CN113813264A

CN113813264A - 雷公藤红素在制备抗冠状病毒产品中的应用

Info

Publication number: CN113813264A
Application number: CN202011237647.8A
Authority: CN
Inventors: 高伟; 赵文华; 屠李婵
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2020-11-09
Filing date: 2020-11-09
Publication date: 2021-12-21

Abstract

本发明公开了雷公藤红素在制备抗冠状病毒产品中的应用，属于医药领域的应用。采用分子对接技术证实雷公藤红素对新型冠状病毒COVID‑19的S蛋白与ACE2蛋白的抑制作用，并经亲和力实验测定其与S蛋白具有较强的亲和力，雷公藤红素在5μM到40μM范围内在细胞实验中对冠状病毒具有明显抑制作用，具有浓度依赖性。雷公藤红素是冠状病毒的特异性抑制剂具有特定的新颖性。雷公藤红素可用于制备抑制冠状病毒的产品具有广泛的实用性。

Description

雷公藤红素在制备抗冠状病毒产品中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及雷公藤红素在制备抗冠状病毒产品中的应用。

背景技术

冠状病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，冠状病毒引起的非典型肺炎的感染主要发生在冬季及早春，由病毒的包膜上的棘突形成的类似日冕的形状而得名。以目前正在流行的新型冠状病毒COVID-19冠状病毒的极大危害最具代表性，已成为国际关注的突发公共卫生事件，目前针对新型冠状病毒尚无特效治疗药物。

随着研究的深入，科学家们用X射线解析了新型冠状病毒COVID-19的主要蛋白S蛋白，ACE2以及RNA-dependent RNA polymerase等的结构（Science，2020，368: 1274-1278；Biochem J，2011，436: 53； Science，2020，368: 779-782），并进一步解析了新型冠状病毒COVID-1 9主要是通过S蛋白与ACE2的复合物形成而达到对人体的侵袭的目的（Science，2020，367: 1444-1448）。以新型冠状病毒S蛋白，ACE2以及RNA-dependent RNA polymerase等为靶点进行分子对接发现抑制剂，进一步通过阻断S蛋白与ACE2的复合物形成为抑制COVID-19对人体的侵袭，采用动力学测定亲和力参数，并采用细胞实验检测病毒抑制能力，是目前发现新型冠状病毒COVID-19抑制剂的重要途径。

以新型冠状病毒S蛋白，ACE2以及RNA-dependent RNA polymerase等为靶点蛋白进行分子对接，采用动力学测定亲和力参数，采用细胞实验检测病毒抑制能力，从天然植物中发现冠状病毒的抑制剂。发明人发现了具有明显抑制冠状病毒活性的化合物雷公藤红素。

雷公藤红素，属于三萜类化合物，英文名称Celastrol，主要存在于卫矛科植物雷公藤植物中，具有抗炎（European Journal of Pharmacology，2020，885：173371；International Immunopharmacology，2020，84：106527）、抗氧化（Chemico-BiologicalInteractions，2016，246：52）、抗肿瘤（Archives of Medical Research，2020，51：297；EBioMedicine，2019，50：81）等作用。

目前，未见雷公藤红素抗病毒的研究报道。

发明内容

本发明以分子对接，亲和力测定以及细胞病毒抑制实验作为发现冠状病毒抑制剂的手段。采用以新型冠状病毒S蛋白，ACE2以及RNA-dependent RNA polymerase为靶点蛋白进行分子对接，采用动力学测定亲和力参数，采用细胞实验检测病毒抑制能力，从天然植物中发现雷公藤红素对冠状病毒具有显著的抑制作用。

本发明的目的是提供雷公藤红素在制备冠状病毒产品中的应用。

雷公藤红素如附图1所示结构式的化合物。

雷公藤红素与S蛋白，ACE2以及新型冠状病毒RNA-dependent RNA polymerase具有较强亲和力，新型冠状病毒S蛋白通过抑制冠状病毒S蛋白与ACE2的结合，在制备抑制冠状病毒制剂中的应用。

本发明采用分子对接、动力学测定及细胞抗病毒实验评价雷公藤红素对冠状病毒的抑制作用，雷公藤红素能够抑制新型冠状病毒关键蛋白。采用细胞实验评价雷公藤红素的抗病毒作用，雷公藤红素对冠状病毒有显著的抑制作用。

