CN113813385A - 一种快速制备矿化光敏剂纳米药物的方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速制备矿化光敏剂纳米药物的方法和应用。本发明通过仿生矿化方式将光敏剂制备成有机‑无机复合纳米颗粒。主要步骤包括：1)先将光敏剂加入到细胞培养基中制备成混合液：2)向上述混合液中加入矿化溶液并充分混合：3)将上述溶液放入恒温培养箱中进行生物矿化，维持一定时间后，离心收集沉淀即可获得所述的矿化光敏剂纳米药物。该制备工艺简单，条件可控，可快速得到所需复合纳米颗粒，通过改变矿化时间与矿化离子浓度可以制备出80‑200nm的球形纳米颗粒，所制备的矿化光敏剂纳米药物具有良好的光敏效应，在特定波长的照射下，可有效抑制肿瘤细胞活性，呈现良好的抗肿瘤效应。

Description

一种快速制备矿化光敏剂纳米药物的方法和应用
技术领域
本发明公开了一种快速制备矿化光敏剂纳米药物的方法和应用，属于生物医学材料的技术领域。
背景技术
光敏剂是一种对光敏感的化学物质，它可以被特定波长的激光激发，产生活性氧或热效应，进而杀死肿瘤细胞，然而部分光敏剂，如酞菁类光敏剂的理化性质表现为易团聚、水溶性差，因而其靶向输送效率低效率，在肿瘤治疗中存在显著局限性。
为了提高光敏剂的作用效果，研究者们将光敏剂与纳米药物载体联系起来，通过在PEG-PMAN二嵌段共聚物胶束中高效加载酞菁锌制备了一种用于骨肉瘤光动力治疗的纳米药物，其体内体外治疗效果均优于游离酞菁锌(Yu W,Ye M,Zhu J,et al.Zincphthalocyanine encapsulated in polymer micelles as a potent photosensitizerfor the photodynamic therapy of osteosarcoma[J].Nanomedicine:Nanotechnology,Biology and Medicine,2018,14(4):1099-1110.)。然而，近年研究表明PEG等有机质递送载体存在安全性低、难降解、代谢缓慢等问题，Kozics等人展示了一项使用包覆聚乙二醇的金纳米颗粒(PEG-AuNPs)的体内毒性研究的结果，PEG-AuNPs在血液中清除缓慢，在单次给药28天后仍然检测出少量PEG-AuNPs；肝组织病理改变和生化指标(AST、ALT)的改变表明PEG-AuNPs具有潜在的肝毒性(Kozics K,Sramkova M,Kopecka K,etal.Pharmacokinetics,Biodistribution,and Biosafety of PEGylated GoldNanoparticles In Vivo[J].Nanomaterials,2021,11(7):1702-1717.)。因此，为了满足光敏剂的递送需求，需要开发一种安全无毒、易降解、无代谢问题的纳米载体。生物矿化是生物体通过生物大分子的调控生成无机矿物的过程，该矿物形成过程对生物体起到了一定的调控和保护作用，并且矿物本身具备良好的生物相容性。
