CN113802188B

CN113802188B - 将核酸固定于固相基质表面的方法以及从液相组合物中分离物质的方法

Info

Publication number: CN113802188B
Application number: CN202110977481.1A
Authority: CN
Inventors: 董鸣; 林至诚
Original assignee: Bioisland Laboratory
Current assignee: Bioisland Laboratory
Priority date: 2021-08-24
Filing date: 2021-08-24
Publication date: 2022-07-26
Anticipated expiration: 2041-08-24
Also published as: CN113802188A

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种将核酸固定于固相基质表面的方法以及从液相组合物中分离物质的方法。该方法包括：a)将含有待固定核酸的溶液附着在所述固相基质的表面；b)对所述固相基质的表面进行照射以使得所述待固定核酸与所述固相基质的表面发生光交联；其中，所述溶液中含有3M～4M的异硫氰酸胍。高浓度的异硫氰酸胍能够有利于核酸分子在光交联过程中分散更加均匀，从而可以有效提高固定后核酸的生物学活性。

Description

将核酸固定于固相基质表面的方法以及从液相组合物中分离物质的方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种将核酸固定于固相基质表面的方法以及从液相组合物中分离物质的方法。

背景技术

在现代分子生物学和医学中，生物芯片、生物学微阵列、固定有核酸(特别是适配体)的微珠已经成为重要的工具。

这些技术中的一些的关键是在载体或材料上有效地固定化核酸。在载体上固定化核酸的经典的方法是运用紫外光，即紫外交联。Church和Gilbert在1984年描述了运用波长为254nm的紫外光导致DNA片段固定化到尼龙滤膜上(Church和Gilbert，PNAS，1984，81，p:1991-1995)。这种方法的改进版本是由Saiki等人.，PNAS，1989,86,p:6230-6234提出的，其描述了当使用波长为254nm的紫外光时包含多聚脱氧胸腺嘧啶(poly(dT))尾的寡核苷酸可以更容易地被固定到膜上。此效果归结于光激活的胸腺嘧啶碱基更有效的结合到膜上。

但是，这种固定存在核酸在固定时分布不均的问题，因而会导致部分区域核酸分布稀释甚至无核酸，另外一部分区域则会形成核酸堆叠聚集的情况，导致核酸的生物学性能的发挥受到影响。

发明内容

本发明的第一方面涉及一种将核酸固定于固相基质表面的方法，包括：

将含有待固定核酸的溶液附着在所述固相基质的表面；

对所述固相基质的表面进行照射以使得所述待固定核酸与所述固相基质的表面发生光交联；

其中，所述溶液中含有3M～4M的异硫氰酸胍(Guandine thiocyanate,GuTc)。

可选的，所述待固定核酸预先与一段单链的tag核酸序列连接并通过所述tag核酸序列与所述固相基质的表面发生光交联。

可选的，所述tag序列包含PolyT和/或PolyC序列。

可选的，所述tag序列为8～12个连续的T和8～12个连续的C相连所得序列。

可选的，所述溶液中还含有盐离子；

可选的，所述盐离子为0.3M～0.7M的钠和/或钾离子；

可选的，所述溶液的pH为6～8。

可选的，所述溶液中还含有缓冲组分。

可选的，所述缓冲组分为15mM～25mM的Tris-HCl。

可选的，所述溶液的溶剂为水。

可选的，可选的，步骤a)之后步骤b)之前还还包括，将附着有溶液的所述固相基质与乙醇共混，其中所述溶液和乙醇的体积比为1：(0.8～1.2)。

可选的，所述待固定核酸在所述溶液中的浓度0.1μM～0.7μM。

可选的，所述待固定核酸是DNA、RNA、PNA、CNA、HNA、LNA或ANA，或其组合。

可选的，所述待固定核酸是单链的或者双链的。

可选的，所述固相基质的材质包括纸、硝酸纤维素、玻璃和塑料中的一种或多种。

可选的，所述固相基质为多孔板、膜、微珠中的至少一种。

可选的，所述光交联所使用的光的波长为250nm～260nm。

可选的，所述待固定核酸是适配体。

可选的，所述待固定核酸是能够特异性识别并结合外泌体表面标志物的外泌体。

可选的，所述表面标志物选自CD63、CD9、CD81、HSP70、Tsg101、EpCam、flotillin、Syntenin、Alix、HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5以及a-1AT中的至少一种。

