CN113797354A

CN113797354A - 吡咯并嘧啶衍生物或其偶联物、其制备方法及其应用

Info

Publication number: CN113797354A
Application number: CN202110647865.7A
Authority: CN
Inventors: 许建烟; 贺峰; 陶维康
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2020-06-11
Filing date: 2021-06-10
Publication date: 2021-12-17

Abstract

本公开涉及吡咯并嘧啶衍生物或其偶联物、其制备方法及其应用。具体而言，本公开提供了一种通式(D‑)所示结构的配体‑药物偶联物，其制备方法以及该配体‑药物偶联物及含有其的药物组合物通过受体调节在制备治疗癌症的药物中的用途，其中通式(D‑)中的各取代基与说明书中的定义相同。

Description

吡咯并嘧啶衍生物或其偶联物、其制备方法及其应用

技术领域

本公开涉及一类全新结构吡咯并嘧啶衍生物或其偶联物。具体地说，本公开涉及一种吡咯并嘧啶衍生物以及含有该结构的配体-药物偶联物，及其制备方法，和包含所述偶联物的药物组合物以及所述偶联物或药物组合物的用途。

背景技术

抗体药物偶联物(antibody drug conjugate，ADC)把单克隆抗体或者抗体片段通过稳定的化学接头化合物与具有生物活性的药物相连，充分利用了抗体对正常细胞和肿瘤细胞表面抗原结合的特异性和药物的高效性，同时又避免了前者疗效偏低和后者毒副作用过大等缺陷。这也就意味着，与以往传统的化疗药物相比，抗体药物偶联物能精准地结合肿瘤细胞并降低将对正常细胞的影响(Mullard A,(2013)Nature Reviews Drug Discovery,12:329–332；DiJoseph JF,Armellino DC,(2004)Blood,103:1807-1814)。

TLR(Toll-like receptors)是模式识别受体(pattern recognition receptors，PRR)中的一种，识别与宿主不同的病原体分子，在天然免疫(innate immune response)中起关键作用，也是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁。近年来研究发现，TLR不仅在抗病毒、细菌感染中起重要作用，并具有很强的抗肿瘤作用。

TLR主要表达在免疫细胞上，另在上皮、内皮细胞及肿瘤细胞上也有表达。免疫细胞上的TLR被激活后，通过细胞质内一些接头蛋白分子(如MyD88，TIRAP，TRIF等)传递信息，这些接头分子会引起一系列信号分子的级联反应进而活化转录因子NF-kB和IRFs，导致炎性相关因子(如IL-2，IL-12，TNF-a等)的释放，使下游多种免疫细胞进一步激活，包括NK细胞，T细胞和DC细胞等，从而杀死肿瘤细胞或是病原体。

基于TLR在肿瘤免疫中的重要作用，针对这个家族开发抗肿瘤药物方兴未艾。目前已有三个TLR的激动剂被批准用于肿瘤治疗，分别是Imiquimod(TLR 7agonist)用于基底细胞癌；Bacillus Calmette-Guerin(BCG,TLR2/4agonist)用于非肌层浸润性膀胱癌；以及monophosphoryl lipid A(MPLA):TLR2/4agonist)作为HPV疫苗佐剂治疗宫颈癌。然而全身性给药最大的问题是系统毒性，可以看到获批的药物两个是局部给药，一个是免疫佐剂。可以尝试通过联合用药或靶向用药的方式提供TLR的疗效和靶向性。

发明内容

本公开提供了一种具有通式(D-)所示结构的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中所述通式(D-)如下：

其中：

环A选自芳基和杂芳基；

G选自-O-、-S-、-C(O)-和共价键；

R¹选自烷基、烷氧基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，其中所述的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基各自独立地任选被选自氘原子、烷基、烷氧基、卤素、卤代烷基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代；

R²相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，其中所述的烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基各自独立地任选被选自烷基、烷氧基、卤素、卤代烷基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基中的一个或多个取代基所取代；

L¹为亚烷基，其中所述的亚烷基任选被选自卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基和杂环基中的一个或多个取代基所取代；

L²为亚烷基，其中所述的亚烷基任选被选自烷基、烷氧基、卤素、卤代烷基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代；

R^3a选自-R^a-N(C(O)R⁵)-、-R^a-(CH₂)_p-O-、-R^a-(CH₂)_r-NR⁶-、-R^a-NR^6a-和-R^a-(CH₂)_p-R^7a-C(O)-NH-(CH₂)_q-NR^8a-；

R^a选自键、亚烷基、环烷基和杂环基，其中所述的亚烷基、环烷基和杂环基各自独立地任选被选自烷基、烷氧基、卤素、卤代烷基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基和杂环基中的一个或多个取代基所取代；

R⁴选自氢原子、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、羟基、羟烷基、氰基、氨基和硝基；

R⁵选自烷基、烷氧基、卤素、卤代烷基、羟基和羟烷基；

R⁶选自氢原子和烷基；优选氢原子；

R^6a选自烷基、烷氧基、卤素、卤代烷基、羟基和羟烷基；优选烷基；

R^7a选自环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；

R^8a选自选自氢原子和烷基；

通式(-D)中虚线

表示R^3a基团上的氧原子或氮原子，与接头单元或与结合靶细胞所表达抗原的抗体共价连接；

n为0、1、2、3或4；

p为0、1、2、3或4；

q为0、1、2、3或4；且

r为1、2、3或4。

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其为通式(Pc-L-D)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物：

其中：

环A、G、R¹、R²、R^3a、R⁴、L¹、L²和n如通式(-D)中所定义；

y选自1至10的整数或小数；

Pc为配体；L为接头单元。

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中y选自1至8的整数或小数，优选选自2至8的整数或小数，更优选选自3至8的整数或小数。

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中Pc为抗体。

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中所述的环A选自苯基，吡啶基或噻吩基；

优选地，环A选自：

所述的环A上的波浪线代表分别与L¹和L²相连接。

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中G为-O-。

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中所述的L¹为亚烷基，L²为亚烷基。

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中R¹为烷基。

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中R²相同或不同，且各自独立地为氢原子、烷基、烷氧基或卤素。

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中R^a为杂环基，所述的杂环基优选选自四氢吡咯基、哌啶基和哌嗪基。