仿生矿化是模拟生物矿化过程产生有机-无机复合材料的方法，基于仿生矿化策略的制备方法在有机-无机复合材料研究制备及其生物应用中显示良好的应用潜力。陈等构建了一种基于仿生矿化的长效exendin-4缓释体系，制备了100nm的矿化药物纳米颗粒，实现了exendin-4的生物相容性和缓释，该制备方法简单，成本低廉，并且矿化成分可完全被生物体吸收，无毒副作用(Chen W,Wang G,Yung B C,et al.Long-acting releaseformulation of exendin-4based on biomimetic mineralization for type 2diabetestherapy[J].ACS nano,2017,11(5):5062-5069.)。由此表明，仿生矿化作为一种制备有机-无机复合纳米药物的方法，在生物医学领域显示出良好的应用潜力。
因此，本发明将光敏剂与仿生矿化结合，旨在制备出具有优于游离光敏剂抗肿瘤活性的纳米复合药物。
发明内容
本发明在生物矿化的基础上，提供了一种快速制备矿化光敏剂纳米药物的方法和应用。本发明提供了一种制备工艺简单，具有生物安全性并可用于药物载体的矿化光敏剂纳米药物的制备方法。本发明的制备方法所制备的矿化光敏剂纳米药物具有良好的生物相容性和光敏效应，在特定波长光的照射下可有效抑制癌细胞的活性，呈现良好的抗肿瘤效应。
为解决技术问题，本发明首先提供了一种快速制备矿化光敏剂纳米药物的方法，包括以下步骤：
将光敏剂溶液加入到动物细胞培养基中，充分混合均匀，将含阳离子溶液加入到上述混合溶液中，在恒温培养箱中矿化反应一定时间，反应完成后离心、洗涤收集沉淀，得到矿化光敏剂纳米药物。
作为优选，步骤(1)中，所述动物细胞培养基优选为DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)、α-MEM或F12，其中磷酸二氢钠浓度为0.91-1.01mM。上述动物细胞培养基是广泛使用的基础培养基，含有氨基酸、维生素、无机盐等营养物质，能够支持不同哺乳动物细胞的生长。
作为优选，步骤(1)中，所述光敏剂为在水溶液中具有可溶性的光敏剂或光敏药物；所述光敏剂优选为β-(4羧基苯氧基)酞菁锌、普鲁士蓝。
作为优选，步骤(1)中，所述光敏剂溶液与动物细胞培养基的体积比为1：8.8-38.6；；所述的光敏剂溶液浓度优选为5-100μg/mL。
作为优选，步骤(2)中，所述混合溶液温度为25-37℃，优选的，步骤(1)的混合过程也控制温度为25-37℃。
作为优选，步骤(1)中，所述阳离子溶液为钙离子溶液或锰离子溶液，优选为氯化钙、硝酸钙、溴化钙、氯化锰、硝酸锰、溴化锰等水溶液，含阳离子溶液加入混合溶液中后，浓度为10mM-50mM，优选为10-20mM。
作为优选，步骤(2)中，所述优选矿化温度为25-37℃，优选矿化时间为15min-4h。
作为优选，所述的反应完成后离心、洗涤收集沉淀，具体为：离心转速为5000-12000rpm，离心时间为3-15min，离心后去离子水先洗2-3次，然后无水乙醇洗涤2-3次。
本发明还公开了一种采用上述方法制备得到的矿化光敏剂纳米药物，所制备的矿化光敏剂纳米药物形貌为球形，为无定型晶相，矿化光敏剂纳米药物尺寸范围在80-200nm。光敏剂负载量为10％左右。
本发明还提供了上述的矿化光敏剂纳米药物在制备肿瘤治疗药物或制剂中的应用。本发明所制备的矿化光敏剂纳米药物具有良好的生物相容性和光敏效应，在特定波长光的照射下可有效抑制癌细胞的活性，呈现良好的抗肿瘤效应。
本发明首次采用仿生矿化的方法矿化光敏剂纳米药物，制备方法简单，反应条件安全可控，相比于在磷酸盐缓冲溶液中所制备的无规则片状矿化物，此发明能够获得尺寸、形貌均匀可控的80nm-200nm的球状矿化光敏剂纳米药物；并通过FE-SEM、TEM、XRD、FTIR和TG等表征技术表征其颗粒的性质。
