CN113801830A - 一种高产普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一株高产普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌菌株，并提供了其在普鲁兰酶生产中的应用。所述枯草芽孢杆菌是通过紫外诱变方法筛选获得的普鲁兰酶产量显著提高的突变菌株，保藏编号为CGMCC No.19498。所述菌株可广泛应用于普鲁兰酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，应用前景广阔。

Description

一种高产普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。

背景技术

普鲁兰酶（pullulanase, EC 3.2.1.41）属于α-淀粉酶第13家族，是一种可以特异地水解普鲁兰多糖、淀粉及相关分支多糖中α-1，6-糖苷键的一种脱支酶。经研究发现，大部分淀粉质原料含有75%-85%的支链淀粉，支链淀粉中含有4%-5%的α-1,6-糖苷键。由于它对α-1，6糖苷键的特异水解功能，普鲁兰酶被广泛地应用于淀粉糖加工工业、医药领域、饲料、啤酒及白酒酿造等工业中。

1961年，Bender和Wallenfels首次通过产气气杆菌Aerobacter Aerogenes发酵获得普鲁兰酶。迄今，已报道的产普鲁兰酶的菌种还有很多，例如克雷伯氏菌属的Klebsiellaaerogenes、链球菌属的Streptococcus pneumoniae、链霉菌属的Streptomycesflavochromogenes、火球菌属的Pyrococcus woesei、芽孢杆菌属的Bacillusflavocaldarius、热球菌属的Thermococcus hydrothermalis、厌氧分支杆菌属的Anaerobranca gottschalkii等。尽管已发现许多产普鲁兰酶的微生物，但大多数野生菌种因为生存环境要求高、所产酶的活性低或者酶学性质不稳定等因素，没有太大的商业利用价值。因此目前已经投入到普鲁兰酶工业化生产中的菌株，只有丹麦Novo公司的Bacillusacidopullulyticus和美国Genencor公司的Bacillus deramificans等少数几个菌。

由于目前从自然界分离到的天然菌株，分泌普鲁兰酶的能力很低，不能满足工业生产的需求。而工业用普鲁兰酶由于异源表达菌株的分泌性能较差，产酶效率过低等因素，又极大地限制了我国普鲁兰酶的规模化工业生产。为解决这些问题大致有两条途径：一是，通过传统的遗传学方法对已有的菌株进行改良以获得性能更优良的菌株；二是，通过基因工程的手段克隆性能优良的普鲁兰酶基因并将其导入到合适的宿主体内得到优良的重组菌。例如，2008年Zouari等人使用来源于嗜热脂肪芽孢杆菌US100（B. stearothermophilusUS100）α-淀粉酶和枯草芽孢杆菌（B. subtilis）脂肪酶的信号肽研究了地芽孢杆菌（Geobacillus thermoleovorans）US105普鲁兰酶编码基因在大肠杆菌中的高效表达。2011年Kang等人将来自于新阿波罗栖热袍菌（Thermotoga neapolitana）中的普鲁兰酶编码基因连同信号肽序列克隆到大肠杆菌中，在T7启动子的控制下，实现了该酶在大肠杆菌中的成功表达。2017年李金良等从云南腾冲热泉附近的土壤样品中筛选得到一株产中温普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌。通过蛋白质电泳和N端测序技术分析普鲁兰酶N端组成，分析基因组数据得到中温普鲁兰酶的基因并将该基因以整合到枯草芽孢杆菌基因组的方式在枯草芽孢杆菌中表达，得到较原始菌株酶活有极大提高的重组菌株。

目前现有的产普鲁兰酶的菌株仍不能满足工业化生产的需要，产量仍偏低，导致该酶的成本居高不下，因此开发新的普鲁兰酶高产菌株迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌菌株，并提供了其在普鲁兰酶生产中的应用。申请人首先构建得到重组表达普鲁兰酶基因的枯草芽孢杆菌菌株，然后进一步对其进行紫外诱变，筛选获得普鲁兰酶产量显著提高的突变菌株，从而有利于降低该酶的生产成本，促进普鲁兰酶的广泛应用。

