.33g，ESI-MS(m/z)：1033.5。
步骤四：化合物8-4的合成：
将化合物8-3(0.30g，0.29mmol)溶于DMF中，加入DNPC(192mg，0.63mmol)及DIPEA(163mg，1.26mmol)。常温反应7小时。中压制备(55％乙腈/水)得到化合物8-4，0.27g，ESI-MS(m/z)：1198.5。
步骤五：化合物LD008的合成：
将化合物8-4(0.2g，0.17mmol)溶于DMF中，依次加入MMAE(143mg，0.20mmol)、HOBT(30mg，0.22mmol)及DIPEA(90mg，0.70mmol)。常温反应5小时。中压制备(45％乙腈/水)得到LD008，135mg，ESI-MS(m/z)：1777.0。
实施例二十：化合物LD009的合成
Figure BDA0002987342630000501
将0.21g(0.23mmol)化合物3-6溶于DMF中，加入化合物9-1(CN 111499685 A)(0.28g，0.45mmol)和HOBT(35.2mg，0.26mmol)，加入DIPEA调节pH至9～10，常温反应过夜。高压制备得化合物LD009(白色固体)，0.16g。ESI-MS(m/z)：1299.6
实施例二十一：化合物LD010的合成
Figure BDA0002987342630000502
将0.25g(0.22mmol)化合物3-6溶于DMF中，加入0.12g(0.23mmol)化合物9-1(CN111499685 A)和HOBT(35.2mg，0.26mmol)，加入DIPEA调节pH至9～10，常温反应过夜。高压制备得化合物LD010(白色固体)，0.12g。ESI-MS(m/z)：1494.7
实施例二十二：化合物LD011的合成
Figure BDA0002987342630000511
将0.21g(0.23mmol)化合物3-6溶于DMF中，加入0.11g(0.24mmol)exatecan和HOBT(35.2mg，0.26mmol)，加入DIPEA调节pH至9～10，常温反应过夜。高压制备得化合物LD011(白色固体)，0.14g。ESI-MS(m/z)：1299.6
实施例二十三：化合物LD012的合成
Figure BDA0002987342630000512
将0.25g(0.22mmol)化合物5-4溶于DMF中，加入0.11g(0.24mmol)exatecan和HOBT(35.2mg，0.26mmol)，加入DIPEA调节pH至9～10，常温反应过夜。高压制备得化合物LD012(白色固体)，0.13g。ESI-MS(m/z)：1423.6
实施例二十四：化合物LD013的合成
Figure BDA0002987342630000513
将0.25g(0.21mmol)化合物3-6溶于DMF中，加入0.11g(0.24mmol)exatecan和HOBT(35.2mg，0.26mmol)，加入DIPEA调节pH至9～10，常温反应过夜。高压制备得化合物LD013(白色固体)，0.13g。ESI-MS(m/z)：1480.6。
实施例二十五：化合物LD014的合成
Figure BDA0002987342630000521
将化合物8-4(80mg，0.068mmol)溶于干燥的DMF中，依次加入exatecan(44mg，0.10mmol)、HOBT(15mg，0.11mmol)及DIPEA(40mg，0.31mmol)。常温反应八小时。中压制备(41％乙腈/水)得到产品，56mg，ESI-MS(m/z)：1494.6。
实施例二十六：化合物LD015的合成
Figure BDA0002987342630000531
步骤一：化合物15-2的合成：
将化合物15-1(0.5g，1.31mmol)及化合物7-1(WO2017/30973；(2017))(0.64g，1.31mmol)溶于DMF中，加入HATU(0.55g。1.44mmol)及DIPEA(0.5g，3.9mmol)。常温反应60分钟。中压制备(35％乙腈)得到化合物15-2，0.61g，ESI-MS(m/z)：854.4。
步骤二：化合物15-3的合成：
将化合物15-2(0.6g，0.71mmol)溶于10毫升DMF中，加入2毫升二乙胺。常温反应二十分钟。旋蒸以除去二乙胺，加水冻干后得到化合物15-3，0.39g，ESI-MS(m/z)：632.3。
步骤三：化合物15-4的合成：
将化合物15-3(0.35g，0.55mmol)溶于DMF中，加入Mc-OSu(0.17g，0.55mmol)。常温反应过夜。中压制备(43％乙腈/水)得到化合物15-4，0.36g，ESI-MS(m/z)：825.4。
步骤四：化合物15-5的合成：
将化合物15-4(0.35g，0.42mmol)溶于DMF中，加入DNPC(0.26g，0.85mmol)及DIPEA(0.17g，1.3mmol)。常温反应7小时。中压制备(55％乙腈/水)得到化合物15-5，0.27g，ESI-MS(m/z)：990.4。
步骤五：化合物LD015的合成：
将化合物15-5(0.25g，0.25mmol)溶于DMF中，依次加入MMAE(0.18g，0.25mmol)、HOBT(35mg，0.25mmol)及DIPEA(97mg，0.75mmol
)。常温反应5小时。中压制备(43％乙腈/水)得到化合物LD015，ESI-MS(m/z)：1568.9。
实施例二十七：化合物LD016的合成
Figure BDA0002987342630000541
Figure BDA0002987342630000551
步骤一：化合物16-1的合成：
将化合物3-4(0.7g，0.18mmol)及化合物LN030(0.95g，0.19mmol)溶于10毫升DMF中，加入HATU(80mg，0.21mmol)及DIPEA(100mg，0.78mmol)。常温反应60分钟。中压制备(34％乙腈/水)得到化合物16-1，0.67g，ESI-MS(m/z)：1062.5。
步骤二：化合物16-2的合成：
