CN113813273A - 连翘酯苷a在制备抗冠状病毒产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了连翘酯苷A在制备抗冠状病毒产品中的应用，属于医药领域的应用。采用分子对接技术证实连翘酯苷A对ACE2蛋白的抑制作用，并经亲和力实验测定其与ACE2具有较强的亲和力。抗病毒实验显示连翘酯苷A在10μM到100μM范围内对冠状病毒具有显著的抑制作用，效果与剂量呈量效关系。连翘酯苷A是冠状病毒的特异性抑制剂具有特定的新颖性，可用于制备治疗冠状病毒的产品具有广泛的实用性。

Description

连翘酯苷A在制备抗冠状病毒产品中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及连翘酯苷A在制备抗冠状病毒产品中的应用。
背景技术
冠状病毒是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒，由病毒的包膜上的棘突形成的类似日冕的形状而得名。新型冠状病毒COVID-19是目前已知的可以感染人的冠状病毒，已成为国际关注的突发公共卫生事件，目前针对抗新型冠状病毒的药物的发现是亟待解决的问题。
新型冠状病毒主要通过表达Spike蛋白RBD结构域与ACE2的复合物、3CL水解酶以及RNA-dependent RNA polymerase等蛋白(Science，2020，368:779-782；BiocAem J，2011，436:53；Science，2020，367:1444-1448)而侵袭人体。以新型冠状病毒Spike蛋白 RBD结构域与ACE2的复合物、3CL水解酶以及RNA-dependent RNA polymerase等为靶点进行分子对接发现抑制剂，进一步通过阻断S蛋白与ACE2的复合物形成为抑制COVID-19对人体的侵袭，采用动力学测定亲和力参数，并采用细胞实验检测病毒抑制能力，是目前发现新型冠状病毒COVID-19抑制剂的重要途径。
以新型冠状病毒Spike蛋白RBD结构域与ACE2的复合物、3CL水解酶以及 RNA-dependent RNA polymerase等为靶点蛋白进行分子对接，采用动力学测定亲和力参数，采用细胞实验检测病毒抑制能力，从天然植物中发现冠状病毒的抑制剂。发明人发现了具有明显抑制活性的化合物连翘酯苷A。
连翘酯苷A，属于咖啡酰基苯乙醇苷类化合物，英文名称Forsythoside A，主要存在于木樨科等植物中，具有肺损伤修复(Toxicology and applied pharmacology，2020，407， 115252；Clinical science(London，England:1979)，2020，134，2549)、骨保护(ATINAMERICAN JOURNAL OF PHARMACY，2019，3，973)及肾保护(BMC COMPLEMENTARY ANDALTERNATIVE MEDICINE，2019，19，339；FRONTIERS IN BIOSCIENCE-LANDMARK，2020，25，526)作用。
目前，未见连翘酯苷A抗冠状病毒的研究报道。
发明内容
本发明以分子对接，亲和力测定以及细胞抑制实验作为发现冠状病毒抑制剂的手段。采用以新型冠状病毒S蛋白与ACE2的复合物为靶点蛋白进行分子对接，采用动力学测定亲和力参数，采用细胞实验检测病毒抑制能力，从天然植物中发现连翘酯苷A对冠状病毒具有显著的抑制作用。
本发明的目的是提供连翘酯苷A在制备冠状病毒产品中的应用。
连翘酯苷A是如附图1所示结构式的化合物。
连翘酯苷A与S蛋白具有较强亲和力，通过抑制冠状病毒S蛋白与ACE2的结合，在制备抑制冠状病毒制剂中的应用。
本发明采用分子对接、动力学测定及细胞抗病毒实验评价连翘酯苷A对冠状病毒的抑制作用，连翘酯苷A能剂量依赖地抑制。采用细胞实验评价连翘酯苷A的抗病毒作用，连翘酯苷A对冠状病毒有显著的抑制作用。
本发明的连翘酯苷A在制备抗病毒产品的应用的优点为作用机制明确，抑制效果显著。
本发明提供用本发明所述的连翘酯苷A及其药物制剂：注射剂、注射乳剂、冻干粉针、气雾剂、片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微胶囊剂、微囊剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、散剂、膏剂、口服液、混悬液、溶液以及缓释或控释制剂。
附图说明
图1：本发明连翘酯苷A的结构式
图2：本发明实施例1的分子对接图
图3：本发明实施例4的亲和力图
具体实施方式
实施例1以新型冠状病毒3CL水解酶为靶点蛋白进行分子对接
PDB数据库下载新型冠状病毒3CL水解酶为PDB格式，去除溶剂， AutodockTools-1.5.6软件加氢、合并非极性氢、计算电荷，保存为Pdbqt格式的受体参数文件。通过CAem3D绘制小分子配体2D结构，使用CAem3D软件生成分子3D结构，进行能量最小化，将所用小分子配体都保存为mol2格式，最终生成Pdbqt格式配体参数文件。 AutodockTools-1.5.6软件设置受体蛋白的格点参数，并设置参数文本文件。运用Autodockvina 软件在linux虚拟环境下批量对接，对接结果显示连翘酯苷A与新型冠状病毒3CL水解酶具有明显的结合，结合自由能为51.47Kcal/mol。
实施例2以新型冠状病毒S蛋白与ACE2的复合物为靶点蛋白进行分子对接
PDB数据库下载ACE2-RBD结构域结构为PDB格式，pymol软件去除受体蛋白中的溶剂，加氢、合并非极性氢、计算电荷，保存为Pdbqt格式的受体参数文件。通过CAem3D 绘制小分子配体2D结构，使用CAem3D软件生成分子3D结构，进行能量最小化，将所用小分子配体都保存为mol2格式。借助AutodockTools-1.5.6的脚本文件赋予配体原子类型、计算电荷，最终生成Pdbqt格式配体参数文件。AutodockTools-1.5.6软件设置受体蛋白的格点参数，并设置参数文本文件。运用Autodockvina软件在linux虚拟环境下批量对接，对接结果显示连翘酯苷A能够嵌入S蛋白与ACE2的复合物的结合口袋，结合自由能为7.57 Kcal/mol。
实施例3以新型冠状病毒RNA-dependent RNA polymerase为靶点蛋白进行分子对接
PDB数据库下载RNA-dependent RNA polymerase为PDB格式去除受体蛋白中的溶剂，加氢、合并非极性氢、计算电荷，保存为Pdbqt格式的受体参数文件。通过CAem3D绘制小分子配体2D结构，使用CAem3D软件生成分子3D结构，能量最小化，保存为mol2格式。借助AutodockTools-1.5.6的脚本文件赋予配体原子类型、计算电荷，最终生成Pdbqt格式配体参数文件。AutodockTools-1.5.6软件设置受体蛋白的格点参数，并设置参数文本文件。运用Autodockvina软件在linux虚拟环境下批量对接，pymol 1.7Discovery Studio 3.5软件对对接结果进行可视化分析。对接结果显示连翘酯苷A与新型冠状病毒RNA-dependent RNApolymerase具有明显的结合，结合自由能为7.67Kcal/mol。
实施例4采用动力学测定与ACE2亲和力参数
实验芯片为CM5，运行缓冲液为AEPES-EP+。首先ACE2固定在CM5芯片上，待蛋白在芯片表面固定好之后，采用多循环动力学检测分析物与蛋白的亲和力。在运行正式样品前，用运行缓冲液替代分析物样品运行3个Startup循环让系统在开始阶段模拟运行样品，以达到稳定的基线和系统状态。分析物浓度梯度为625、1250、2500、5000、10000μM，流速为30μL/min，结合时间为180s，解离为320s。0.75mM NaOA再生30s，流速为20 μL/min，再生之后稳定60s。实验结果显示连翘酯苷A在15μM到500μM范围内与ACE2 具有较强的亲和力。
实施例5采用细胞实验检测病毒抑制能力
Vero9细胞的96孔板上24小时，每孔接种50微升100TCID50的病毒液，于37℃吸附90min，弃病毒上清。根据细胞毒性实验的结果，在无毒浓度范围内，加入不同浓度的药物，并设正常细胞对照组和病毒对照组。然后将抗培养板置37℃，5％CO2培养，每日观察CPE。CPE记录方法为[1]:-为无CPE；+为25％细胞出现CPE；++为50％细胞出现CPE；+++为75％细胞出现CPE；++++为100％细胞出现CPE。约在病毒对照+++～++++时用MTT法，测各孔570nm波下OD值，并按下述公式计算药物对病毒抑制率。病毒抑制率＝(药物处理组OD值- 病毒对照组OD值)/(细胞对照组OD值-病毒对照组OD值)*100％。实验结果显示，连翘酯苷 A在10μM到100μM范围内对冠状病毒具有显著的抑制作用，效果与剂量呈现量效关系。