本发明的第二方面涉及由如上所述方法固定得到的负载有核酸的固相基质。

本发明的第三方面涉及从液相组合物中分离物质的方法，用如上所述的固相基质与含有待分离物质的溶液共孵育，以使所述适配体能够与所述待分离物质结合并固定于所述固相基质表面，再用所述适配体的互补链将所述待分离物质从所述固相基质表面洗脱；

所述待分离物质表面暴露有所述适配体的靶标。

可选的，所述方法还包含回收使用所述固相基质的步骤，包括：

使用≥85℃的热水冲洗所述固相基质；

和/或，使用无水乙醇冲洗所述固相基质。

本发明的有益效果为：

发明人意外的发现高浓度的异硫氰酸胍能够有利于核酸分子在光交联过程中分散更加均匀，从而可以有效提高固定后核酸的生物学活性。该方法简单易操作，且技术效果显著，可进行广泛的推广使用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中采用Western blotting对实施例1及对比例的相对外泌体收率检测结果；

图2为本发明一个实施例中所分离得到的外泌体的电镜图，A为实施例1结果，B为实施例2结果。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

将含有待固定核酸的溶液附着在所述固相基质的表面；

其中，所述溶液中含有3M～4M(例如3.2M、3.4M、3.5M、3.6M、3.8M)的异硫氰酸胍。

术语“光交联”涉及所述载体材料和所述核酸之间通过形成分子相互作用或键的相互作用，其在能量源光提供的能量的影响或驱动下将两种结构元件连接在一起。在本发明的上下文中，光交联通过使用在约200nm到约500nm之间的常用波长的光来进行，对核酸分子优选在256nm进行以便引起分子和载体材料之间的相互作用。通常地，分子和载体材料之间引起的相互作用是核酸和材料的共价结合。在约200nm到约500nm范围内的光交联可以例如通过使用近或长波紫外光、UVA光或不可见光进行。基本上，连接通过核酸分子的碱基例如鸟嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶和在某种程度上还有胞嘧啶或腺嘌呤残基来进行，其与载体材料上相应并适当的功能性化学基团反应，如本领域普通技术人员已知的。术语“约200nm到约500nm的范围”是指在200nm到500nm之间的每一个单波长。也优选是指其某些子范围，例如，200nm～220nm、220nm～240nm、240nm～250nm、250nm～260nm、260nm～280nm、300nm～320nm、320nm～340nm、340nm～360nm、360nm～380nm、380nm～400nm、400nm～420nm、420nm～440nm、440nm～460nm、460nm～480nm、480nm～500nm的子范围。通常地，在约200nm到约500mn之间的波长进行的交联可被认为非经典的紫外或长波长交联。

使用的光的波长可主要通过灯的选择来确定。例如，为建立在200nm～500nm的光谱中的波长，可使用高压汞紫外灯。这样的灯通常发射不只一个波长而是一系列波长(光谱)，如本领域普通技术人员知道的。术语“200nm～500nm的光谱”可以为从高压汞紫外灯发射出的光谱。可选地，光也可从LED中发射，其可以有不同的发射光谱，或从本领域普通技术人员已知的任何其他灯或光源中发射，只要发射波长的主线在200nm～500nm的范围内。