将化合物16-1(0.65g，0.75mmol)溶于5毫升DMF中，加入1毫升二乙胺。常温反应二十分钟。旋蒸以除去二乙胺，加水冻干后得到化合物16-2，0.43g，ESI-MS(m/z)：840.4。
步骤三：化合物16-3的合成：
将化合物16-2(0.4g，0.62mmol)溶于DMF中，加入Mc-OSu(0.2g，0.65mmol)。常温反应过夜。中压制备(43％乙腈/水)得到化合物16-3，0.37g，ESI-MS(m/z)：1033.5。
步骤四：化合物16-4的合成：
将化合物16-3(0.35g，0.42mmol)溶于DMF中，加入DNPC(192mg，0.63mmol)及DIPEA(163mg，1.26mmol)。常温反应7小时。中压制备(55％乙腈/水)得到化合物16-4，0.31g，ESI-MS(m/z)：1198.5。
步骤五：化合物LD016的合成：
将化合物16-4(0.2g，0.20mmol)溶于DMF中，依次加入MMAE(143mg，0.20mmol)、HOBT(30mg，0.22mmol)及DIPEA(90mg，0.70mmol)。常温反应5小时。中压制备(45％乙腈/水)得到LD016，135mg，ESI-MS(m/z)：1777.0。
实施例二十八：化合物LD017的合成
Figure BDA0002987342630000561
步骤一：化合物17-1的合成：
将化合物3-3(1.1g，1.38mmol)溶于DMF(10ml)中，加入二乙胺(2ml)。常温反应四小时。中压制备(30％乙腈/水)得到产品17-1(0.84g)，ESI-MS(m/z)：573.3。
步骤二：化合物17-3的合成：
将化合物17-1(840mg，0.59mmol)和17-2(505mg，0.71mmol)溶于DMF(5ml)中，加入HATU(314mg，0.83mmol)和DIPEA(152mg，1.08mmol)。常温反应2小时。中压制备(50％乙腈/水)得到产品17-3(960mg)，ESI-MS(m/z)：1264.6。
步骤三：化合物17-4的合成：
将化合物17-3(850mg)溶于5ml DMF中，加入DNPC(408mg)及DIPEA(9mg)。常温反应18小时。中压制备(40％乙腈/水)得到750mg产品，ESI-MS(m/z)：1429.6。
步骤四：化合物17-5的合成：
将化合物17-4(170mg)溶于2ml DMF中，依次加入MMAE(140mg)、HOBT(16mg)及DIPEA(50mg)。常温反应16小时。中压制备(42％乙腈/水)得到120mg产品，ESI-MS(m/z)：2008.0。
步骤五：化合物17-6的合成：
将化合物17-5(110mg)溶于2ml DMF中，加入二乙胺(0.2ml)。常温反应2小时。中压制备(30％乙腈/水)得到30mg产品，ESI-MS(m/z)：1563.9。
步骤六：化合物LD017的合成：
将化合物17-6(30mg)溶于1ml DMF中，加入DBBK(10mg)。常温反应5分钟。高压制备(60％乙腈/水)得到27mg产品，ESI-MS(m/z)：1769.7。
实施例二十九：化合物LD018的合成
Figure BDA0002987342630000581
将0.17g(0.18mmol)化合物3-6溶于干燥的2ml DMF中，依次加入HOBT(27.5mg，0.18mmol)、化合物19-6(97.3mg，0.16mmol)，用DIPEA调节碱性至pH值为9～10。常温反应1小时。中压制备(41％乙腈/水)得到化合物LD018 110mg，ESI-MS(m/z)：1400.6。
实施例三十：化合物LD019的合成：
Figure BDA0002987342630000582
Figure BDA0002987342630000591
步骤一：化合物19-2的合成：
将化合物19-1(200mg)溶于2ml DMA中，加入乙醇酸(42mg)、DIPEA(149mg)和HATU(184mg)。常温反应5分钟。中压制备(40％乙腈/水)得到180mg化合物19-2，ESI-MS(m/z)：493.2。
步骤二：化合物19-3的合成：
将化合物19-2(180mg)溶于4ml THF中，加入PNC(100mg)、DIPEA(52mg)。常温反应四小时。中压制备(40％乙腈/水)得到200mg化合物19-3，ESI-MS(m/z)：658.2。
步骤三：化合物19-5的合成：
将化合物19-3(200mg)和19-4(85mg)溶于4ml DMF中，加入HOBT(41mg)、DIPEA(77mg)。常温反应18小时。中压制备(40％乙腈/水)得到150mg化合物19-5，ESI-MS(m/z)：707.3。
步骤四：化合物19-6的合成：
将化合物19-5(150mg)溶于3ml DCM中，加入1ml TFA。常温反应2小时。中压制备(30％乙腈/水)得到140mg化合物19-6，MS：607.3。
步骤五：化合物19-7的合成：
将化合物17-4(170mg)溶于2ml DMF中，依次加入19-6(140mg)、HOBT(16mg)及DIPEA(50mg)。常温反应16小时。中压制备(42％乙腈/水)得到110mg化合物19-7，ESI-MS(m/z)：1897.8。
步骤六：化合物19-8的合成：
将化合物19-7(110mg)溶于2ml DMF中，加入二乙胺(0.2ml)。常温反应2小时。中压制备(30％乙腈)得到30mg化合物19-8，ESI-MS(m/z)：1453.6。
步骤七：化合物LD019的合成：
将化合物19-8(30mg)溶于1ml DMF中，加入DBBK(10mg)。常温反应5分钟。高压制备(60％乙腈/水)得到22mg化合物LD019，ESI-MS(m/z)：1659.5。
实施例三十一：化合物LD020的合成：
Figure BDA0002987342630000601
Figure BDA0002987342630000611
步骤一：化合物20-2的合成：