附图说明
图1为不同锰离子浓度体系矿化的β-(4羧基苯氧基)酞菁锌纳米药物(MnP&ZnPc)的矿化效率结果；
图2为锰矿化的β-(4羧基苯氧基)酞菁锌纳米药物的傅里叶红外光谱(FTIR)分析结果(10mM)；
图3为锰矿化的β-(4羧基苯氧基)酞菁锌纳米药物的场发射扫描电镜(SEM)结果(10mM)；
图4为锰矿化的β-(4羧基苯氧基)酞菁锌纳米药物的SEM元素分析能谱(EDS)结果(10mM)；
图5为锰矿化的β-(4羧基苯氧基)酞菁锌纳米药物的透射电镜(TEM)和选区电子衍射(SAED)结果(10mM)；
图6为实施例2锰矿化的β-(4羧基苯氧基)酞菁锌纳米药物的TEM结果；
图7为实施例2钙矿化的β-(4羧基苯氧基)酞菁锌纳米药物的TEM结果；
图8为不同锰离子浓度体系矿化普鲁士蓝纳米药物(MnP&PB)的矿化效率结果；
图9为锰矿化普鲁士蓝纳米药物的傅里叶红外光谱(FTIR)分析结果(10mM)；
图10为锰矿化普鲁士蓝纳米药物的发射扫描电镜(SEM)结果(10mM)；
图11为锰矿化普鲁士蓝纳米药物的SEM元素分析能谱(EDS)结果(10mM)；
图12为锰矿化普鲁士蓝纳米药物的透射电镜(TEM)和选区电子衍射(SAED)结果(10mM)；
图13为不同钙离子浓度体系矿化普鲁士蓝纳米药物(CaP&PB)的矿化效率结果；
图14为20mM组别钙矿化普鲁士蓝纳米药物的傅里叶红外光谱(FTIR)分析结果；
图15为20mM组别钙矿化普鲁士蓝纳米药物的场发射扫描电镜(SEM)结果；
图16为20mM组别钙矿化普鲁士蓝纳米药物的SEM元素分析能谱(EDS)结果；
图17为20mM组别钙矿化普鲁士蓝纳米药物的透射电镜(TEM)和选区电子衍射(SAED)结果；
图18为锰矿化的β-(4羧基苯氧基)酞菁锌纳米药物的浓度梯度对小鼠乳腺癌(4T1)细胞的细胞毒性实验结果图。
图19为锰矿化普鲁士蓝纳米药物的浓度梯度对小鼠乳腺癌(4T1)细胞的细胞毒性实验结果图。
图20为钙矿化普鲁士蓝纳米药物的浓度梯度对小鼠乳腺癌(4T1)细胞的细胞毒性实验结果图。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明此发明。
实施例1
(1)配置不同锰离子终浓度的反应体系，配置方法为：取50μL浓度为89.2μM的β-(4羧基苯氧基)酞菁锌溶液加入到1930μL DMEM细胞培养基中，每组分别加入一定量的1M氯化锰水溶液(2-20μL)，再加水补充体系体积为2mL，使加入锰离子的终浓度分别为1、2、4、6、8、10mM，β-(4羧基苯氧基)酞菁锌的最终浓度为2.2μM。
(2)将上述溶液放入恒温培养箱中进行矿化，反应温度为37℃，反应时间30min后，溶液中出现蓝色浑浊的矿化物。
(3)将上述矿化液用5000-12000rpm转速离心5min得到蓝色沉淀，沉淀用去离子水洗涤2-3次，再用无水乙醇洗涤2-3次，冷冻干燥得到锰矿化的β-(4羧基苯氧基)酞菁锌纳米药物(MnP&ZnPc)。矿化结束后通过上清中的β-(4羧基苯氧基)酞菁锌得荧光强度算得矿化效率。