在一些实施方式中，所述待固定核酸预先与一段单链的tag核酸序列连接并通过所述tag核酸序列与所述固相基质的表面发生光交联。

在一些实施方式中，所述tag序列包含PolyT和/或PolyC序列。

在一些实施方式中，所述tag序列为8～12个连续的T和8～12个连续的C相连所得序列。

在一些实施方式中，所述tag序列为9、10或11个连续的T和9、10或11个连续的C相连所得序列。

在一些实施方式中，所述tag序列位于所述待固定核酸的3’端或5’端。

在一些实施方式中，所述溶液中还含有盐离子。

在一些实施方式中，所述盐离子为无机盐离子。

在一些实施方式中，所述盐离子为0.3M～0.7M的一价盐离子。

在一些实施方式中，所述盐离子为0.3M～0.7M的钠和/或钾离子，优选0.5M，盐离子可以NaCl和/或的KCl形式进行配制。

在一些实施方式中，所述溶液的pH为6～8，例如7。

在一些实施方式中，所述溶液中还含有缓冲组分。

在一些实施方式中，所述缓冲组分为15m M～25mM(例如17mM、20mM或23mM)的Tris-HCl。

在一些实施方式中，所述溶液的溶剂为水。

在一些实施方式中，可选的，步骤a)之后步骤b)之前还还包括，将附着有溶液的所述固相基质与乙醇共混，其中所述溶液和乙醇的体积比为1：(0.8～1.2)。

添加乙醇有利于除去溶剂(例如挥发)。

本方法任选地还包括对所述附着在所述固相基质的表面的溶液进行干燥的步骤。

干燥的方法选自晾干、烘干、冻干，或其组合。

优选晾干和/或冻干。

在一些实施方式中，所述待固定核酸在所述溶液中的浓度0.1μM～0.7μM；例如0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM。

在一些实施方式中，所述待固定核酸是DNA、RNA、PNA、CNA、HNA、LNA或ANA，或其组合。

DNA可以是例如A-DNA、B-DNA或Z-DNA的形式。RNA可以是例如p-RNA(即吡喃基-RNA)或结构上修饰的形式，如发夹RNA或茎环RNA。

在进一步优选的实施方案中，如上文定义的待固定核酸可以是短寡核苷酸、长寡核苷酸或多聚核苷酸的形式。

术语“PNA”涉及肽核酸，即人工合成的与DNA或RNA类似的聚合物，其用于生物研究和医学治疗。PNA骨架通常由重复的N-(2-氨乙基)-甘氨酸单位通过肽键连接构成。各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键连接到骨架上。PNA通常描述为类似肽，具有在第一位(左侧)的N端和在右侧的C端。

术语“CNA”涉及环乙烷氨基酸核酸。此外，此术语涉及环戊烷核酸，即核酸分子包含例如2’-脱氧卡巴鸟苷(2’-deoxycarbaguanosine)。

术语“HNA”涉及己糖醇核酸，即DNA类似物，其由标准核苷碱基和磷酸化的1，5-失水己糖醇骨架构成。

术语“LNA”涉及锁核酸。通常地，锁核酸是修饰的并因此无法获得RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分可被连接2’和4’碳的额外的桥修饰。这样的桥在3’内(3’-endo)结构构象中锁定核糖。被锁定的核糖构象提高碱基的堆积和骨架的预组织。这可以显著提高热稳定性，即寡核苷酸的解链温度。

术语“ANA”涉及阿糖核酸或其衍生物。在本发明的上下文中，优选的ANA衍生物是2’-脱氧-2’-氟-P-D-阿糖核苷(2’F-ANA)。

在一些实施方式中，所述待固定核酸是单链的或者双链的。

在一些实施方式中，所述固相基质的材质包括纸、硝酸纤维素、玻璃、磁性材料和塑料中的一种或多种。塑料可以为尼龙或聚苯乙烯。

磁性材料可以为金属(金属单质或合金)、非金属，或金属与非金属所形成的复合物。金属例如铁、铝镍钴金属等；非金属例如铁氧体非金属(优选为Fe₂O₃或Fe₃O₄磁性纳米粒子)；金属与非金属所形成的复合物例如钕铁硼橡胶磁复合材料。