将化合物17-4(170mg)溶于2ml DMF中，依次加入20-1(120mg)、HOBT(16mg)及DIPEA(50mg)。常温反应16小时。中压制备(42％乙腈/水)得到110mg产品，ESI-MS(m/z)：2062.1。
步骤二：化合物20-3的合成：
将化合物20-2(110mg)溶于2ml DMF中，加入DEA(0.2ml)。常温反应2小时。中压制备(30％乙腈)得到50mg产品，ESI-MS(m/z)：1617.9。
步骤三：化合物LD020的合成：
将化合物20-3(50mg)溶于1ml DMF中，加入DBBK(15mg)。常温反应5分钟。高压制备(60％乙腈)得到35mg化合物LD020，ESI-MS(m/z)：1823.8。
实施例三十二：化合物LD021的合成
Figure BDA0002987342630000621
步骤一：化合物21-2的合成：
将化合物21-1(2g，4.1mmol)溶于干燥的DCM中，氮气保护下，依次加入三光气(0.49g，1.64mmol)和DMAP(1.5g，12.3mmol)，反应15min后得到化合物21-2的粗品。
步骤二：化合物21-3的合成：
将化合物3-5(1.0g，1.3mmol)溶于干燥的DMF中，然后加入化合物21-2的反应液，反应30min后，减压浓缩，出去DCM后，中压反相(60％乙腈/水)纯化，冻干得到化合物21-3，0.6g，ESI-MS(m/z)：1285.6。
步骤三：化合物LN021的合成：
将化合物21-3(0.5g，0.39mmol)溶于10mL乙腈中，然后加入3mL TFA,常温反应7h，真空浓缩后，高压制备纯化(50％乙腈/水)，冻干后得到化合物LN021，341mg，ESI-MS(m/z)：1185.5。
实施例三十三：化合物LD022的合成
Figure BDA0002987342630000631
将0.17g(0.18mmol)化合物3-6溶于干燥的2ml DMF中，依次加入HOBT(27.5mg，0.18mmol)、22-1(CN 107857798A)(124mg，0.16mmol)，用DIPEA调节碱性至pH值为9～11。常温反应1小时。中压制备(41％乙腈/水)得到产品53mg，ESI-MS(m/z)：1400.6。
实施例三十四：化合物LD023的合成
Figure BDA0002987342630000632
Figure BDA0002987342630000641
步骤一：化合物23-2的合成：
将化合物23-1(150mg，0.31mmol)及1-5(145mg，0.31mmol)溶于5毫升DMF中，加入HATU(153mg，0.40mmol)及DIPEA(120mg，0.93mmol)。常温反应15分钟后。中压制备(36％乙腈/水)得到化合物23-2，207mg，ESI-MS(m/z)：934.5。
步骤二：化合物23-3的合成：
将化合物23-2(200mg，0.21mmol)溶于2毫升DMF中，加入DNPC(100mg，0.35mmol)及DIPEA(85mg，0.66mmol)。常温反应8小时后。中压制备(52％乙腈/水)得到化合物23-3，157mg，ESI-MS(m/z)：1099.5。
步骤三：化合物LD023的合成：
将化合物23-3(150mg，0.14mmol)溶于2毫升DMF中，依次加入MMAE(98mg，0.14mmol)、HOBT(18mg，0.14mmol)及DIPEA(54mg，0.42mmol)。常温反应四小时。中压制备(43％乙腈/水)得到产品，78mg，ESI-MS(m/z)：1677.9。
实施例三十五：化合物LD024的合成
Figure BDA0002987342630000651
步骤一：取化合物3-3(4.14g，5.2mmol)，50毫升DMF加入反应瓶中，再加入二(对硝基苯)碳酸酯(3.5g，11.5mmol)和DIPEA(3.5g，27mmol)，室温反应2小时，反应结束后，所得反应液直接用中压制备进行纯化，得化合物24-1，3.4g，ESI-MS(m/z)：961.4[M+H]+。
步骤二：化合物24-2的合成：
取化合物24-1(2.0g，2.1mmol)加入250毫升反应瓶中，加入50毫升DMF、1.0g(7mmol)HOBT、2.0g(2.8mmol)MMAE和2.0g(15.5mmol)DIPEA，室温反应1小时，所得反应液直接用高压制备进行纯化，得化合物24-2，2.3g，ESI-MS(m/z)：1539.9[M+H]+。
步骤三：化合物24-3的合成：
将化合物24-2(2.12g，1.38mmol)溶于DMF(10ml)中，加入二乙胺(2ml)。常温反应四小时。中压制备(30％乙腈/水)得到产品24-3(1.6g)，ESI-MS(m/z)：1317.9。
步骤四：化合物24-5的合成：
将化合物24-4(100mg，0.25mmol)及24-3(90mg，0.068mmol)溶于DMF中，加入HATU(114mg，0.3mmol)及DIPEA(81mg，0.625mmol)。常温反应十分钟。中压制备(43％乙腈/水)得到化合物24-5，81mg，ESI-MS(m/z)：1711.0。
步骤五：化合物24-6的合成：
将化合物24-5(75mg，0.44mmol)溶于2毫升DMF中，加入0.2毫升二乙胺。常温反应二十分钟。旋蒸以除去二乙胺，加水冻干后得到化合物24-6，ESI-MS(m/z)：53mg，1488.9。
步骤六：化合物LD024的合成：
将化合物24-6(50mg，0.34mmol)溶于2毫升DMF中，加入Mc-OSu(16mg，0.05mmol)。常温反应过夜。中压制备(41％乙腈/水)得到化合物LD024，31mg，ESI-MS(m/z)：1682.0。
实施例三十六：化合物LD025的合成
Figure BDA0002987342630000671
步骤一：化合物25-2的合成：
将化合物25-1(80mg，0.23mmol)及24-3(90mg，0.068mmol)溶于DMF中，加入HATU(114mg，0.3mmol)及DIPEA(81mg，0.625mmol)。常温反应十分钟。中压制备(40％乙腈/水)得到化合物25-2，71mg，ESI-MS(m/z)：1653.9。