本发明一方面提供了一种枯草芽孢杆菌工程菌株，其携带有表达普鲁兰酶的重组质粒。

所述普鲁兰酶基因序列为SEQ ID NO:1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明一方面提供了一种突变菌株枯草芽孢杆菌QJPul（Bacillus subtilis QJPul），已于2020年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19498。

本发明一方面提供了所述枯草芽孢杆菌在生产普鲁兰酶中的应用。

本发明还提供了一种生产普鲁兰酶的方法，是以所述枯草芽孢杆菌为发酵菌株。

本发明还提供了一种普鲁兰酶，是由所述枯草芽孢杆菌发酵获得的。

有益效果

本发明首先将普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌宿主中表达，构建得到重组表达该酶的工程菌株枯草芽孢杆菌Pul。该菌株摇瓶发酵和20L罐发酵上清液中普鲁兰酶酶活分别达到961 U/mL和2362 U/mL。

为了提高普鲁兰酶的产量，申请人以枯草芽孢杆菌Pul为出发菌株，进一步通过紫外诱变的方法筛选获得一株突变菌枯草芽孢杆菌QJPul。该突变菌株摇瓶发酵上清液中普鲁兰酶酶活高达1531 U/mL，比出发菌提高的59.3%；其20 L罐发酵粗酶液中普鲁兰酶酶活高达3679 U/mL，比出发菌提高了55.8%，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于普鲁兰酶的生产，有利于降低普鲁兰酶的生产成本，促进该酶的应用。

附图说明

图1为pDG1662质粒图谱；

图2为pUC19-cat质粒图谱；

图3为pPaprE-pul质粒图谱；

图4为枯草芽孢杆菌Pul发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。

本发明实施例中所涉及的培养基的配方如下：

GM I配制方法为：1×最低盐溶液96 mL，20%葡萄糖2.5 mL，5%水解酪蛋白0.4 mL，10%酵母粉汁1 mL；其中1×最低盐溶液的配制方法为：K₂HPO₄ 14 g/L，KH₂PO₄ 6 g/L，(NH₄)₂SO₄ 2 g/L，柠檬酸三钠1 g/L，MgSO₄•7H₂O 0.2 g/L，在蒸馏水中依次溶解；

GM II配制方法为：1×最低盐溶液97 mL，20%葡萄糖2.5 mL，5%水解酪蛋白0.08mL，10%酵母粉汁0.04 mL，1 M MgCl₂ 0.25 mL，1 M CaCl₂ 0.05 mL；

LB平板：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，琼脂粉1.5%；

红色普鲁兰平板：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，红色普鲁兰0.1%，琼脂粉1.5%；

种子培养基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，K₂HPO₄ 1.8%，氯霉素5 μg/mL；

发酵培养基：酵母粉1~2%，豆饼粉2~5%，麦芽糊精5~10%，柠檬酸钠0.1~0.5%，CaCl₂0.1~0.5%，MgSO₄ 0.1~0.5%，K₂HPO₄ 0.5~2%。

实施例1 普鲁兰酶整合表达质粒pPaprE-pul构建

将合成的普鲁兰酶基因pul的DNA序列SEQ ID NO: 1（其编码的氨基酸序列为SEQID NO:2）克隆到pUC57质粒中，命名为pUC57-pul。

挑取新活化的枯草芽孢杆菌168（Bacillus subtilis 168）单菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃摇床200 rpm振荡培养过夜，按照TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒的说明提取B. subtilis 168的基因组。该基因组中含aprE启动子（PaprE）的DNA序列（SEQ IDNO：3）。