Claims (11)

1.连翘酯苷A在制备抗冠状病毒产品中的应用，其特征在于，所述连翘酯苷A是如下结构的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
2.包含一种或多种权利要求1中所述连翘酯苷A或其可药用的盐与可药用载体的药物。
3.权利要求2的用途，预防和/或治疗由冠状病毒引起的感染。
4.权利要求2的用途，预防和/或治疗由新型冠状病毒引起的感染。
5.权利要求3及4的用途，其中所述受试者是人、猫、狗、猪或鸡。
6.权利要求3的用途，其中所述药物是以口服方式给药：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微胶囊剂、微囊剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、散剂、口服液、混悬液、溶液以及缓释或控释制剂。
7.权利要求4的用途，其中所述药物是以口服方式给药：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微胶囊剂、微囊剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、散剂、口服液、混悬液、溶液以及缓释或控释制剂。
8.权利要求3的用途，其中所述药物是以吸入方式给药：气雾剂以及缓释或控释制剂。
9.权利要求4的用途，其中所述药物是以吸入方式给药：气雾剂以及缓释或控释制剂。
10.权利要求3的用途，其中所述药物是以静脉方式给药：注射剂、注射乳剂、冻干粉针以及缓释或控释制剂。
11.权利要求4的用途，其中所述药物是以静脉方式给药：注射剂、注射乳剂、冻干粉针以及缓释或控释制剂。
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