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中R^3a选自：

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中R⁴选自氢原子、烷基和氰基，优选为氰基。

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中R⁵为烷基。

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中R⁶选自氢原子和烷基。

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中R^7a为苯基；R^8a为烷基。

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中接头单元-L-为-L^a-L^b-L^c-，

L^a选自

其中W选自-C_1-6烷基-和-C_1-6烷基-环烷基-，其中所述的-C_1-6烷基-或-C_1-6烷基-环烷基-各自独立地任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；

L^b为由2至7个氨基酸构成的肽残基或化学键，其中氨基酸任选被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基中的一个或多个取代基所取代；

L^c选自-NR⁷(CR⁸R⁹)t-、-NH-C(R⁸R⁹)-O-C(R¹⁰R¹¹)-C(O)-、-NH-R¹²-(CH₂)t-OC(O)-、-C(O)NR⁷、-C(O)NR⁷(CH₂)t-和化学键，其中t为1至6的整数；

R⁷选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；

R⁸或R⁹相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；

R¹⁰选自烷基、环烷基烷基和环烷基；

R¹¹选自氢原子、烷基和卤代烷基；

或者，R¹⁰和R¹¹与其相连接的碳原子一起形成C_3-6环烷基；

R¹²选自芳基或杂芳基。

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中W选自-(CH₂)₂-和-(CH₂)₅-。

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中所述的L^b的肽残基为由一个或多个选自苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸中的氨基酸形成的氨基酸残基；优选为四肽残基、二肽残基或化学键；更优选为甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸的四肽残基(GGFG，SEQ ID NO:3)或者缬氨酸-瓜氨酸的二肽残基。

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中接头单元L^c选自-NH-C(R⁸R⁹)-O-C(R¹⁰R¹¹)-C(O)-、-NH-R¹²-(CH₂)t-OC(O)-和化学键，t为1至6的整数；R¹²选自芳基和杂芳基；

优选的，L^c选自以下结构式：

R¹⁰选自烷基、环烷基烷基和环烷基；

R¹¹选自氢原子、烷基和卤代烷基；

或者，R¹⁰和R¹¹与其相连接的碳原子一起形成C_3-6环烷基。

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中接头单元-L-为-L^a-，L^a选自

其中W选自-C_1-6烷基-和-C_1-6烷基-环烷基-，其中所述的-C_1-6烷基-或-C_1-6烷基-环烷基-各自独立地任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；W优选自-(CH₂)₂-和-(CH₂)₅-。

L^a选自

其中W选自-(CH₂)₂-和-(CH₂)₅-；

L^b选自四肽残基和二肽残基；优选为甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸的四肽残基或者缬氨酸-瓜氨酸的二肽残基；

L^c选自以下结构式：

R¹⁰选自烷基、环烷基烷基或环烷基；

R¹¹选自氢原子、烷基或卤代烷基；

或者，R¹⁰和R¹¹与其相连接的碳原子一起形成C_3-6环烷基。

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其为通式(Pc-Lu-D)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐：

其中：

L^a、L^b、L^c如接头单元-L-中所定义；

Pc、y、环A、G、R¹、R²、R^3a、L¹、L²、n如通式(Pc-Lu-D)中所定义。

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，包含连接单元-L-，其中-L-选自：

其中a端与配体Pc相连，b端与药物端R^3a相连。

本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其选自以下结构式或其组合物：

其中Pc为配体；y选自1至10的整数或小数。

在本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中所述Pc为抗体。

在本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中所述的抗体选自抗TLR7抗体、抗HER2(ErbB2)抗体、抗EGFR抗体、抗B7-H3抗体、抗c-Met抗体、抗HER3(ErbB3)抗体、抗HER4(ErbB4)抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD44抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD73抗体、抗CD105抗体、抗CEA抗体、抗A33抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗G250抗体、抗MUCl抗体、抗Lewis Y抗体、抗VEGFR抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin-C抗体、抗SLC44A4抗体或抗Mesothelin抗体。

在本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中所述的抗体选自Trastuzumab、Pertuzumab、Nimotuzumab、Enoblituzumab、Emibetuzumab、Inotuzumab、Pinatuzumab、Brentuximab、Gemtuzumab、Bivatuzumab、Lorvotuzumab、cBR96和Glematumamab。

本公开通式(Pc-L-D)所示的配体-药物偶联物包括，但不限于以下结构式：

其中y如前所定义，y选自1至10的整数或小数，优选为1至8，更优选为2至8的整数或小数；最优选为3至8的整数或小数；Trastuzumab为抗HER2抗体，其包含如SEQ ID NO：1所示的轻链和如SEQ ID NO：2所示的重链。

本公开的另一方面，提供了一种具有通式(D)所示结构的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐：

其中：

环A选自芳基和杂芳基；

G选自-O-、-S-、-C(O)-和共价键；

R³选自-R^a-NH-C(O)-R⁵、-R^a-(CH₂)_p-OH、-R^a-(CH₂)_r-NH-R⁶、-R^a-NH-R^6a、-R^a-(CH₂)_r-NR⁶-C(O)-C(R¹⁰R¹¹)-OH、-R^a-NR^6a-C(O)-C(R¹⁰R¹¹)-OH和-R^a-(CH₂)_p-R^7a-C(O)-NH-(CH₂)_q-NH-R^8a；

R⁵选自烷基、烷氧基、卤素、卤代烷基、羟基和羟烷基；

R⁶选自氢原子和烷基；优选氢原子；

R^7a选自环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；

R^8a选自氢原子和烷基；

R¹⁰选自烷基、环烷基烷基或环烷基；

R¹¹选自氢原子、烷基或卤代烷基；

n为0、1、2、3或4；

p为0、1、2、3或4；

q为0、1、2、3或4；且

r为1、2、3或4。

在本公开的另一些实施方案中，所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的环A选自苯基，吡啶基或噻吩基；

优选地，环A选自：

所述的环A上的波浪线代表环A分别与L1和L2相连接。

在本公开的另一些实施方案中，所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中G为-O-。

在本公开的另一些实施方案中，所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的L¹为亚烷基，L²为亚烷基。