所得锰矿化的β-(4羧基苯氧基)酞菁锌纳米药物(MnP&ZnPc)通过UV，FTIR，FE-SEM，TEM，XRD等技术进行表征。图1为不同锰离子浓度的锰矿化的β-(4羧基苯氧基)酞菁锌纳米药物(MnP&ZnPc)的矿化效率结果，其中10mM组的锰矿化的β-(4羧基苯氧基)酞菁锌纳米药物(MnP&ZnPc)的矿化效率为98％说明本发明方法矿化效率高。图2为10mM组所得产物的傅里叶红外光谱(FTIR)分析结果，图3为10mM组所得产物的场发射扫描电镜(SEM)结果，图4为10mM组所得产物的其SEM元素分析能谱(EDS)结果，图5为10mM组所得产物的透射电镜(TEM)和选区电子衍射(SAED)结果。从图中可见，10mM组矿化效率高，其所得产物形貌为球形，尺寸在100-200nm范围，能够检测出同时含有磷酸锰和β-(4羧基苯氧基)酞菁锌的特征元素Mn、Zn，并且晶型为无定型晶相。
实施例2
(1)以PBS配置分别配置锰离子和钙离子矿化反应体系：每组均取50μL浓度为89.2μM的β-(4羧基苯氧基)酞菁锌溶液加入到1850μL PBS中，锰离子组加入1M氯化锰水溶液100μL；钙离子组加入1M氯化钙水溶液100μL，每组总体积均为2000μL；锰离子组的锰的终浓度为50mM，钙离子组的钙的终浓度为50mM，两组中，β-(4羧基苯氧基)酞菁锌的最终浓度为2.2μM。
(2)将上述溶液分别放入恒温培养箱中进行矿化，反应温度为37℃，反应时间60min后，溶液中分别出现蓝色浑浊的矿化物。
(3)将上述矿化液分别用5000-12000rpm转速离心5min分别得到蓝色沉淀，沉淀用去离子水洗涤2-3次，再用无水乙醇洗涤2-3次，冷冻干燥分别得到锰矿化的β-(4羧基苯氧基)酞菁锌纳米药物(MnP&ZnPc)和钙矿化的β-(4羧基苯氧基)酞菁锌纳米药物(CaP&ZnPc)。
所得锰矿化的β-(4羧基苯氧基)酞菁锌纳米药物(MnP&ZnPc)和钙矿化的β-(4羧基苯氧基)酞菁锌纳米药物(CaP&ZnPc)通过TEM技术进行表征。图6为锰矿化的β-(4羧基苯氧基)酞菁锌纳米药物的TEM结果，为不规则梯形状片状物并且尺寸较大；图7为钙矿化的β-(4羧基苯氧基)酞菁锌纳米药物的TEM结果，为不规则四边形状片状物并且尺寸较大。
实施例3
(1)配置不同锰离子终浓度的反应体系，配置方法为：取200μL浓度为116.4μM的普鲁士蓝溶液加入到1760μLDMEM细胞培养基中，每组加入一定量1M氯化锰水溶液(2-40μL)，加水补充体系体积为2mL，使加入锰离子的终浓度分别为1、2、4、6、8、10、20mM，普鲁士蓝的最终浓度为11.6μM。
(2)将上述溶液放入恒温培养箱中进行矿化，反应温度为37℃，反应时间15min后，溶液中出现蓝色浑浊的矿化物。
(3)将上述矿化液用5000-12000rpm转速离心5min得到蓝色沉淀，沉淀用去离子水洗涤2-3次，再用无水乙醇洗涤2-3次，冷冻干燥得到锰矿化普鲁士蓝纳米药物(Mn&PB)。矿化结束通过离心沉淀，测得沉淀的紫外吸收算得矿化效率。
所得锰矿化普鲁士蓝纳米药物(MnP&PB)通过UV，FTIR，FE-SEM，TEM，XRD等技术进行表征，图8为不同浓度组别的锰矿化普鲁士蓝纳米药物(MnP&PB)的矿化效率结果，图中可见，6mM组的锰矿化普鲁士蓝纳米药物(MnP&PB)的矿化效率为85％，说明本发明方法矿化效率高。图9为锰矿化普鲁士蓝纳米药物的傅里叶红外光谱(FTIR)分析结果；图10为10mM组的锰矿化普鲁士蓝纳米药物的发射扫描电镜(SEM)结果；图11为10mM组的锰矿化普鲁士蓝纳米药物的SEM元素分析能谱(EDS)结果；图12为10mM组的锰矿化普鲁士蓝纳米药物的透射电镜(TEM)和选区电子衍射(SAED)结果，从图中可见，所得产物形貌为球形，尺寸在80-150nm范围，能够检测出同时含有磷酸锰和普鲁士蓝的特征元素Mn、Fe，并且晶型为无定型晶相。