cat-F: 5'-ACATGCATGCCTGTAATATAAAAACCTTCTTC-3'；

cat-Re: 5'-ACGCGTCGACTTTATTCTTCAACTAAAGCAC-3'；

PaprE-F: 5'-ACGCGTCGACTGACACAGAAGAAAACGTTGG-3'；

PaprE-R: 5'-GATGCGGTGAAACGTTAGCACTCTTTACCCTCTCCTTTTAAA-3'；

pul-F: 5'-TTTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGCTAACGTTTCACCGCATC-3'；

pul-Re: 5'-CGCGGATCCGAAGCGAATTGGCTGCTCTTG-3'。

以pDG1662质粒（质粒图谱如图1所示）为模板，采用cat-F、cat-Re引物，用NEB公司的Phusion保真酶进行PCR扩增。OMEGA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为cat，大小约0.93 kb。

将pUC19质粒用SphI及SalI内切酶进行双酶切，OMEGA凝胶回收试剂盒回收酶切产物pUC19/SphI/SalI，大小约2.7 kb。将cat片段用SphI及SalI内切酶进行双酶切，OMEGA凝胶回收试剂盒回收酶切产物cat/SphI/SalI，大小约0.93 kb。用T4 DNA Ligase对pUC19/SphI/SalI片段及cat/SphI/SalI片段进行连接反应，连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞，涂布含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，对转化子进行菌落PCR验证，对插入cat基因的转化子提取质粒，并将质粒送往苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，测序正确的质粒命名为pUC19-cat，图谱如图2所示。

以B. subtilis 168基因组为模板，采用PaprE-F、PaprE-Re引物，用NEB公司的Phusion保真酶进行PCR扩增。OMEGA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为PaprE，大小约0.65 kb。

以pUC57-pul为模板，采用pul-F、pul-Re引物，用NEB公司的Phusion保真酶进行PCR扩增。OMEGA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为pul，大小约2.75 kb。

对PaprE及pul片段进行融合PCR，融合PCR过程如下：第一轮，PCR反应体系中各加入200 ng的PaprE、pul片段，不加引物，用NEB公司的Phusion保真酶PCR扩增。第二轮，取10μl第一轮PCR产物作为模板，加入PaprE-F、pul-Re引物，用NEB公司的Phusion保真酶PCR扩增。OMEGA凝胶回收试剂盒回收约3.4 kb的PCR产物，命名为PaprE-pul。

将pUC19-cat质粒用SalI及BamHI内切酶进行双酶切，OMEGA凝胶回收试剂盒回收酶切产物pUC19-cat/SalI/BamHI，大小约3.6 kb。将PaprE-pul片段用SalI及BamHI内切酶进行双酶切，OMEGA凝胶回收试剂盒回收酶切产物PaprE-pul/SalI/BamHI，大小约3.4 kb。用T4 DNA Ligase对pUC19-cat/SalI/BamHI片段及PaprE-pul/SalI/BamHI片段进行连接反应，连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞，涂布含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，对转化子进行菌落PCR验证，对插入PaprE-pul片段的转化子提取质粒，并将质粒送往苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，测序正确的质粒命名为pPaprE-pul，图谱如图3所示。普鲁兰酶整合表达质粒构建完成。

实施例2 重组表达普鲁兰酶的基因工程菌株的构建及发酵验证

2.1 宿主菌感受态细胞制备

（1）将枯草芽孢杆菌1A751（Bacillus subtilis 1A751 (apr ^-, his ^-, npr ^-, eglSΔ102, bglT/bglSΔEV)）（Wolf M, et al. Microbiology. 1995 141:281-90）宿主划线LB平板，37℃培养过夜；

（2）第二天挑取1个单菌落接种到5 mL GMⅠ溶液，在30℃、125 rpm振荡培养过夜；

（3）第三天取1 mL过夜培养液转接到9 mL GMⅠ中，37℃、250 rpm培养3.5 h；

（4）再取5 mL上一步骤的培养液转接到45 mL GMⅡ中，37℃、125 rpm培养90 min后，5000 g、10 min离心收集菌体。用5 mL原培养液上清液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞。