步骤二：化合物25-3的合成：
将化合物25-2(65mg，0.40mmol)溶于2毫升DMF中，加入0.2毫升二乙胺。常温反应二十分钟。旋蒸以除去二乙胺，加水冻干后得到化合物25-3，47mg，ESI-MS(m/z)：1431.9。
步骤三：化合物LD025的合成：
将化合物25-3(40mg，0.028mmol)溶于DMF中，加入Mc-OSu(13mg，0.042mmol)。常温反应过夜。中压制备(38％乙腈/水)得到化合物LD025 21mg，ESI-MS(m/z)：1624.9。
实施例三十七：化合物LD026的合成
Figure BDA0002987342630000681
将化合物26-1(300mg，0.2mmol)加入3毫升二氯甲烷中，加入1.2毫升的二氯乙酸，室温反应3小时，LC-MS中控，反应结束后，浓缩，中压制备纯化后，冷冻干燥得化合物LD026，213mg，ESI-MS(m/z)：1287.8。
实施例三十八：化合物LD027的合成
Figure BDA0002987342630000691
步骤一：化合物27-2的合成
将化合物27-1(500mg，1.32mmol)溶于DMF(10mL)中，加入Mc-OSu(401mg，1.30mmol)。常温搅拌过夜。中压制备(35％乙腈/水)得到615mg化合物27-2，ESI-MS(m/z)：572.4。
步骤二：化合物27-3的合成
将化合物27-2(600mg，1.0mmol)溶于DMF(10mL)中，加入DNPC(300mg，1.0mmol)及DIPEA(130mg，1.0mmol)。常温搅拌过夜。中压制备纯化，冷冻干燥，得到570mg化合物27-3，ESI-MS(m/z)：737.4。
步骤三：化合物LD027的合成
将化合物27-3(200mg，0.27mmol)溶于2毫升DMF中，加入MMAE(194mg，0.27mmol)及DIPEA(70mg，0.54mmol)。常温搅拌过夜。中压制备纯化，冷冻干燥，得到230mg化合物LD027，ESI-MS(m/z)：1315.8。
三、包含细胞生物活性分子和连接体的化合物与抗体的偶联
下述实施例制备得到的LA001-LA027化合物中，n为4。
实施例三十九：
取1毫升Herceptin抗体(抗Her-2，10mg/mL)，其缓冲液为50mM PB，5mM EDTA，pH7.2，加入10mM的TCEP(18微升)溶液混匀，室温放置2小时，加入二甲亚砜30微升至上述溶液中，然后缓慢加入5mM的LD001的二甲亚砜溶液(93微升)，混匀，室温静置2小时，最后采用G-25凝胶柱将缓冲液置换为pH6.5的缓冲液，得到LD001与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA001，其结构如下所示。
Figure BDA0002987342630000701
实施例四十：
采用与实施例三十九类似的方法，将LD001替换为LD002，得到LD002与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA002，其结构如下所示。
Figure BDA0002987342630000702
实施例四十一：
采用与实施例三十九类似的方法，将LD001替换为LD003，得到LD003与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA003，其结构如下所示：
Figure BDA0002987342630000711
化合物LA003的HIC-HPLC图如图1所示。
实施例四十二：
采用与实施例三十九类似的方法，将LD001替换为LD004，得到LD004与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA004，其结构如下所示：
Figure BDA0002987342630000712
LA004的HIC-HPLC图如图2所示。
实施例四十三：
采用与实施例三十九类似的方法，将LD001替换为LD005，得到LD005与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA005，其结构如下所示：
Figure BDA0002987342630000713
LA005的HIC-HPLC图如图3所示。
实施例四十四：
采用与实施例三十九类似的方法，将LD001替换为LD006，得到LD006与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA006，其结构如下所示：
Figure BDA0002987342630000721
LA006的HIC-HPLC图如图4所示，SEC-HPLC图如图5所示。根据SEC保留时间及峰面积比例，可以确认主要偶联产物仍然保持抗体的完整结构。
实施例四十五：
采用与实施例三十九类似的方法，将LD001替换为LD007，得到LD007与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA007，其结构如下所示：
Figure BDA0002987342630000722
实施例四十六：
采用与实施例三十九类似的方法，将LD001替换为LD008，得到LD008与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA008，其结构如下所示：
Figure BDA0002987342630000731
实施例四十七：
取1毫升Herceptin抗体(抗Her-2，10mg/mL)，其缓冲液为50mM PB，5mM EDTA，pH7.2，加入10mM的TCEP(67微升)溶液混匀，室温放置2小时，用脱盐柱将还原后的抗体分离，缓冲液为50mM PB，5mM EDTA，浓缩至1毫升，然后缓慢加入5mM的LD009的二甲亚砜溶液(160微升)，混匀，室温静置2小时，最后采用G-25凝胶柱将缓冲液置换为pH6.5的缓冲液，得到LD009与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA009，其结构如下所示：