本发明的雷公藤红素在制备抗病毒产品的应用的优点为作用机制明确，抑制效果显著。雷公藤红素可以从雷公藤中分离。

本发明提供用本发明所述的雷公藤红素及其药物制剂：气雾剂、片剂、糖衣片剂、注射剂、注射乳剂、冻干粉针、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微胶囊剂、微囊剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、散剂、膏剂、口服液、混悬液、溶液以及缓释或控释制剂。

附图说明

图1：本发明雷公藤红素结构式

图2：本发明实施例1的分子对接图

图3：本发明实施例2的分子对接图

图4：本发明实施例3的分子对接图

图5：本发明实施例4的亲和力图

图6：本发明实施例5的亲和力图

图7：本发明实施例6的亲和力图。

具体实施方式

实施例1以新型冠状病毒S蛋白为靶点蛋白进行分子对接

PDB 数据库下载新型冠状病毒Spike蛋白为PDB 格式，对目标蛋白S蛋白三级结构模型增加氢原子、电荷，修补丢失的氨基酸残基。选择SYBYL X-1.2软件包中的AMBER FF99力场进行能量优化。首先，选择AMBER FF99力场以最陡下降法（steepest descent，简称SD）进行1000次迭代优化。然后，采用共轭梯度法（conjugated gradient，简称CG）优化至收敛梯度为0.05 kcal/(Å mol)。通过Chem3D绘制雷公藤红素2D结构，使用Chem3D软件生成雷公藤红素3D结构，进行能量最小化，将所用小分子配体都保存为mol2格式。检查配体分子结构，将分子平面结构转换为3D结构，给分子结构加极性氢，采用Gasteiger-Hückel方法给原子加电荷，采用Tripos force力场对小分子进行1000次迭代能量优化。采用SYBYL-X 1.2软件包中Surflex-Dock模块，以Total score得分计算配体分子与蛋白质相互作用力。对接结果显示雷公藤红素与新型冠状病毒Spike蛋白的相互作用力打分为3.112（附图2），雷公藤红素与Spike蛋白具有明显的结合。

实施例2以ACE2为靶点蛋白进行分子对接

PDB 数据库下载 ACE2结构为PDB 格式，对目标蛋白ACE2三级结构模型增加氢原子、电荷，修补丢失的氨基酸残基。选择SYBYL X-1.2软件包中的AMBER FF99力场进行能量优化。迭代优化后，采用共轭梯度法优化至收敛梯度为0.05 kcal/(Å mol)。绘制雷公藤红素结构，进行能量最小化，将所用小分子配体都保存为mol2格式。然后加氢，加电荷，能量优化。以Total score得分计算配体分子与蛋白质相互作用力。对接结果显示雷公藤红素与ACE2的Total score得分为5.249（附图3），雷公藤红素与ACE2具有明显的结合。

实施例3以新型冠状病毒RNA-dependent RNA polymerase为靶点蛋白进行分子对接

PDB 数据库下载新型冠状病毒RNA-dependent RNA polymerase结构为PDB 格式，对目标蛋白RNA-dependent RNA polymerase三级结构模型增加氢原子、电荷，修补丢失的氨基酸残基。能量优化后，进行迭代优化，然后，采用CG优化至收敛梯度为0.05 kcal/(Å mol)。绘制雷公藤红素结构，进行能量最小化，将所用小分子配体都保存为mol2格式。检查配体分子结构，给分子结构加氢，加电荷，能量优化。以Total score得分计算配体分子与蛋白质相互作用力。对接结果显示雷公藤红素与新型冠状病毒RNA-dependent RNA polymerase的Total score得分为3.663（附图4），雷公藤红素与RNA-dependent RNA polymerase具有明显的结合。

实施例4 采用动力学测定雷公藤红素与新型冠状病毒S蛋白RBD结构域亲和力参数

实验芯片为 CM5，运行缓冲液为 HEPES-EP+。首先重组新型冠状病毒S蛋白RBD结构域固定在CM5 芯片上，待蛋白在芯片表面固定好之后，采用多循环动力学检测雷公藤红素与新型冠状病毒S蛋白RBD结构域的亲和力。在运行正式样品前，用运行缓冲液替代分析物样品运行 3 个 Startup 循环让系统在开始阶段模拟运行样品，以达到稳定的基线和系统状态。分析物浓度梯度为625、1250、2500、5000、10000μM，流速为 30μL/min，结合时间为 180s，解离为 320 s。0.75 mM NaOH 再生 30 s，流速为20 μL/min，再生之后稳定 60 s。实验结果显示雷公藤红素与S蛋白具有较强的亲和力（附图5），KD为84 μM。