2.2 普鲁兰酶整合菌株构建

（1）在0.2 mL枯草芽孢杆菌1A751感受态细胞中加入约1 μg pPaprE-pul重组质粒，37℃、200 rpm振荡培养1 h后涂布含5 μg/mL氯霉素的红色普鲁兰平板，37℃培养过夜；

（2）次日选取10个透明圈显著的单菌落在含5 μg/mL氯霉素的红色普鲁兰平板上划线纯化，然后每个平板选取透明圈显著的单菌落接种于20 mL种子培养基中，37℃、220rpm振荡培养8~9 h。然后分别取2.5 mL种子培养物接种到50 mL发酵培养基中，34℃、250rpm振荡培养72 h；4000 rpm离心10 min取上清液；采用中华人民共和国国家标准普鲁兰酶活力的测定方法（GB 1886.174-2016）分别测定上述菌株发酵上清液的普鲁兰酶酶活。

结果显示：其中一株重组菌发酵上清液中普鲁兰酶酶活高达961 U/mL，显著高于另外9株重组菌。申请人将该菌株命名为枯草芽孢杆菌Pul（Bacillus subtilis Pul）。将该菌株发酵上清液进行SDS-PAGE电泳分析。结果如图4所示，箭头所指处即为该菌株重组表达的普鲁兰酶。

2.3 枯草芽孢杆菌Pul 20L罐发酵验证

将枯草芽孢杆菌Pul接种于含500mL种子培养基中，37℃、220 rpm振荡培养约12h。

将种子液全部转入20L发酵罐（发酵罐培养基成分：玉米淀粉3%，葡萄糖1%，豆饼粉3%，麸皮3%，Na₂HPO₄ 0.78%，KH₂PO₄ 0.05%，发酵罐消后体积10 L）；温度控制37℃，发酵初始pH 7.2，发酵过程中氨水控制pH不低于7.0；风量1~1.5 vvm，转速300~700 rpm，控制发酵过程中DO不低于10%；3~4 h后开始流加50%葡萄糖，流加速度3 g/L·h；发酵25~28 h，DO、pH均回升后停止培养。收集发酵液上清，采用中华人民共和国国家标准普鲁兰酶活力的测定方法（GB 1886.174-2016）测定发酵上清液的普鲁兰酶酶活。

结果显示，枯草芽孢杆菌Pul菌株发酵上清液酶活高达2362 U/mL。从而说明本发明构建的重组工程菌株枯草芽孢杆菌Pul能高效超表达外源普鲁兰酶基因pul。

实施例3 酶学性质分析

3.1 最适作用pH分析

采用pH值分别为3.0、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在60℃条件下，对重组菌株枯草芽孢杆菌Pul发酵上清液进行普鲁兰酶酶活测定，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果显示，本发明构建的重组菌株枯草芽孢杆菌Pul所产普鲁兰酶的最适作用pH为4.5。

3.2 最适作用温度分析

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，pH 4.5条件下，对重组菌株枯草芽孢杆菌Pul发酵上清液进行普鲁兰酶酶活测定，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果显示，本发明构建的重组菌株枯草芽孢杆菌Pul所产普鲁兰酶最适作用温度为60℃，在50-60℃范围内能保持87%以上的相对酶活。

实施例4 普鲁兰酶高产菌株的诱变筛选

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以实施例2构建得到的枯草芽孢杆菌Pul为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其普鲁兰酶的产量。

4.1菌悬液制备

将出发菌枯草芽孢杆菌Pul在LB斜面上划线接种，37℃培养24 h；加入5 mL 0.85%的无菌生理盐水，将斜面上的菌体全部冲洗下来，转入无菌的含有玻璃珠的试管中，涡旋震荡10 min，完全打成单细胞菌体；将菌悬液全部转入15 mL离心管，6000 rpm离心3 min收集菌体，取上清，用10 mL生理盐水悬浮菌体；洗涤细胞两次，最后调整细胞浓度至10⁸个/mL。