Figure BDA0002987342630000732
LA009的HIC-HPLC图如图6所示。
实施例四十八：
采用与实施例四十七类似的方法，将LD009替换为LD0010，得到LD010与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA010，其结构如下所示：
Figure BDA0002987342630000741
实施例四十九：
采用与实施例四十七类似的方法，将LD009替换为LD0011，得到LD011与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA011，其结构如下所示。
Figure BDA0002987342630000742
实施例五十：
采用与实施例四十七类似的方法，将LD009替换为LD012，得到LD012与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA012，其结构如下所示。
Figure BDA0002987342630000743
实施例五十一：
采用与实施例四十七类似的方法，将LD009替换为LD013，得到LD013与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA013，其结构如下所示。
Figure BDA0002987342630000751
实施例五十二：
采用与实施例四十七类似的方法，将LD009替换为LD014，得到LD014与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA014，其结构如下所示。
Figure BDA0002987342630000752
实施例五十三：
采用与实施例三十九类似的方法，将LD001替换为LD015，得到LD015与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA015，其结构如下所示。
Figure BDA0002987342630000753
实施例五十四：
采用与实施例三十九类似的方法，将LD001替换为LD016，得到LD016与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA016，其结构如下所示。
Figure BDA0002987342630000761
实施例五十五：
采用与实施例三十九类似的方法，将LD001替换为LD017，得到LD017与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA017，其结构如下所示。
Figure BDA0002987342630000762
实施例五十六：
采用与实施例四十七类似的方法，将LD009替换为LD018，得到LD018与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA018，其结构如下所示。
Figure BDA0002987342630000763
实施例五十七：
采用与实施例四十七类似的方法，将LD009替换为LD019，得到LD019与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA019，其结构如下所示。
Figure BDA0002987342630000771
实施例五十八：
采用与实施例三十九类似的方法，将LD001替换为LD020，得到LD020与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA020，其结构如下所示。
Figure BDA0002987342630000772
实施例五十九：
采用与实施例四十七类似的方法，将LD009替换为LD021，得到LD021与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA021，其结构如下所示。
Figure BDA0002987342630000773
实施例六十：
采用与实施例三十九类似的方法，将LD001替换为LD022，得到LD022与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA022，其结构如下所示。
Figure BDA0002987342630000781
实施例六十一：
采用与实施例三十九类似的方法，将LD001替换为LD023，得到LD023与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA023，其结构如下所示。
Figure BDA0002987342630000782
实施例六十二：
采用与实施例三十九类似的方法，将LD001替换为LD024，得到LD024与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA024，其结构如下所示。
Figure BDA0002987342630000783
实施例六十三：
采用与实施例三十九类似的方法，将LD001替换为LD025，得到LD025与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA025，其结构如下所示。
Figure BDA0002987342630000791
实施例六十四：
采用与实施例三十九类似的方法，将LD001替换为LD025，得到LD025与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA026，其结构如下所示。
Figure BDA0002987342630000792
实施例六十五：