在本公开的另一些实施方案中，所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中R¹为烷基。

在本公开的另一些实施方案中，所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中R²相同或不同，且各自独立地为氢原子、烷基、烷氧基或卤素。

在本公开的另一些实施方案中，所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中R^a为杂环基，所述的杂环基优选自四氢吡咯基、哌啶基和哌嗪基。

在本公开的另一些实施方案中，所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中R³选自：

在本公开的另一些实施方案中，所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中R⁴选自氢原子、烷基或氰基，优选氰基。

在本公开的另一些实施方案中，所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中R⁵为烷基。

在本公开的另一些实施方案中，所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中R⁶选自氢原子和烷基。

在本公开的另一些实施方案中，所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中R^7a为苯基；R^8a为烷基。

本公开所述的通式(D)所示的化合物包括，但不限于：

本公开的另一些实施方案中，提供了一种通式(Lu-D)所示的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物：

其中：

L^a选自

其中W选自-C_1-6烷基-或-C_1-6烷基-环烷基-，其中所述的-C_1-6烷基-或-C_1-6烷基-环烷基-各自独立地任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；优选地，其中W选自-(CH₂)₂-和-(CH₂)₅-；

L^c选自-NR⁷(CR⁸R⁹)t-、-NH-C(R⁸R⁹)-O-C(R¹⁰R¹¹)-C(O)-、-NH-R¹²-(CH₂)t-OC(O)-、-C(O)NR⁷、-C(O)NR⁷(CH₂)t-或化学键，其中t为1至6的整数；

R⁷选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；

R¹⁰选自烷基、环烷基烷基或环烷基；

R¹¹选自氢原子、烷基或卤代烷基；

或者，R¹⁰和R¹¹与其相连接的碳原子一起形成C_3-6环烷基；

R¹²选自芳基或杂芳基；

环A、G、R¹、R²、R^3a、R⁴、L¹、L²、如通式(Pc-Lu-D)中所定义。

本公开所述的通式(Lu-D)所示的化合物包括，但不限于：

本公开的另一方面，提供了一种制备如通式(Pc-Lu-D)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物的方法，其包括如下步骤：

将还原Pc后所得到Pc’，与通式(Lu-D)进行偶联反应，得到通式(Pc-Lu-D)；

其中：

Pc为配体；环A、G、L¹、L²、L^a、L^b、L^c、R¹、R²、R^3a、R⁴、n和y如通式(Pc-Lu-D)中所定义；L^a’如通式(Lu-D)中所定义。

本公开的另一方面，进一步涉及一种配体-药物偶联物，包含配体和连接至配体的药物，其中所述药物选自本公开所述的化合物，优选药物通过接头连接至配体，优选配体为单克隆抗体。

本公开的另一方面，进一步涉及一种药物组合物，其含有治疗有效量的如本公开所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂；或其含有治疗有效量的如本公开所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本公开的另一方面，进一步涉及一种配体-药物偶联物的制备方法，包含将本公开所述的化合物与配体连接的步骤，优选通过接头连接，优选配体为单克隆抗体。当接头单元-L-为-L^a-L^b-L^c-时，L^a端与配体连接，L^c端与药物连接。

本公开的另一方面，进一步涉及本公开所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，或其药物组合物，其用作药物。

本公开的另一方面，进一步涉及本公开所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，或其药物组合物，其用作药物。

本公开的另一方面，进一步涉及本公开所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，或其组合物、或其药物组合物；或者，本公开所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐、或其药物组合物，在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的用途；优选其中所述的肿瘤为与TLR7、HER2、HER3或EGFR表达相关的癌症。

本公开的另一方面，进一步涉及本公开所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，或其组合物、或其药物组合物；或者，本公开所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐、或其药物组合物，在制备治疗和/或预防癌症的药物的用途，所述癌症优选选自乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肾癌、尿道癌、、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肺癌(例如，小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌、前列腺癌或淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或复发性间变性大细胞淋巴瘤)。

本公开的另一方面，进一步涉及本公开所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，或其组合物、或其药物组合物；或者，本公开所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐、或其药物组合物，在制备用于治疗由病毒引起的感染的药物中的用途，所述病毒选自：登革热病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、昆津病毒、墨累山谷脑炎病毒、圣路易脑炎病毒、鄂木斯克出血热病毒、牛病毒性腹泻病毒、济卡病毒、HIV、HBV、HCV、HPV、RSV、SARS和流感病毒。

本公开的另一方面，进一步涉及一种用于治疗和/或预防肿瘤的方法，该方法包括向需要其的患者施用治疗有效剂量的本公开所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，或其组合物、或其药物组合物；或者，本公开所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐、或其药物组合物；优选其中所述的肿瘤为与TLR7、HER2、HER3或EGFR表达相关的癌症。

本公开的另一方面，进一步涉及一种用于治疗或预防癌症的方法，该方法包括向需要其的患者施用治疗有效剂量的本公开所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，或其组合物、或其药物组合物；或者，本公开所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐、或其药物组合物；所述癌症优选选自乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肾癌、尿道癌、、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肺癌(例如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌或淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或复发性间变性大细胞淋巴瘤)。

本公开的另一方面，进一步涉及一种用于治疗由病毒引起的感染的方法，该方法包括向需要其的患者施用治疗有效剂量的本公开所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，或其组合物、或其药物组合物；或者，本公开所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐、或其药物组合物；所述病毒选自：登革热病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、昆津病毒、墨累山谷脑炎病毒、圣路易脑炎病毒、鄂木斯克出血热病毒、牛病毒性腹泻病毒、济卡病毒、HIV、HBV、HCV、HPV、RSV、SARS和流感病毒。

可将活性化合物(包括化合物或配体药物偶联物)制成适合于通过任何适当途径给药的形式，活性化合物优选是以单位剂量的方式，或者是以患者可以以单剂自我给药的方式。本公开化合物或组合物的单位剂量的表达方式可以是片剂、胶囊、扁囊剂、瓶装药水、药粉、颗粒剂、锭剂、栓剂、再生药粉或液体制剂。

本公开治疗方法中所用化合物或组合物的剂量通常将随疾病的严重性、患者的体重和化合物的相对功效而改变。不过，作为一般性指导，合适的单位剂量可以是0.1mg～1000mg。