4.2 紫外诱变处理及诱变剂量确定

打开9 W紫外灯开关，预热约30 min；取直径9 cm无菌平皿，加入上述细胞浓度为10⁸个/mL的菌悬液10 mL，加入一根无菌磁力搅拌转子，打开磁力搅拌器，打开皿盖，在垂直距离为15 cm处，分别搅拌照射0.5 min、1 min、1.5 min、2 min、2.5 min、3 min；盖上平皿盖，关闭紫外灯，黑暗中孵育30 min。

将照射后的菌悬液用0.85%生理盐水梯度稀释至10^-1~10^-6；取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度的菌悬液各100 μL，涂布LB平板，每个稀释度涂布三个平板；以同样的操作，取未经紫外线照射处理的菌液稀释涂平板作对照。将上述涂布均匀的平板，用黑布或报纸包好后，置于37℃过夜培养。

统计不同照射时间下每个稀释度下平板上长出的单菌落数，若在某个稀释度下长出的单菌落数在30~300个之间，则认为改稀释度合适。将该稀释度下三个平板上长出的单菌落数求平均值，按下列公式计算菌悬液浓度：

菌悬液浓度（CFU/mL）=某个稀释度下的菌落平均数×稀释倍数×10

按下列公式计算某个紫外处理剂量下的致死率：

致死率（%）=（1－某剂量处理后的菌悬液浓度/处理前菌悬液浓度）×100%

经计算，不同紫外诱变剂量下枯草芽孢杆菌 Pul的致死率如表1所示。

表1 枯草芽孢杆菌Pul紫外诱变致死率

时间/min	0.5	1	1.5	2	2.5	3
							致死率/%	85.3	95.7	98.6	99.8	99.9	99.9

从表1可以看出，菌悬液经紫外照射1 min后致死率达到95%以上，因此确定最终诱变时间为1 min。

4.3 红色普鲁兰平板透明圈大小初筛

从紫外诱变1 min的LB平板上挑取菌落，划线培养获得单菌落后点种于红色普鲁兰平板，每组设3个平行，同时点种出发菌株作为对照。37℃培养24 h后，选择透明圈直径与菌落直径的比值大于出发菌的单菌落再次纯化，选择纯化后透明圈直径与菌落直径的比值大于出发菌30%以上的单菌落共20个进行摇瓶复筛。

4.4 摇瓶复筛

将上述筛选得到的20株突变菌分别接种于50 mL摇瓶发酵培养基中，34℃，220rpm发酵培养72 h后，离心取上清液，分别测定发酵上清液中的普鲁兰酶酶活，同时以出发菌株作为对照，选择摇瓶发酵酶活较出发菌株提高15%以上的突变株进行第二轮紫外诱变筛选。

申请人按照上述方法继续进行了8轮紫外诱变筛选，最终获得1株普鲁兰酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名为枯草芽孢杆菌QJPul（Bacillus subtilis QJPul）。该菌株在50 mL摇瓶发酵培养基中，34℃，220 rpm发酵培养72 h后，离心取上清液，上清液普鲁兰酶酶活高达1531 U/mL，比出发菌提高的59.3%；其20 L罐发酵粗酶液中普鲁兰酶酶活高达3679 U/mL，比出发菌提高了55.8%，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2020年3月20日将所述突变菌株枯草芽孢杆菌QJPul（Bacillus subtilis QJPul）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 19498。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物股份有限公司

潍坊康地恩生物科技有限公司

青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一种高产普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2586