采用与实施例三十九类似的方法，将LD001替换为LD025，得到LD025与Herceptin抗体偶联的产物，命名为LA027，其结构如下所示。
Figure BDA0002987342630000793
四、细胞活性测试
试剂
10mM的毒素小分子和毒素连接子样品的溶液使用100％DMSO制备。抗HER2抗体药物偶联物(ADC)的所有样品均以PBS形式提供。
细胞培养
活性测试中使用的细胞系购自美国Type Culture Collection(ATCC；Manassas，VA)，培养基(Gibco ThermoFisher；Waltham,美国马萨诸塞州)，加有10％热灭活的胎牛血清(FBS；Corning；美国纽约州Corning)和1X青霉素-链霉素(Corning)，并按常规在RPMI-1640(HCC1954和SK-BR-3)或DMEM：F-12(MDA-MB-468)，保持在37℃下5％的CO2加湿环境中培养。
细胞活力测定
通过用Cell Stripper Dissociation Reagent(Corning)进行非酶解分离来收获肿瘤细胞，将其接种到384孔平底白壁板中(在12.5μL全培养基中每孔875细胞)，并在37℃保持2-4小时让细胞黏附。然后将细胞用12.5μL最终浓度为2X(连续稀释)的测试试剂处理，将其在37℃下孵育120小时。根据仪器制造商的使用方案，使用
Figure BDA0002987342630000801
2.0细胞生存力测定法(Promega；美国威斯康星州麦迪逊)，确定对癌细胞生长的抑制作用。使用TecanSpark多模式酶标仪(Tecan Group Ltd.；瑞士曼多夫)测量发光。
数据分析
使用Microsoft Excel(美国华盛顿州雷德蒙德)用未加测试样品处理的对照将数据归一化，并使用GraphPad Prism软件(版本8；美国加利福尼亚州拉霍亚)进行分析。使用适合于4参数对数方程的非线性回归分析，从剂量响应曲线得出半数抑制最大有效浓度(EC50)。ADC的治疗窗口定义为抗原阴性和抗原阳性细胞系之间EC50的比率。
结果
含磷酰胆碱链接有效载荷对ADC活性的影响
通过与HER2靶向抗体偶联形成抗体药物偶联物(ADC)，测试了含磷酰胆碱连接子的ADC对细胞毒素活性的影响。在ADC系列中，磷酰胆碱功能基被引入：(1)Val-Lys二肽的Lys侧链，(2)直接和Gly/Ser-Val-Cit/Lys三肽内的Gly或Ser相连。如图8(A)和下表1所示，在系列1四个含磷酰胆碱修饰的Lys侧链(LA003-LA006)的MMAE有效载荷ADC之间，未观察到针对HER2阳性HCC1954和SK-BR-3细胞的明显活性差异。通过比较，这些含磷酰胆碱修饰的Val-Lys二肽接头ADC的活性比未修饰的Val-Lys接头ADC对照(LA026)略强，但活性却比Val-N-二甲基Lys修饰对照(LA027)小。然而，值得注意的是，在HER2阴性的MDA-MB-468乳腺癌细胞中，LA004的效能
Figure BDA0002987342630000811
高于非磷酰胆碱修饰修饰的ADC对照，而LA003、LA005和LA006与对照组相比均显示出明显降低的活性。观察到LA003和LA006的治疗窗口明显增加。
对于系列2中包含MMAE有效载荷的含磷酰胆碱修饰的ADC，在两个抗-HER2ADC中评估了Ser-Val-Cit/Gly-Val-Cit三肽中Ser(O-PC)或Gly(N-PC)的含磷酰胆碱修饰的偶联物LA015和LA016。结果显示在HER2阳性HCC1954和SK-BR-3及HER2阴性MDA-MD-468中，Gly(N-PC,LA016)修饰的效力始终比Ser(O-PC,LA015)高1.3-2.5倍。MDA-MB-468细胞(图8，B；表1)。如预期的那样，LA015和LA016在HCC1954和SK-BR-3中显示出比单独的MMAE更高的靶向特异性，但在MDA-MB-468细胞中却没有。在具有含磷酰胆碱修饰的三肽的ADC和与将磷酰胆碱修饰的组成连接至Val-Lys二肽接头的Lys侧链的ADC之间(LA003-LA006)，几乎没有观察到活性差异。
接下来，在系列3中将含磷酰胆碱修饰连接到Lys的侧链和/或直接连接到二肽或三肽抗HER2-MMAE或DXd ADC的Ser上的效果与未经含磷酰胆碱修饰修饰的ADC对照进行了比较。与带有马来酰亚胺偶联的(McVCMMAE,LN360-66-1)或C-Lock的(C-Lock-VCMMAE,LN360-66-3)的抗HER2ADC相比，在LA007的Ser-Val-Lys接头添加两个含磷酰胆碱修饰基团不会影响活性。尽管所有三个ADC都显示出与HER2阳性SK-BR-3(EC50 0.01至0.03nM)和HCC1954(EC50 0.03至0.05nM)和HER2阴性MDA-MB-468(EC50>20nM)相当的细胞毒活性，包含两个PC组的LA007的治疗窗口最大(图8，C；表1)。
最后，在系列4中，针对带有Gly-Gly-Phe-Gly-DXd药物接头LN360-64-1的对照ADC评估了带有含磷酰胆碱修饰的Val-Lys(LA011)或Ser(O-PC)-Val-Lys(LA013)连接子的抗HER2-DXd ADC。与SK-BR-3细胞中的(LN360-64-1)(EC50为0.04568nM)相比，LA011(EC50为0.07640nM)和LA013(EC50为0.1824nM)的偶联物导致活性适度降低2-4倍，LA011在HCC1954细胞中显示出比LN360-64-1高13倍的活性(图8，D；表1)。LA011和LA013的HER2靶向特异性也保留。
LN360-66-1
Figure BDA0002987342630000821
LN360-66-3
Figure BDA0002987342630000822
LN360-64-1
Figure BDA0002987342630000823
表1：含磷酰胆碱修饰的抗HER2ADC对人乳腺癌细胞的效力
Figure BDA0002987342630000831
Figure BDA0002987342630000841