本公开的药物组合物除活性化合物外，可含有一种或多种辅料，所述辅料选自以下成分：填充剂、稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂或赋形剂等。根据给药方法的不同，组合物可含有0.1至99重量％的活性化合物。

含活性成分的药物组合物可以是适用于口服的形式，例如片剂、糖锭剂、锭剂、水或油混悬液、可分散粉末或颗粒、乳液、硬或软胶囊，或糖浆剂或酏剂。可按照本领域任何已知制备药用组合物的方法制备口服组合物，此类组合物可含有粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或药学上可接受的润湿剂等，此类组合物还可以含有一种或多种选自以下的成分：甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂，以提供悦目和可口的药用制剂。

水悬浮液含有活性物质和用于混合的适宜制备水悬浮液的赋形剂。水混悬液也可以含有一种或多种防腐剂例、一种或多种着色剂、一种或多种矫味剂和一种或多种甜味剂。

油混悬液可通过使活性成分悬浮于植物油中配制而成。油悬浮液可含有增稠剂。可加入上述的甜味剂和矫味剂，以提供可口的制剂。

药物组合物还可以是用于制备水混悬液的可分散粉末和颗粒提供活性成分，通过加入水混合分散剂、湿润剂、悬浮剂或防腐剂中的一种或多种。也可加入其他赋形剂例如甜味剂、矫味剂和着色剂。通过加入抗氧化剂例如抗坏血酸保存这些组合物。

本公开的药物组合物也可以是水包油乳剂的形式。

药物组合物可以是无菌注射水溶液形式。可以使用的可接受的溶媒或溶剂有水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。无菌注射制剂可以是其中活性成分溶于油相的无菌注射水包油微乳。例如将活性成分溶于大豆油和卵磷脂的混合物中。然后将油溶液加入水和甘油的混合物中处理形成微乳。可通过局部大量注射，将注射液或微乳注入患者的血流中。或者，最好按可保持本公开化合物恒定循环浓度的方式给予溶液和微乳。为保持这种恒定浓度，可使用连续静脉内递药装置。这种装置的实例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型静脉注射泵。

药物组合物可以是用于肌内和皮下给药的无菌注射水或油混悬液的形式。可按已知技术，用上述那些适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制该混悬液。无菌注射制剂也可以是在肠胃外可接受的无毒稀释剂或溶剂中制备的无菌注射溶液或混悬液。此外，可方便地用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。

可按用于直肠给药的栓剂形式给予本公开化合物。可通过将药物与在普通温度下为固体但在直肠中为液体，因而在直肠中会溶化而释放药物的适宜的无刺激性赋形剂混合来制备这些药物组合物。此类物质包括可可脂、甘油明胶、氢化植物油、各种分子量的聚乙二醇和聚乙二醇的脂肪酸酯的混合物。

如本领域技术人员所熟知的，药物的给药剂量依赖于多种因素，包括但并非限定于以下因素：所用具体化合物的活性、患者的年龄、患者的体重、患者的健康状况、患者的行为、患者的饮食、给药时间、给药方式、排泄的速率、药物的组合、疾病的严重性等；另外，最佳的治疗方式如治疗的模式、通式化合物的日用量或可药用的盐的种类可以根据传统的治疗方案来验证。

发明的详细说明

除非另有限定，本文所用的所有技术和科学术语均与本公开所属领域普通技术人员的通常理解一致。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料实施或测试本公开，但本文描述了优选的方法和材料。描述和要求保护本公开时，依据以下定义使用下列术语。

当本公开中使用商品名时，旨在包括该商品名产品的制剂、该商品名产品的非专利药和活性药物部分。

除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。

术语“配体”是能识别和结合目标细胞相关的抗原或受体的大分子化合物。配体的作用是将药物呈递给与配体结合的目标细胞群，这些配体包括但不限于蛋白类激素、凝集素、生长因子、抗体或其他能与细胞结合的分子。在本公开实施方式中，配体表示为Pc，配体可通过配体上的杂原子与连接单元形成连接键，优选为抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体或鼠源抗体；优选为单克隆抗体。

术语“药物”是指细胞毒性药物或免疫调节剂。细胞毒性药物能在肿瘤细胞内具有较强破坏其正常生长的化学分子。细胞毒性药物原则上在足够高的浓度下都可以杀死肿瘤细胞，但是由于缺乏特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会导致正常细胞的凋亡，导致严重的副作用。该术语包括毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，放射性同位素(例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素)，化疗药物，抗生素和核溶酶。免疫调节剂是免疫关卡分子的抑制剂。本公开的一此实施方案中，药物表示为D，属于免疫调节剂，特别是TLR7激动剂。

术语“接头单元(或连接片段)”是指指一端与配体连接而另一端与药物相连的化学结构片段或键，也可以连接其他接头后再与药物相连。

接头，包括延伸物、间隔物和氨基酸单元，可以通过本领域已知方法合成，诸如US2005-0238649A1中所记载的。接头可以是便于在细胞中释放药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Research 52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。

术语“配体-药物偶联物”，指配体通过稳定的连接单元与具有生物活性的药物相连。在本公开中“配体-药物偶联物”优选为抗体-药物偶联物(antibody drug conjugate，ADC)，指把单克隆抗体或者抗体片段通过稳定的连接单元与具有生物活性的毒性药物相连。

本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

术语“抗体”包括全长抗体及其抗原结合片段。

术语“全长抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。本公开所述的抗体优选为针对靶细胞上细胞表面抗原的特异性抗体，非限制性实施例为以下抗体：抗HER2(ErbB2)抗体、抗EGFR抗体、抗B7-H3抗体、抗c-Met抗体、抗HER3(ErbB3)抗体、抗HER4(ErbB4)抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD44抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD73抗体、抗CD105抗体、抗CEA抗体、抗A33抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗G250抗体、抗MUCl抗体、抗Lewis Y抗体、抗VEGFR抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin-C抗体、抗SLC44A4抗体或抗Mesothelin抗体中一个或多个；优选为曲妥珠单抗(Trastuzumab，商品名Herceptin)、帕妥珠单抗(Pertuzumab，也被称作2C4，商品名Perjeta)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab，商品名泰欣生)、Enoblituzumab、Emibetuzumab、Inotuzumab、Pinatuzumab、Brentuximab、Gemtuzumab、Bivatuzumab、Lorvotuzumab、cBR96和Glematumamab。

抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。

本公开的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体，优选人源化抗体和全人源抗体。

术语“全人源抗体”、“全人抗体”或“完全人源抗体”，也称“全人源单克隆抗体”，其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。单克隆抗体的发展经历了四个阶段，分别为：鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。本公开为全人源单克隆抗体。全人抗体制备的相关技术主要有：人杂交瘤技术、EBV转化B淋巴细胞技术、噬菌体显示技术(phage display)、转基因小鼠抗体制备技术(transgenic mouse)和单个B细胞抗体制备技术等。

术语“抗原结合片段”是指抗体的保持特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。已显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。“抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段；(v)单结构域或dAb片段(Ward等人,(1989)Nature341：544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)可任选地通过合成的接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85:5879-5883)。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选片段。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

Fab是通过用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H链的224位的氨基酸残基)处理IgG抗体分子所获得的片段中的具有约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中H链N端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。

F(ab')2是通过用酶胃蛋白酶消化IgG铰链区中两个二硫键的下方部分而获得的分子量为约100,000并具有抗原结合活性并包含在铰链位置相连的两个Fab区的抗体片段。

Fab'是通过切割上述F(ab')2的铰链区的二硫键而获得的分子量为约50,000并具有抗原结合活性的抗体片段。

此外，可以通过将编码抗体的Fab'片段的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab'来生产所述Fab'。

术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；VH)和抗体轻链可变结构域(或区域；VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH₂-VL-接头-VH-COOH或NH₂-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成，例如使用1-4个重复的变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。可用于本公开的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno l.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。

术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication91-3242)提供。

术语“抗体框架”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。

术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。

术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10^-7M，例如大约小于10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(KD)结合。

术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。

术语“载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。在另一个实施方案中，载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。本文中公开的载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。

现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。本公开所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http://imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。

术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。

本公开工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或GSepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用PH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即，如-70℃，或者冻干。

术语“肽”是指介于氨基酸和蛋白质之间的化合物片段，由2个或2个以上氨基酸分子通过肽键相互连接而成，是蛋白质的结构与功能片段，如激素、酶类等本质上都是肽。

术语“糖”是指由C、H、O三种元素组成的生物大分子，可分为单糖、二糖和多糖等。

术语“荧光探针”是指在紫外-可见-近红外区有特征荧光，并且其荧光性质(激发和发射波长、强度、寿命和偏振等)可随所处环境的性质，如极性、折射率、粘度等改变而灵敏地改变的一类荧光性分子，其与核酸(DNA或RNA)、蛋白质或其他大分子结构非共价相互作用而使一种或几种荧光性质发生改变，可用于研究大分子物质的性质和行为。

术语“毒性药物”是指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。包括毒素和其他能用于肿瘤治疗的化合物。

术语“化疗药物”是可用于治疗肿瘤的化学化合物。该定义还包括起调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果作用的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。

术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12个)碳原子的烷基，更优选含有1至10个碳原子的烷基，最优选含有1至6个碳原子的烷基。非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。更优选的是含有1至6个碳原子的低级烷基，非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基和氧代基。

术语“亚烷基”指饱和的直链或支链脂肪族烃基，其具有2个从母体烷的相同碳原子或两个不同的碳原子上除去两个氢原子所衍生的残基，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12个)碳原子，更优选含有1至6个碳原子的亚烷基。亚烷基的非限制性实例包括但不限于亚甲基(-CH₂-)、1,1-亚乙基(-CH(CH₃)-)、1,2-亚乙基(-CH₂CH₂)-、1,1-亚丙基(-CH(CH₂CH₃)-)、1,2-亚丙基(-CH₂CH(CH₃)-)、1,3-亚丙基(-CH₂CH₂CH₂-)、1,4-亚丁基(-CH₂CH₂CH₂CH₂-)和1,5-亚丁基(-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-)等。亚烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选独立地任选选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基和氧代基中的一个或多个取代基所取代。

术语“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的环烷基)，其中烷基或环烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。

术语“环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，环烷基环包含3至20个碳原子，优选包含3至12个碳原子，更优选包含3至10个碳原子，最优选包含3至8个(例如3、4、5、6、7和8个)碳原子。单环环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基和环辛基等；多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。

术语“亚环烷基”指环烷基上具有2个从母体环烷基的环原子上除去两个氢原子所衍生的残基。所述的环烷基如上所定义。

术语“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其包含3至20个环原子，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)_m(其中m是整数0至2)的杂原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的环部分，其余环原子为碳。优选包含3至12个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11和12个)环原子，其中1～4个(例如1、2、3和4个)是杂原子；更优选环烷基环包含3至10个环原子。单环杂环基的非限制性实例包括吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基和高哌嗪基等。多环杂环基包括螺环、稠环和桥环的杂环基。

术语“螺杂环基”指5至20元的单环之间共用一个原子(称螺原子)的多环杂环基团，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)_m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。优选为6至14元，更优选为7至10元(例如7、8、9或10元)。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺杂环基分为单螺杂环基、双螺杂环基或多螺杂环基，优选为单螺杂环基和双螺杂环基。更优选为4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元/6元单螺杂环基。螺杂环基的非限制性实例包括：

术语“稠杂环基”指5至20元，系统中的每个环与体系中的其他环共享毗邻的一对原子的多环杂环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)_m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元(例如7、8、9或10元)。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠杂环基，优选为双环或三环，更优选为5元/5元或5元/6元双环稠杂环基。稠杂环基的非限制性实例包括：

术语“桥杂环基”指5至14元，任意两个环共用两个不直接连接的原子的多环杂环基团，其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)_m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元(例如7、8、9或10元)。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥杂环基，优选为双环、三环或四环，更优选为双环或三环。桥杂环基的非限制性实例包括：

所述杂环基环可以稠合于芳基、杂芳基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂环基，其非限制性实例包括：