在一些实施方式中，所述固相基质为多孔板、膜、微珠中的至少一种。

术语“微珠”可以为球体、近球体、立方体、多面体或不规则形状。微球的直径优选为10nm～1mm，例如100nm、500nm、1μm、10μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm；优选为150μm以上。

在优选的实施方式中，100μm～200μm的玻璃珠0.7g～0.76g与0.5mL所述溶液共孵育。

在一些实施方式中，所述待固定核酸为裸核酸或纯化核酸。

在一些实施方式中，所述待固定核酸是适配体。

在一些实施方式中，所述待固定核酸是能够特异性识别并结合外泌体表面标志物的外泌体。

在一些实施方式中，所述表面标志物选自CD63、CD9、CD81、HSP70、Tsg101、EpCam、flotillin、Syntenin、Alix、HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5以及a-1AT中的至少一种；优选的，所述表面标志物选自更为常见的蛋白，四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81)、热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)、肿瘤易感基因101蛋白(tumor susceptibility gene 101,TSG101)、ALG-2相互作用蛋白X(ALG-2-interactingprotein X,Alix)等可作为细胞外囊泡的标记物。

所述待分离物质表面暴露有所述适配体的靶标。

在一些实施方式中，所述方法还包含回收使用所述固相基质的步骤，包括：

使用≥85℃的热水冲洗所述固相基质；

和/或，使用无水乙醇冲洗所述固相基质。

使用热水冲洗掉互补链，操作更为简单，且可以达到重复使用的效果。

在一些实施方式中，所述待分离物质为细胞外囊泡。在本发明中，细胞胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)被定义为20nm～1000nm大小的膜囊泡结构群体，其可包括外泌体(exosomes)、微泡(microvesicles)和凋亡小体(apoptosis body)等。

在一些实施方式中，所述所述待分离物质位于组合物中，所述组合物选自细胞培养物上清液、全血、血清、血浆、腹水、脑脊液、骨髓穿刺液、支气管肺泡洗液、胸腔液、尿、精液、卵泡液、宫腔液、胆汁、羊水、阴道分泌物、唾液、痰或者从生物组织样品得到的澄清的裂解液。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1

层析柱制作

1.称取玻璃微珠(100目及以上)0.73g，洗净。

2.加入2μl 100μM CD63核酸适配体(末端带有TC-Tag)于498μl离液盐溶液(4M异硫氰酸胍C，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7)，序列为：TTTTTTTTTTCCCCCCCCCCCACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA

3.将该溶液加入称量好的玻璃珠中。

4.加入500ul无水乙醇。

5.充分混匀5min，大致吸干液体，将玻璃珠平铺在塑料托盘上晾干。

6.256nm紫外照射玻璃珠(累积能量不低于0.3J/cm²)，中途翻动。

7.将玻璃珠装填入层析柱。

8.使用0.1×SSC Buffer冲洗柱子10min。

9.使用0.5％SDS溶液冲洗柱子2遍。

10.使用1×PBS Buffer冲洗柱子3遍。

11.加入PBS浸没填料，加盖密封，4℃保存。

注：

1×PBS Buffer：

Component	Concentration
		NaCl	0.137M
KCl	0.0027M
		Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	0.01M
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	0.0018M