五、溶解度实验
仪器：Mettler天平XPE105
供试品名称：
VL(PC)-PAB(3-4)：
Figure BDA0002987342630000842
MC-VL(PC)-PAB(3-5)：
Figure BDA0002987342630000843
VC-PAB：
Figure BDA0002987342630000851
MC-VC-PAB：
Figure BDA0002987342630000852
实验步骤
分别称取100mg的MC-VL(PC)-PAB(3-5)、100mg的VL(PC)-PAB(3-4)、100mg的VC-PAB、100mg的MC-VC-PAB放置于不同的10ml顶空瓶中，按下表2的顺序加入相应体积的超纯水，每隔5分钟强力振摇30秒钟，观察30分钟内的溶解情况，如无目视可见的溶质颗粒时，即视为完全溶解。
表2
序号 加入溶剂体积 备注
1 0.1ml
2 0.9ml
3 2ml
4 7ml
5 100ml 将4转移至100ml量瓶中，加超纯水至刻度线
6 1000ml 将5转移至1000ml量瓶中，加超纯水至刻度线
实验结果
结果显示，100mg的VL(PC)-PAB在1ml超纯水中完全溶解，100mg的MC-VL(PC)-PAB在3ml超纯水中完全溶解，100mg的VC-PAB在1000ml超纯水中有目视可见的溶质颗粒，100mg的MC-VC-PAB在1000ml超纯水中有目视可见的溶质颗粒。
因此，VL(PC)-PAB在水中的溶解度>100mg/ml，MC-VL(PC)-PAB在水中的溶解度>33mg/ml，VC-PAB在1000ml在水中的溶解度<0.1mg/ml，MC-VC-PAB在水中的溶解度<0.1mg/ml。按完全溶解和未完全溶解来定性比较，含磷酰胆碱修饰的二肽连接子VL(PC)-PAB和MC-VL(PC)-PAB的水溶性分别比常规的VC-PAB和MC-VC-PAB至少大1000倍和330倍。
此外，采用HIC法检测LA003、LA005和对照Her2-McVCPABMMAE的水溶性。结果如图9所示。

Claims (20)

1.下式I所示的磷酰胆碱基团修饰的氨基酸：
R1-L1-N(R2)-R3 (I)
式I中：
R1为磷酰胆碱基团；
N代表氨基酸分子上的氮原子；
R2为H、C1-C4烷基或-L1-磷酰胆碱基团；
各L1独立为连接基团；
R3代表氨基酸分子上除所示N原子外的其余部分，所述其余部分任选地被保护基团保护。
2.如权利要求1所述的氨基酸，其特征在于，
所述磷酰胆碱基团如下式所示：
Figure FDA0002987342620000011
式中，波浪线表示该磷酰胆碱基团与L1连接的位置；和/或
所述各L1独立表示为-La-Lb-，其中La选自C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基或C2-C6亚炔基；Lb不存在，或者为羰基、酯基(-COO-)、-O-SO2-或-NH-SO2-；优选地，Lb不存在或为羰基；优选地，L1通过Lb与所述N共价连接；优选地，Lb和所示的N形成酰胺基或磺酰氨基；优选地，各L1独立为C1-C6亚烷基或C1-C6亚烷基羰基；和/或
R3所述的氨基酸分子选自：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、硒半胱氨酸、吡咯赖氨酸和鸟氨酸；优选地，所述氨基酸分子选自：赖氨酸、鸟氨酸、缬氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸；更优选地，所述氨基酸分子选自：缬氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸、甘氨酸和瓜氨酸。更优选地，所述氨基酸分子选自：鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸和甘氨酸；和/或
所述N不是氨基酸分子中的芳基、杂芳基或杂环基上的环氮原子，或所述N不是氨基酸分子中用来形成肽键的氮原子。
3.如权利要求1所述的氨基酸，其特征在于，所述修饰的氨基酸选自LN001至LN010以及LN012至LN025中任一所示的化合物。
4.一种磷酰胆碱修饰的肽，其特征在于，所述肽至少包括一个磷酰胆碱基团，所述磷酰胆碱基团与所述肽所含的1个或多个氨基酸的N原子和/或氧原子经由连接基团共价连接；优选地，本申请所述的肽具有2-10个氨基酸残基，更优选具有2-5个氨基酸残基；优选地，所述磷酰胆碱基团和连接基团如权利要求2所定义。
5.如权利要求4所述的肽，其特征在于，所述肽为可被病理环境中的酶水解的肽；优选地，所述酶可为蛋白水解酶、蛋白酶或肽酶。更优选地，所述酶选自：半胱氨酸蛋白酶、天冬酰胺蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、明胶酶、金属蛋白酶和天冬酰胺肽裂解酶中的一种或多种；更有效的，所述酶为天冬酰胺内肽酶。
6.如权利要求4或5所述的肽，其特征在于：
所述肽中的氨基酸残基选自：缬氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸、甘氨酸和瓜氨酸中的一种或多种；和/或
所述肽中磷酰胆碱基团修饰的氨基酸残基选自：鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸和甘氨酸中的一个或多个；和/或
所述肽中的至少一个被磷酰胆碱基团修饰的氨基酸残基为权利要求1-3中任一项所述的磷酰胆碱基团修饰的氨基酸。
7.如权利要求4所述的肽，其特征在于，所述肽选自Val-Orn、Val-Lys、Ser-Val-Lys、Gly-Val-Lys、Ser-Val-Cit、Gly-Val-Cit、Gly-Gly-Gly-Val-Lys和Gly-Gly-Val-Lys中的一种或多种；选地，所述肽中的鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸和甘氨酸中的一个或多个被磷酰胆碱基团修饰。