等。

杂环基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基和氧代基。

术语“亚杂环基”指杂环基上具有2个从母体杂环基的相同或不同的环原子上除去两个氢原子所衍生的残基。所述的杂环基如上所定义。

术语“芳基”指具有共轭的π电子体系的6至14元全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，优选为6至10元，例如苯基和萘基，优选苯基。所述芳基环可以稠合于杂芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为芳基环，其非限制性实例包括：

芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基和杂环烷硫基。

术语“杂芳基”指包含1至4个杂原子、5至14个环原子的杂芳族体系，其中杂原子选自氧、硫和氮。杂芳基优选为5至10元(例如5、6、7、8、9或10元)，更优选为5元或6元，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基和四唑基等。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环，其非限制性实例包括：

杂芳基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基和杂环烷硫基。

术语“氨基保护基”是为了使分子其它部位进行反应时氨基保持不变，用易于脱去的基团对氨基进行保护。非限制性实施例包含9-芴甲氧羰基、叔丁氧羰基、乙酰基、苄基、烯丙基和对甲氧苄基等。这些基团可任选地被选自卤素、烷氧基或硝基中的1-3个取代基所取代。所述氨基保护基优选为9-芴甲氧羰基。

术语“烯基”指分子中含有碳碳双键的烷基化合物，其中烷基的定义如上所述。烯基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自氢原子、烷基、烷氧基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基。

术语“炔基”指分子中含有碳碳三键的烷基化合物，其中烷基的定义如上所述。炔基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自氢原子、烷基、烷氧基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基。

术语“环烷基烷基”指烷基被一个或多个环烷基取代，优选被一个环烷基取代，其中烷基如上所定义，其中环烷基如上所定义。

术语“卤代烷基”指烷基被一个或多个卤素取代，其中烷基如上所定义。

术语“氘代烷基”指烷基被一个或多个氘原子取代，其中烷基如上所定义。

术语“羟基”指-OH基团。

术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。

术语“氨基”指-NH₂。

术语“硝基”指-NO₂。

术语“酰胺基”指-C(O)N(烷基)或(环烷基)，其中烷基、环烷基如上所定义。

术语“羧酸酯基”指-C(O)O(烷基)或(环烷基)，其中烷基、环烷基如上所定义。

化学式中简称“Me”为甲基。

本公开还包括各种氘化形式的化合物。与碳原子连接的各个可用的氢原子可独立地被氘原子替换。本领域技术人员能够参考相关文献合成氘化形式的化合物。在制备氘代形式的化合物时可使用市售的氘代起始物质，或它们可使用常规技术采用氘代试剂合成，氘代试剂包括但不限于氘代硼烷、三氘代硼烷四氢呋喃溶液、氘代氢化锂铝、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。

“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。

“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为最多5个，更优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻，取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。

术语“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

术语“药学上可接受的盐”或“可药用盐”是指本公开配体-药物偶联物的盐，或本公开中所述的化合物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性，本公开抗体-抗体药物偶联化合物至少含有一个氨基，因此可以与酸形成盐，可药用盐的非限制性实例包括：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、抗坏血酸盐、草酸盐、硝酸盐、梨酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、水杨酸盐、柠檬酸氢盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐。

术语“载药量”是指配体-药物偶联物中每个配体上加载的细胞毒性药物平均数量，也可以表示为药物量和抗体量的比值，药物载量的范围可以是每个配体(Pc)连接0-12个，优选1-10个细胞毒性药物(D)。在本公开的实施方式中，载药量表示为y，示例性的可以为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10的均值，范围为0-12，优选1-10，更优选1-8，或2-8，或2-7，或3-8，或3-7，或3-6，或4-7，或4-6，或4-5的均值。可用常规方法如UV/可见光光谱法，质谱，ELISA试验、CE-SDS法和HPLC特征鉴定偶联反应后每个ADC分子的药物平均数量。

可以用以下非限制性方法控制配体细胞毒性药物偶联物的载量，包括：

(1)控制连接试剂和单抗的摩尔比，

(2)控制反应时间和温度，

(3)选择不同的反应试剂。

常规的药物组合物的制备见中国药典。

术语“载体”用于本公开的药物，是指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系。药物载体释放和靶向系统能够减少药物降解及损失，降低副作用，提高生物利用度。如可作为载体的高分子表面活性剂由于其独特的两亲性结构，可以进行自组装，形成各种形式的聚集体，优选的实例如胶束、微乳液、凝胶、液晶、囊泡等。这些聚集体具有包载药物分子的能力，同时又对膜有良好的渗透性，可以作为优良的药物载体。

术语“赋形剂”是在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂。

术语“稀释剂”又称填充剂，其主要用途是增加片剂的重量和体积。稀释剂的加入不仅保证一定的体积大小，而且减少主要成分的剂量偏差，改善药物的压缩成型性等。当片剂的药物含有油性组分时，需加入吸收剂吸收油性物，使保持“干燥”状态，以利于制成片剂。如淀粉、乳糖、钙的无机盐、微晶纤维素等。

药物组合物可以是无菌注射水溶液形式。可在使用的可接受的溶媒和溶剂中有水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。无菌注射制剂可以是其中活性成分溶于油相的无菌注射水包油微乳。例如将活性成分溶于大豆油和卵磷脂的混合物中。然后将油溶液加入水和甘油的混合物中处理形成微乳。可通过局部大量注射，将注射液或微乳注入患者的血流中。或者，最好按可保持本公开化合物恒定循环浓度的方式给予溶液和微乳。为保持这种恒定浓度，可使用连续静脉内递药装置。这种装置的实例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型静脉注射泵。

药物组合物可以是用于肌内和皮下给药的无菌注射水或油混悬液的形式。可按已知技术，用上述那些适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制该混悬液。无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中制备的无菌注射溶液或混悬液，例如1,3-丁二醇中制备的溶液。此外，可方便地用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用包括合成甘油单或二酯在内的任何调和固定油。此外，脂肪酸例如油酸也可以制备注射剂。

本公开涉及一类可裂解的特定结构的连接臂和特定结构的活性物，及由连接臂、活性物与抗体组成的抗体药物偶联物(ADC)。此类ADC是经由间隔物将一种毒性物质连于抗体而形成的复合物。该抗体偶联药物(ADC)在体内经降解而释放出活性分子，从而起到抗肿瘤的作用。