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgctaacgt ttcaccgcat cattcgaaaa ggatggatgt tcctgctcgc gtttttgctc 60

actgcctcgc tgttctgccc aacaggacag cacgccaagg ctgccgcacc gtttaacggt 120

accgcacaac ctgctgtaag taacgcttat ttagatgctt ccaaccaagt gttggtcaag 180

cttagccagc cgtttactct tggtgaaggt tcaagcggtt ttacggttca tgatgacaca 240

gcaaataagg atattccagt tacatctgtt agtgatgcca atcaggtaac ggctgtttta 300

gcaggtactt tccagcatat ttttgggggg agtgattggg caccggataa tcacaatact 360

ttactaaaaa aggtgaatag caatctctat caattttcag gaaatcttcc tgaaggaaac 420

taccaatata aagtggcttt aaatgatagc tggaataatc cgagctaccc atctgataac 480

attaatttga cagtgccagc tggtggtgcc catgttacat tttcttatat accatccacc 540

catgctgttt atgacacgat taacaatcct aatgcggatt tacaagtaga tagcagcggt 600

gttaagacgg atctcgtggc ggttactctt ggagaaaatc ctgatgtaag ccataccctg 660

tccattcaaa cagaggacta tcaggcagga caggtcatac ctcgtaaggt gcttgattca 720

tcccagtact actattccgg agatgatctc gggaatacct atacaaagaa tgcaactacc 780

tttaaggtct gggcgcctac atccactcaa gtaaatgtcc ttctttataa tagtgcaacc 840

ggcgcggtaa ctaaaacggt tccaatgacc gcatcaggcc atggtgtatg ggaagcaaca 900

gtcaaccaag accttgaaaa ttggtattac atgtatgagg taacaggaca aggctcaacc 960

cgaacggctg ttgatccgta tgcaacagct attgcaccaa acggaacgag aggcatgatt 1020

gtggacctag ccaaaacaga cccggccgga tgggagagtg acaaacatat tacgccaaag 1080

aatatagaag atgaagtcat ctatgaaatg gatgttcgtg acttttccat cgactctaat 1140

tcgggtatga aaaataaagg aaagtatttg gcacttacag aaaaaggaac taaaggccct 1200

gacaatgtaa agacaggggt agattcctta aaacaacttg ggattactca tgttcagctt 1260

cagcctgttt tcgcatttaa tagtgtcaat gaaaacgatc caactcaata taattggggt 1320

tatgaccctc gcaactacaa tgttcctgag ggacaatatg ctactaatgc aaacggaaca 1380

actcggatta aagagtttaa ggaaatggtt ctttcactcc atcaggacca cattggggtt 1440

aatatggatg ttgtttataa tcataccttt gccacgcaaa tctctgactt cgataagatt 1500

gtgccagaat attactaccg cacggatgat gctggtaact acactaacgg ctcaggtact 1560

ggaaacgaaa tcgcagccga aagaccaatg gttcaaaaat ttattatcga ttcacttaag 1620

ttttgggtca atgagtacca cgttgacggt ttccgttttg acttaatggc gttgcttgga 1680

aaagatacaa tgtctaaagc tgccacgcag cttcatgcca ttgatccagg aattgctctc 1740

tacggtgagc catggacagg aggaacatcc gcgctgccag ccgatcagct tttaacaaaa 1800

ggagctcaaa aaggcatggg agtggctgta tttaatgaca atctgcgaaa cggtttggac 1860

ggcagtgtct ttgattcatc tgctcaaggt tttgcgacag gtgctactgg tttaacggat 1920

gctattaaaa atggagttga aggaagtatt aatgacttca ccgcttcacc aggcgagacg 1980

atcaactatg tcacaagtca tgataactat accctttggg acaagattgc ccaaagcaat 2040

ccaaacgatt ctgaagcgga tcgaattaaa atggatgagc tcgctcaagc gatcgtcatg 2100

acctcacaag gcattccttt catgcagggc ggggaagaaa tgcttcgtac gaaaggcggc 2160

aacgacaata gctataatgc tggtgatgta gtgaacgagt ttgattggag cagaaaagct 2220

caatatccag atgttttcaa ttattatagc gggctgattc atcttcgtct tgatcaccca 2280

gccttccgca tgacgacagc taatgaaatc aatagccacc tccaattcct aaatagccca 2340

gagaacacag tggcctatga attatctgat catgcaaata aagatacatg gggtaatatt 2400

gtggttattt ataatccaaa taaaacggca gaaaccatta atttgccaag cgggaaatgg 2460

gaaatcaatg cgacgagcgg taaggtggga gaatccacac ttggtcaagc agagggcagt 2520

gttcaagttc caggcatatc tatgatgatt cttcatcaag aagtaagccc atctgatggt 2580

aaatag 2586

<210> 2

<211> 861

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Val Leu Thr Phe His Arg Ile Ile Arg Lys Gly Trp Met Phe Leu Leu