实施例4
(1)配置不同钙离子终浓度的反应体系，配置方法为：取200μL浓度为116.4μM的普鲁士蓝溶液加入到1760μLDMEM细胞培养基中，每组加入一定量1M氯化钙水溶液(2-80μL)，加水补充体系体积为2mL，使加入钙离子的终浓度分别为2、4、6、8、10、20、40mM，普鲁士蓝的最终浓度为11.6μM。
(2)将上述溶液放入恒温培养箱中进行矿化，反应温度为37℃，反应时间15min后，溶液中出现蓝色浑浊的矿化物。
(3)将上述矿化液用5000-12000rpm转速离心5min得到蓝色沉淀，沉淀用去离子水洗涤2-3次，再用无水乙醇洗涤2-3次，冷冻干燥得到钙矿化普鲁士蓝纳米药物(CaP&PB)。矿化结束通过离心沉淀，测得沉淀的紫外吸收算得矿化效率。
所得钙矿化普鲁士蓝纳米药物(CaP&PB)通过UV，FTIR，FE-SEM，TEM，XRD等技术进行表征。图13为不同钙离子浓度组别的钙矿化普鲁士蓝纳米药物(CaP&PB)的矿化效率结果，从图中可以看出，40mM组别的钙矿化普鲁士蓝纳米药物(CaP&PB)的矿化效率为85％，说明本发明方法矿化效率高。图14为20mM组别钙矿化普鲁士蓝纳米药物的傅里叶红外光谱(FTIR)分析结果；图15为20mM组别钙矿化普鲁士蓝纳米药物的场发射扫描电镜(SEM)结果；图16为20mM组别钙矿化普鲁士蓝纳米药物的SEM元素分析能谱(EDS)结果；图17为20mM组别钙矿化普鲁士蓝纳米药物的透射电镜(TEM)和选区电子衍射(SAED)结果。从图中可见，20mM组别所得产物形貌为球形，尺寸在150-200nm范围，能够检测出同时含有磷酸钙和普鲁士蓝的特征元素Ca、Fe，并且晶型为无定型晶相。
实施例5
(1)将实施例1中10mM锰离子浓度组别所得锰矿化β-(4羧基苯氧基)酞菁锌纳米药物加入到DMEM细胞培养基中混合均匀，以β-(4羧基苯氧基)酞菁锌含量为准，配置0μg/mL，1μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，15μg/mL，20μg/mL浓度的锰矿化β-(4羧基苯氧基)酞菁锌纳米药物溶液，
(2)将4T1细胞以每孔8000个的密度铺满96孔板，待细胞孵育24h后吸走上清，分别加入上述各浓度药物溶液，每孔100μL，继续培养。
(3)4小时后使用660nm LED灯光照10min。
(4)12小时后，每孔加入15μL的5mg/mL MTT溶液，继续培养4小时后，吸走上清，每孔加入150μL DMSO溶液，震荡10min后使用酶标仪测490nm处吸光值。
细胞实验结果如图18所示，结果表明随着药物浓度的增加，细胞活性明显降低，表明该矿化光敏剂纳米药物具有良好的肿瘤细胞杀伤效果。
实施例6
(1)将实施例2中10mM锰离子浓度组别所得锰矿化普鲁士蓝纳米药物加入到DMEM细胞培养基中混合均匀，以普鲁士蓝含量为准，配置0μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，30μg/mL，40μg/mL浓度的锰矿化普鲁士蓝纳米药物溶液。
(2)将4T1细胞以8000个每孔的密度铺满96孔板，待细胞孵育24h后吸走上清，分别加入上述各浓度药物溶液，每孔100μL，继续放入培养箱。
(3)4小时后使用808nm激光器照5min，放入培养箱。