本公开的合成方法

为了完成本公开的合成目的，本公开采用如下的合成技术方案：

具体实施方式

以下结合实施例进一步描述本公开，但这些实施例并非限制本公开的范围。

本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

一、抗体实施例

以下抗体按抗体常规方法进行制备：如可进行载体构建后，转染真核细胞如HEK293细胞(Life Technologies Cat.No.11625019)，纯化表达。

以下为Trastuzumab的序列

轻链

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:1

重链

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:2

二、化合物实施例

实施例

化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或/和质谱(MS)来确定的。NMR位移(δ)以10^-6(ppm)的单位给出。NMR的测定是用Bruker AVANCE-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d₆)、氘代氯仿(CDCl₃)、氘代甲醇(CD₃OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)。

MS的测定用Agilent 1200/1290 DAD-6110/6120 Quadrupole MS液质联用仪(生产商：Agilent，MS型号：6110/6120 Quadrupole MS)、waters ACQuity UPLC-QD/SQD(生产商：waters，MS型号：waters ACQuity Qda Detector/waters SQ Detector)、THERMOUltimate 3000-Q Exactive(生产商：THERMO，MS型号：THERMO Q Exactive)。

高效液相色谱法(HPLC)分析使用Agilent HPLC 1200DAD、Agilent HPLC 1200VWD和Waters HPLC e2695-2489高压液相色谱仪。

手性HPLC分析测定使用Agilent 1260 DAD高效液相色谱仪。

高效液相制备使用Waters 2545-2767、Waters 2767-SQ Detecor2、Shimadzu LC-20AP和Gilson GX-281制备型色谱仪。

手性制备使用Shimadzu LC-20AP制备型色谱仪。

CombiFlash快速制备仪使用Combiflash Rf200(TELEDYNE ISCO)。

薄层层析硅胶板使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm。

硅胶柱色谱法一般使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。

激酶平均抑制率及IC₅₀值的测定用NovoStar酶标仪(德国BMG公司)。

本公开的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，或可购买自ABCR GmbH&Co.KG，Acros Organics，Aldrich Chemical Company，韶远化学科技(AccelaChemBio Inc)、达瑞化学品等公司。

实施例中无特殊说明，反应能够均在氩气氛或氮气氛下进行。

氩气氛或氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氩气或氮气气球。

氢气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氢气气球。

加压氢化反应使用Parr 3916EKX型氢化仪和清蓝QL-500型氢气发生器或HC2-SS型氢化仪。

氢化反应通常抽真空，充入氢气，反复操作3次。

微波反应使用CEM Discover-S 908860型微波反应器。

实施例中无特殊说明，溶液是指水溶液。

实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20℃～30℃。

实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)，反应所使用的展开剂，纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂体系包括：A：二氯甲烷/甲醇体系，B：正己烷/乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和醋酸等碱性或酸性试剂进行调节。

实施例2-1 1

4-氨基-2-丁氧基-7-(4-(哌嗪-1-基甲基)苄基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲腈1

第一步

(9H-芴-9-基)甲基(4-(溴甲基)苄基)氨基甲酸酯1b

(9H-fluoren-9-yl)methyl(4-(bromomethyl)benzyl)carbamate

称取(4-(溴甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯1a(5.16g，17.19mmol，供应商毕得)置于反应瓶中，依次加入乙腈(30mL)和4M的盐酸的1,4-二氧六环溶液(20mL)，剧烈搅拌下室温反应1小时。反应液减压浓缩除去有机溶剂，再加入50mL正己烷，减压浓缩。所得残余物溶于1,4-二氧六环(50ml)和水(10ml)，依次加入碳酸氢钠(8.66g，103.14mmol)和氯甲酸-9-芴基甲酯(4.00g，15.46mmol)，室温搅拌反应1小时。加水(100mL)，用乙酸乙酯萃取(50mL×3)，合并有机相，有机相依次用水(50mL×2)和饱和氯化钠溶液(50mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题产物1b(6.12g，产率：84.3％)。

MS m/z(ESI):422.0[M+1]

第二步

4-(4-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯1c

将1b(1.30g，3.08mmol)加入到乙腈(30mL)中，依次加入无水碳酸钾(638mg，4.62mmol)和哌嗪-1-基甲酸叔丁酯(860mg，4.62mmol)，加毕室温搅拌反应2小时。减压浓缩除去有机溶剂，加水(30mL)，用乙酸乙酯萃取(30mL×3)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题产物1c(1.41g，产率：86.8％)。

MS m/z(ESI):528.2[M+1]

第三步

4-(4-(氨基甲基)苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯1d

将1c(1.41g，2.67mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，加入二乙胺(15mL)，室温搅拌3小时。反应液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化，得到1d(735mg，产率：90.1％)。

MS m/z(ESI):306.2[M+1]

第四步

4-(4-(((2-乙氧基-2-氧代乙基)氨基)甲基)苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯1e

将1d(182mg，0.596mmol)加入到四氢呋喃(2mL)中，加入溴乙酸乙酯(105mg，0.626mmol)，加入三乙胺(121mg，1.192mmol)，室温搅拌16小时。加水(10mL)，用二氯甲烷萃取(15mL×3)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化所得残余物得到标题产物1e(158mg，产率：67.8％)。

MS m/z(ESI):392.3[M+1]

第五步

4-(4-(((2-丁氧基-6-氯-5-甲酰基嘧啶-4-基)(2-乙氧基-2-氧代乙基)氨基)甲基)苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯1g

将1e(158mg，0.40mmol)溶于无水四氢呋喃(3mL)，加入2-丁氧基-4,6-二氯嘧啶-5-甲醛1f(111mg，0.45mmol，参照专利“CN108794486”中说明书第28页的实施例1提供的方法合成)，加入三乙胺(82mg，0.81mmol)，室温搅拌2小时。反应液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题产物1g(220mg，产率：90.2％)。

MS m/z(ESI):604.2[M+1]

第六步

4-(4-((4-氨基-2-丁氧基-6-氨基甲酰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯1h

将1g(220mg，0.36mmol)溶于7M的氨的甲醇溶液(15mL)中，闷罐130℃搅拌反应20小时。反应液冷却至室温，减压浓缩除去有机溶剂，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化，得到标题产物1h(83mg，产率：42.3％)。