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Thr Ala Ser Leu Phe Cys Pro Thr Gly Gln His Ala

20 25 30

Lys Ala Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Ala Gln Pro Ala Val Ser Asn

35 40 45

Ala Tyr Leu Asp Ala Ser Asn Gln Val Leu Val Lys Leu Ser Gln Pro

50 55 60

Phe Thr Leu Gly Glu Gly Ser Ser Gly Phe Thr Val His Asp Asp Thr

65 70 75 80

Ala Asn Lys Asp Ile Pro Val Thr Ser Val Ser Asp Ala Asn Gln Val

85 90 95

Thr Ala Val Leu Ala Gly Thr Phe Gln His Ile Phe Gly Gly Ser Asp

100 105 110

Trp Ala Pro Asp Asn His Asn Thr Leu Leu Lys Lys Val Asn Ser Asn

115 120 125

Leu Tyr Gln Phe Ser Gly Asn Leu Pro Glu Gly Asn Tyr Gln Tyr Lys

130 135 140

Val Ala Leu Asn Asp Ser Trp Asn Asn Pro Ser Tyr Pro Ser Asp Asn

145 150 155 160

Ile Asn Leu Thr Val Pro Ala Gly Gly Ala His Val Thr Phe Ser Tyr

165 170 175

Ile Pro Ser Thr His Ala Val Tyr Asp Thr Ile Asn Asn Pro Asn Ala

180 185 190

Asp Leu Gln Val Asp Ser Ser Gly Val Lys Thr Asp Leu Val Ala Val

195 200 205

Thr Leu Gly Glu Asn Pro Asp Val Ser His Thr Leu Ser Ile Gln Thr

210 215 220

Glu Asp Tyr Gln Ala Gly Gln Val Ile Pro Arg Lys Val Leu Asp Ser

225 230 235 240

Ser Gln Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asp Asp Leu Gly Asn Thr Tyr Thr Lys

245 250 255

Asn Ala Thr Thr Phe Lys Val Trp Ala Pro Thr Ser Thr Gln Val Asn

260 265 270

Val Leu Leu Tyr Asn Ser Ala Thr Gly Ala Val Thr Lys Thr Val Pro

275 280 285

Met Thr Ala Ser Gly His Gly Val Trp Glu Ala Thr Val Asn Gln Asp

290 295 300

Leu Glu Asn Trp Tyr Tyr Met Tyr Glu Val Thr Gly Gln Gly Ser Thr

305 310 315 320

Arg Thr Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Ile Ala Pro Asn Gly Thr

325 330 335

Arg Gly Met Ile Val Asp Leu Ala Lys Thr Asp Pro Ala Gly Trp Glu

340 345 350

Ser Asp Lys His Ile Thr Pro Lys Asn Ile Glu Asp Glu Val Ile Tyr

355 360 365

Glu Met Asp Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Ser Asn Ser Gly Met Lys

370 375 380

Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu Lys Gly Thr Lys Gly Pro

385 390 395 400

Asp Asn Val Lys Thr Gly Val Asp Ser Leu Lys Gln Leu Gly Ile Thr

405 410 415

His Val Gln Leu Gln Pro Val Phe Ala Phe Asn Ser Val Asn Glu Asn

420 425 430

Asp Pro Thr Gln Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr Asn Val

435 440 445

Pro Glu Gly Gln Tyr Ala Thr Asn Ala Asn Gly Thr Thr Arg Ile Lys

450 455 460

Glu Phe Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His Gln Asp His Ile Gly Val