pH＝7.4

20×SSC Buffer：

Component	Concentration
		NaCl	3M
Sodium Citrate	0.3M

pH＝7.0

实施例2

与实施例1的区别在于，去掉步骤4，其余步骤相同。

对比例

与实施例1的区别在于，将异硫氰酸胍C替换为等量的水。

实施例3

使用实施例1、实施例2和对比例制作得到的层析柱提取外泌体：

1.柱子中加入血清350ul，加压通过填料。将冲出液加回层析柱，反复通过填料15min。

2.使用PBS Buffer冲洗柱子3遍。

3.加入CD63适配体互补序列(200ul，10uM)。序列为：TAGCATTAGTGTCACGGGAGCGAGGTGGGGTG

4.将互补序列溶液加压通过填料，将冲出液加回层析柱，反复通过填料15min。收集冲出液即为产物，对产物的收率和纯度进行检测。

层析柱重复使用

方法一：

1.使用无水乙醇冲洗柱填料3遍。

2.使用PBS冲洗柱填料3遍。

3.加入PBS浸没填料，加盖密封，4℃保存。

方法二：

1.使用85℃以上热水反复冲洗柱填料至少3遍。

2.使用PBS冲洗柱填料3遍。

3.加入PBS浸没填料，加盖密封，4℃保存。

对方法二提取得到的外泌体进行检测。相对外泌体收率采用抗TSG101(外泌体标志蛋白之一)抗体进行Western blotting方法测定，实施例1和对比例的相对外泌体收率如图1所示。

所得外泌体的电镜图如图2所示；从电镜照片来看，实施例1、实施例2所看到显著的颗粒直径均在30-150nm范围内，且符合外泌体典型特征。未发现明显的小颗粒(<30nm)杂质，也未发现直径超过150nm的大囊泡结构，因此纯度非常高，接近100％。对比例虽然Western blotting来看是提取到了，但电镜下看不到明显的颗粒，可能是因为得率太低而无法成功制备电镜样本。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.将核酸固定于固相基质表面的方法，其特征在于，包括：

a）将含有待固定核酸的溶液附着在所述固相基质的表面；

b）对所述固相基质的表面进行照射以使得所述待固定核酸与所述固相基质的表面发生光交联；

其中，所述溶液中含有3M ~4M的异硫氰酸胍。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待固定核酸预先与一段单链的tag核酸序列连接并通过所述tag核酸序列与所述固相基质的表面发生光交联。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述tag核酸序列包含PolyT和/或PolyC序列。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述tag核酸序列为8~12个连续的T和8~12个连续的C相连所得序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液中还含有盐离子。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述盐离子为0.3M~0.7M的钠和/或钾离子。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述溶液的pH为6~8。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述溶液中还含有缓冲组分。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述缓冲组分为15m M ~ 25 mM的Tris-HCl。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述溶液的溶剂为水。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤a）之后步骤b）之前还包括，将附着有溶液的所述固相基质与乙醇共混，其中所述溶液和乙醇的体积比为1：（0.8~1.2）。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待固定核酸在所述溶液中的浓度0.1μM ~ 0.7 μM。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述待固定核酸是DNA、RNA、PNA、CNA、HNA、LNA或ANA，或其组合。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述待固定核酸是单链的或者双链的。

15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相基质的材质包括纸、硝酸纤维素、玻璃、磁性材料和塑料中的一种或多种。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述固相基质为多孔板、膜、微珠中的至少一种。

17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光交联所使用的光的波长为250 nm~260 nm。

18.根据权利要求1~17任一项所述的方法，其特征在于，所述待固定核酸是适配体。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述待固定核酸是能够特异性识别并结合外泌体表面标志物的适配体。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述表面标志物选自CD63、CD9、CD81、HSP70、Tsg101、EpCam、flotillin、Syntenin、Alix、HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5以及a-1AT中的至少一种。

21.由权利要求1~20任一项所述方法固定得到的负载有核酸的固相基质。

22.从液相组合物中分离物质的方法，其特征在于，用权利要求21所述的固相基质与含有待分离物质的溶液共孵育，以使适配体能够与所述待分离物质结合并固定于所述固相基质表面，再用所述适配体的互补链将所述待分离物质从所述固相基质表面洗脱；

所述待分离物质表面暴露有所述适配体的靶标。

23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法还包含回收使用所述固相基质的步骤，包括：

使用≥85℃的热水冲洗所述固相基质；

和/或，使用无水乙醇冲洗所述固相基质。