实施例5 采用动力学测定雷公藤红素与ACE2蛋白亲和力参数

实验芯片为 CM5，运行缓冲液为 HEPES-EP+。首先重组冠状病毒ACE2固定在CM5 芯片上，待蛋白在芯片表面固定好之后，采用多循环动力学检测雷公藤红素与冠状病毒ACE2蛋白的亲和力。在运行正式样品前，用运行缓冲液替代分析物样品运行 3 个 Startup 循环让系统在开始阶段模拟运行样品，以达到稳定的基线和系统状态。分析物浓度梯度为625、1250、2500、5000、10000μM，流速为 30μL/min，结合时间为 180 s，解离为 320 s。0.75 mMNaOH 再生 30 s，流速为20 μL/min，再生之后稳定 60 s。实验结果显示雷公藤红素与ACE2蛋白具有较强的亲和力（附图6），KD为4.87 μM。

实施例6 采用动力学测定雷公藤红素与新型冠状病毒S蛋白RBD结构域- ACE2复合物亲和力参数

实验芯片为 CM5，运行缓冲液为 HEPES-EP+。首先重组冠状病毒S蛋白RBD结构域固定在CM5 芯片上，待蛋白在芯片表面固定好之后，采用多循环动力学检测雷公藤红素存在或缺失时与冠状病毒ACE2蛋白的亲和力。在运行正式样品前，用运行缓冲液替代分析物样品运行 3 个 Startup 循环让系统在开始阶段模拟运行样品，以达到稳定的基线和系统状态。分析物浓度梯度为625、1250、2500、5000、10000μM，流速为 30μL/min，结合时间为 180s，解离为 320 s。0.75 mM NaOH 再生 30 s，流速为20 μL/min，再生之后稳定 60 s。实验结果显示雷公藤红素与新型冠状病毒S蛋白RBD结构域-- ACE2复合物具有较强的亲和力（附图7），KD为3.67 nM。

实施例7采用细胞实验检测雷公藤红素病毒抑制能力

Vero9细胞的96孔板上24小时，每孔接种50微升100 TCID50的病毒液，于37℃吸附90min，弃病毒上清。根据细胞毒性实验的结果,在无毒浓度范围内，加入不同浓度的药物，并设正常细胞对照组和病毒对照组。然后将抗培养板置37 ℃，5% CO₂培养，每日观察CPE。CPE记录方法为[1]:-为无CPE；+为25%细胞出现CPE；++为50%细胞出现CPE；+++为75%细胞出现CPE；++++为100%细胞出现CPE。约在病毒对照+++~++++时用MTT法，测各孔570nm波下OD值，并按下述公式计算药物对病毒抑制率。病毒抑制率=（药物处理组OD值-病毒对照组OD值）/（细胞对照组OD值-病毒对照组OD值）*100%。实验结果显示，雷公藤红素在5 μM到40 μM范围内对冠状病毒具有明显抑制作用。

Claims

1.雷公藤红素在制备抗冠状病毒产品中的应用，其特征在于，所述雷公藤红素是如下结构的化合物：

。

2.包含一种或多种权利要求1中所述雷公藤红素或其可药用的盐与可药用载体的药物。

3.权利要求2的用途，预防和/或治疗由冠状病毒引起的感染。

4.权利要求2的用途，预防和/或治疗由新型冠状病毒引起的感染。

5.权利要求3及4的用途，其中所述受试者是人、猫、狗、猪或鸡。

6.权利要求3的用途，其中所述药物是以口服方式给药：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微胶囊剂、微囊剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、散剂、口服液、混悬液、溶液以及缓释或控释制剂。

7.权利要求4的用途，其中所述药物是以口服方式给药：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微胶囊剂、微囊剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、散剂、口服液、混悬液、溶液以及缓释或控释制剂。

8.权利要求3的用途，其中所述药物是以吸入方式给药：气雾剂以及缓释或控释制剂。

9.权利要求4的用途，其中所述药物是以吸入方式给药：气雾剂以及缓释或控释制剂。

10.权利要求3的用途，其中所述药物是以静脉方式给药：注射剂、注射乳剂、冻干粉针以及缓释或控释制剂。

11.权利要求4的用途，其中所述药物是以静脉方式给药：注射剂、注射乳剂、冻干粉针以及缓释或控释制剂。