465 470 475 480

Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ala Thr Gln Ile Ser Asp

485 490 495

Phe Asp Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Asp Ala Gly

500 505 510

Asn Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Thr Gly Asn Glu Ile Ala Ala Glu Arg

515 520 525

Pro Met Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser Leu Lys Phe Trp Val Asn

530 535 540

Glu Tyr His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu Leu Gly

545 550 555 560

Lys Asp Thr Met Ser Lys Ala Ala Thr Gln Leu His Ala Ile Asp Pro

565 570 575

Gly Ile Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser Ala Leu

580 585 590

Pro Ala Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln Lys Gly Met Gly Val

595 600 605

Ala Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Gly Leu Asp Gly Ser Val Phe

610 615 620

Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu Thr Asp

625 630 635 640

Ala Ile Lys Asn Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr Ala Ser

645 650 655

Pro Gly Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Asn Tyr Thr Leu

660 665 670

Trp Asp Lys Ile Ala Gln Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala Asp Arg

675 680 685

Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Ile Val Met Thr Ser Gln Gly

690 695 700

Ile Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys Gly Gly

705 710 715 720

Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Val Val Asn Glu Phe Asp Trp

725 730 735

Ser Arg Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr Ser Gly Leu

740 745 750

Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr Ala Asn

755 760 765

Glu Ile Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn Thr Val

770 775 780

Ala Tyr Glu Leu Ser Asp His Ala Asn Lys Asp Thr Trp Gly Asn Ile

785 790 795 800

Val Val Ile Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Ala Glu Thr Ile Asn Leu Pro

805 810 815

Ser Gly Lys Trp Glu Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly Glu Ser

820 825 830

Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile Ser Met

835 840 845

Met Ile Leu His Gln Glu Val Ser Pro Ser Asp Gly Lys

850 855 860

<210> 3

<211> 650

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgacacagaa gaaaacgttg gatagagctg ggtaaagcct atgaattctc cattttcttc 60

tgctatcaaa ataacagact cgtgattttc caaacgagct ttcaaaaaag cctctgcccc 120

ttgcaaatcg gatgcctgtc tataaaattc ccgatattgg ttaaacagcg gcgcaatggc 180

ggccgcatct gatgtctttg cttggcgaat gttcatctta tttcttcctc cctctcaata 240

attttttcat tctatccctt ttctgtaaag tttatttttc agaatacttt tatcatcatg 300

ctttgaaaaa atatcacgat aatatccatt gttctcacgg aagcacacgc aggtcatttg 360

aacgaatttt ttcgacagga atttgccggg actcaggagc atttaaccta aaaaagcatg 420

acatttcagc ataatgaaca tttactcatg tctattttcg ttcttttctg tatgaaaata 480

gttatttcga gtctctacgg aaatagcgag agatgatata cctaaataga gataaaatca 540

tctcaaaaaa atgggtctac taaaatatta ttccatctat tacaataaat tcacagaata 600

gtcttttaag taagtctact ctgaattttt ttaaaaggag agggtaaaga 650

Claims (7)

1.一种枯草芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌工程菌株携带有表达普鲁兰酶的重组质粒。

2.利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述的普鲁兰酶基因序列为SEQ ID NO:1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

3.一种枯草芽孢杆菌突变菌株，其特征在于，所述的突变菌株是以权利要求2所述的工程菌株为出发菌，通过紫外诱变方法获得的。

4.权利要求3所述的突变菌株，其特征在于，所述的突变菌株的保藏编号为CGMCC No.19498。

5.利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌工程菌株在生产普鲁兰酶中的应用。

6.利要求3或4所述的枯草芽孢杆菌突变菌株在生产普鲁兰酶中的应用。

7.一种生产普鲁兰酶的方法，是以权利要求3或4所述的枯草芽孢杆菌突变菌株为发酵菌株。

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