(4)12小时后，每孔加入15μL 5mg/mL MTT溶液，继续培养4小时后，吸走上清，每孔加入150μL DMSO溶液，震荡10min后使用酶标仪测490nm处吸光值。
细胞实验结果如图19所示，结果表明随着药物浓度的增加，细胞活性明显降低，表明该矿化光敏剂纳米药物具有良好的肿瘤细胞杀伤效果。
实施例7
(1)将实施例3中20mM钙离子浓度组别所得钙矿化普鲁士蓝纳米药物加入到细胞培养基中混合均匀，以普鲁士蓝含量为准，配置0μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，30μg/mL，40μg/mL浓度的钙矿化普鲁士蓝纳米药物溶液。
(2)将4T1细胞以8000个每孔的密度铺满96孔板，待细胞孵育24h后吸走上清，分别加入上述各浓度药物溶液，每孔100μL，继续放入培养箱。
(3)4小时后使用808nm激光器照5min，放入培养箱。
(4)12小时后，每孔加入15μL 5mg/mL MTT溶液，继续培养4小时后，吸走上清，每孔加入150μL DMSO溶液，震荡10min后使用酶标仪测490nm处吸光值。
细胞实验结果如图20所示，结果表明随着药物浓度的增加，细胞活性明显降低，表明该矿化光敏剂纳米药物具有良好的肿瘤细胞杀伤效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种快速制备矿化光敏剂纳米药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将光敏剂溶液加入到动物细胞培养基中，充分混合均匀，将含阳离子溶液加入到上述混合溶液中，在恒温培养箱中矿化反应一定时间，反应完成后离心、洗涤收集沉淀，得到矿化光敏剂纳米药物。
2.如权利要求1所述的一种快速制备矿化光敏剂纳米药物的方法，其特征在于所述光敏剂为在水溶液中具有可溶性的光敏剂或光敏药物。
3.如权利要求2所述的一种快速制备矿化光敏剂纳米药物的方法，其特征在于，所述光敏剂为β-(4羧基苯氧基)酞菁锌、普鲁士蓝。
4.如权利要求1所述的一种快速制备矿化光敏剂纳米药物的方法，其特征在于所述含阳离子溶液为钙离子溶液或锰离子溶液，含阳离子溶液加入混合溶液中后，阳离子浓度为10mM-50mM。
5.如权利要求1或4所述的一种快速制备矿化光敏剂纳米药物的方法，其特征在于所述光敏剂溶液与动物细胞培养基的体积比为1：8.8-38.6；光敏剂溶液浓度为5-100μg/mL。
6.如权利要求1所述的一种快速制备矿化光敏剂纳米药物的方法，其特征在于所述反应的温度范围为25-37℃，反应时间为15min-4h。
7.如权利要求1所述的一种快速制备矿化光敏剂纳米药物的方法，其特征在于所述的反应完成后离心、洗涤收集沉淀，具体为：离心转速为5000-12000rpm，离心时间为3-15min，离心后去离子水先洗2-3次，然后无水乙醇洗涤2-3次。
8.如权利要求1所述的一种快速制备矿化光敏剂纳米药物的方法，其特征在于所述动物细胞培养基为DMEM、α-MEM或F12，其中磷酸二氢钠浓度为0.91-1.01mM。
9.一种权利要求1-8任一项所述方法制备的矿化光敏剂纳米药物，其特征在于制备的矿化光敏剂纳米药物为球形，晶型为无定型，药物尺寸为80-200nm。
10.权利要求9所述的矿化光敏剂纳米药物在制备肿瘤治疗药物或制剂中的应用。
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