8.如权利要求4所述的肽，其特征在于，所述肽选自下组中的一个或多个：
Figure FDA0002987342620000031
Figure FDA0002987342620000041
9.具有下式II所示结构的连接子化合物：
R4-L2-P-R5 (II)
式中：
R4为可与蛋白中的半胱氨酸残基中的巯基或赖氨酸残基上的游离氨基发生反应、从而将式II连接到蛋白的基团；
L2为连接基团；
P为权利要求1-3中任一项所述的氨基酸或权利要求4-8中任一项所述的肽；所述氨基酸或肽与L2和R5共价连接；
R5为：
Figure FDA0002987342620000042
其中，R6为H、卤素、C1-10烷基、C3-C8环烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C3-C8环烯基、6-14元芳基、芳烷基、5-10元杂芳基或4-10元杂环基；R9为H、-C(O)-N(R7)-(CH2)n-NHR8或硝基取代的苯氧基羰基；R7为H或C1-6烷基；R8为H或C1-6烷基；和n为1-6的整数。
10.如权利要求9所述的连接子化合物，其特征在于，R4选自：
Figure FDA0002987342620000043
Figure FDA0002987342620000051
其中，波浪线表示R4与L2连接的位置；F5表示5个氟原子。
11.如权利要求9或10所述的连接子化合物，其特征在于，L2为-La-Lb-，其中La选自C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基或C2-C6亚炔基；Lb不存在，或者为羰基、酯基(-COO-)、-O-SO2-或-NH-SO2-；优选地，Lb不存在或为羰基；优选地，L2通过Lb与所述P共价连接；优选地，Lb和P间形成酰胺基或磺酰氨基；优选地，各L2独立为C1-C6亚烷基或C1-C6亚烷基羰基。
12.如权利要求9或10所述的连接子化合物，其特征在于，
所述R4-L2与P以及通过选自酰胺基(-CO-NH-)、酯基(-COO-)、-O-SO2-NH-和-NH-SO2-NH-的连接方式共价连接；优选地，R4-L2与P通过酰胺基共价连接；和/或
R4与L2之间通过选自碳碳单键、酰胺基(-CO-NH-)、酯基(-COO-)、-O-SO2-NH-和-NH-SO2-NH-的连接方式共价连接，优选通过碳碳单键进行共价连接；和/或
所述P与R5通过选自酰胺基(-CO-NH-)、酯基(-COO-)、-O-SO2-NH-和-NH-SO2-NH-的连接方式共价连接，优选通过酰胺基共价连接。
13.如权利要求9-12中任一项所述的连接子化合物，其特征在于，
R5为：
Figure FDA0002987342620000052
Figure FDA0002987342620000061
和/或
R6为H或C1-C6烷基；和/或
R7为H或C1-C4烷基；和/或
R8为H或C1-C4烷基；和/或
n为1-4的整数。
14.如权利要求9所述的连接子化合物，其特征在于，所述式II化合物如化合物1-8、1-9、2-6、2-7、3-5、3-6、4-4、4-5、5-3、5-4、6-3、6-4、7-4、7-5、8-3、8-4、15-4、15-5、16-3、16-4、23-2或23-3所示。
15.下式III所示的与权利要求9-14中任一项所述的连接子化合物共价连接的药物：
R4-L2-P-R5-D (III)
式中：R4、L2、P和R5如权利要求9-14中任一项所述；D表示药物分子去除了一个H原子后获得的基团，与R5共价连接；优选地，药物分子通过与R5形成碳酸酯键(-OCO-)或氨基甲酸酯(-OCNH-)而与R5相连。
16.如权利要求15所述的药物，其特征在于，所述药物分子选自：MMAE、Duo-5、DXD、依沙替康、喜树碱、10-羟基喜树碱、拓扑替康、氟脲苷、去氧氟尿苷、阿糖胞苷、依托泊苷、氟达拉滨、卡培他滨、长春新碱、埃坡霉素B、紫杉醇、多烯紫杉醇、柔红霉素、表阿霉素、甲氨蝶呤、吉西他滨、美法仑、尼莫司汀、米托蒽醌、阿霉素和丝裂霉素；
优选地，所述药物如LD001到LD0025所示。
17.一种ADC，其结构式如下式IV所示：
A-R4-L2-P-R5-D (IV)
式中，R4、L2、P和R5如权利要求9-14中任一项所述，D如权利要求15或16所述，A为抗体或其抗原结合片段；其中，所述抗体或其抗原结合片段通过其所含有的巯基与R4共价连接。
18.如权利要求17所述的ADC，其特征在于，所述抗体选自：抗-Her2抗体，抗-EGFR抗体，抗-VEGFR抗体，抗-CD20抗体，抗-CD33抗体，抗-PD-L1抗体，抗-PD-1抗体，抗-CTLA-4抗体，抗-TNFα抗体，抗-CD28抗体，抗-4-1BB抗体，抗-OX40抗体，抗-GITR抗体，抗-CD27抗体，抗b-CD40抗体，或抗-ICOS抗体，抗-CD25抗体，抗-CD30抗体，抗-CD3抗体，抗-CD22抗体，抗-CCR4抗体，抗-CD38抗体，抗-CD52抗体，抗-补体C5抗体，抗RSV的F蛋白，抗-GD2抗体，抗-GITR抗体，抗-糖蛋白受体lib/Illa抗体，抗-ICOS抗体，抗-IL2R抗体，抗-LAG3抗体，抗-Integrinα4抗体，抗-lgE抗体，抗-PDGFRa抗体，抗-RANKL抗体，抗-SLAMF7抗体，抗-LTIGIT抗体，抗-TIM-3抗体，抗-VEGFR2抗体，抗-VISTA抗体，抗C-Met抗体，抗BCMA抗体，抗Claudin18抗体、抗Nectin-4抗体，抗CD79b抗体，和抗Trop 2抗体。
19.如权利要求17所述的ADC，其特征在于，所述ADC选自LA001至LA025中的任意一个或多个。
20.权利要求1-3中任一项所述的氨基酸、权利要求4-8中任一项所述的肽、权利要求9-14中任一项所述的连接子化合物以及权利要求15-16中任一项所述的药物在制备ADC中的应用，或在改善抗体溶解性中的应用，或者在制备用于改善抗体溶解性的制剂中的应用。
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