MS m/z(ESI):538.0[M+1]

第七步

将1h(65mg，0.12mmol)置于反应瓶中，加入三氯氧磷(3mL)，氩气保护，加热至85℃，搅拌反应1小时。反应液冷却至室温，减压浓缩除去大部分三氯氧磷，所得残余物置于常温水浴中，缓慢滴加无水甲醇(3mL)，加毕室温搅拌3小时。减压浓缩除去甲醇，残余物溶于二甲亚砜(3mL)，用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridge Prep C18 OBD 5μm19*250mm；流动相:A-水(10mmol NH₄OAc)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩得到标题产物1(15mg产率：29.6％)。

MS m/z(ESI):420.0[M+1]

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.35-7.26(m,5H),5.39(s,2H),4.37(t,2H),3.57(s,2H),3.13-3.07(m,3H),2.63-2.56(m,3H),1.93(s,3H),1.81-1.72(m,2H),1.55-1.46(m,2H),1.36-1.27(m,2H),0.98(t,3H).

实施例2-2 2

(S)-4-氨基-7-(4-((3-氨基吡咯烷-1-基)甲基)苄基)-2-丁氧基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲腈2

第一步

(S)-(1-(4-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)甲基)苄基)吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯2b

将1b(400mg，0.947mmol)加入到8mL乙腈中，加入碳酸钾(193mg，1.42mmol)，加入(S)-3-叔丁氧羰基氨基吡咯烷2a(264.6mg，1.42mmol,供应商Ark)，加毕室温搅拌反应2小时。反应液倒入10mL水中，用乙酸乙酯萃取(10mL×3)，合并有机相，有机相用水(20mL)洗涤，饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物2b(342mg，产率：68.5％)。

MS m/z(ESI):528.0[M+1]

第二步

(S)-(1-(4-(氨基甲基)苄基)吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯2c

将2b(340mg,0.64mmol)加入到1.5mL二氯甲烷中，加入二乙胺(3mL)，加毕室温搅拌6小时。将反应液旋干，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化，得到标题产物2c(150mg，产率：76.2％)。

MS m/z(ESI):306[M+1]

第三步

(S)-(4-((3-((叔丁氧基羰基)氨基)吡咯烷-1-基)甲基)苄基)甘氨酸乙酯2d

将2c(140mg，0.458mmol)加入到2mL四氢呋喃中，加入溴乙酸乙酯(76.5mg，0.458mmol)，加入三乙胺(92.7mg，0.916mmol)，室温搅拌3小时。反应液减压浓缩后，向体系中加入水(8mL)，用二氯甲烷萃取(8mL×3)，合并有机相，有机相分别用水(10mL)，饱和氯化钠溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物得到标题产物2d(115mg，产率：64.0％)。

MS m/z(ESI):392.1[M+1]

第四步

(S)-N-(2-丁氧基-6-氯-5-甲酰基嘧啶-4-基)-N-(4-((3-((叔丁氧基羰基)氨基)吡咯烷-1-基)甲基)苄基)甘氨酸乙酯2e

将2d(111mg，0.283mmol)加入到2mL四氢呋喃中，加入1f(77.6mg，0.311mmol)，加入三乙胺(43mg，0.425mmol)，室温搅拌2小时。反应液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物2e(147mg，产率：85.8％)。

MS m/z(ESI):603.9[M+1]

第五步

(S)-(1-(4-((4-氨基-2-丁氧基-6-氨基甲酰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)苄基)吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯2f

将2e(147mg，0.243mmol)加入到14mL 7M氨甲醇溶液中，闷罐130℃搅拌反应20小时。反应液冷却至室温，减压浓缩后，所得残余物用薄层色谱法以展开剂体系A纯化，得到标题产物2f(56mg，产率：42.8％)。

MS m/z(ESI):538.2[M+1]

第六步

将2f(35mg，0.065mmol)置于反应瓶中，加入三氯氧磷(2mL)，反应液温度升至85℃，搅拌反应3小时。反应液冷却至室温，减压浓缩，向反应液中加入10mL饱和碳酸氢钠溶液，用10％(v/v)的甲醇的二氯甲烷溶液(15mL×3)萃取，合并有机相，饱和氯化钠溶液(30mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液减压浓缩，所得残余物用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm；流动相:A-水(10mmolNH₄OAc)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩得到标题产物2(6.1mg产率：22.3％)。

MS m/z(ESI):420.3[M+1]

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.40-7.25(m,5H),5.39(s,2H),4.37(t,2H),3.70(s,2H),2.95-2.85(m,2H),2.67-2.59(m,2H),2.46-2.39(m,1H),2.34-2.24(m,2H),1.81-1.69(m,3H),1.56-1.45(m,2H),1.38-1.28(m,2H),0.98(t,3H).

实施例2-3 3

4-氨基-2-丁氧基-7-(2-甲氧基-4-(哌嗪-1-基甲基)苄基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲腈3

第一步

(4-(氨基甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇3b

将4-(氨基甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯3a(600mg，3.07mmol，采用专利申请“US2010/16373,2010,A1”第14页Preparation 86公开的方法制备而得)加入到15mL四氢呋喃中，氩气置换三次，冰浴冷却至0℃，慢慢滴加1M四氢锂铝的四氢呋喃溶液(3.7mL，3.69mmol)，加毕，冰浴反应1小时后自然升至室温继续搅拌反应1.5小时。冰浴下向反应液中依次加入140mg水，420mg 15％氢氧化钠溶液，420mg水，再加入无水硫酸钠，室温搅拌10分钟，过滤，滤液减压浓缩得到粗品产物3b(514mg，产率：100％)。产品不经纯化直接进行下一步反应。

第二步

(9H-芴-9-基)甲基(4-(羟基甲基)-2-甲氧基苄基)氨基甲酸酯3c

将3b(514mg，3.07mmol)加入到20mL 1,4-二氧六环中，加入4mL水，加入碳酸氢钠(775mg，9.22mmol)，再加入氯甲酸-9-芴基甲酯(791mg，3.06mmol)，加毕，室温反应2小时。加入30mL水中，用乙酸乙酯萃取(10mL×3)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物3c(495mg，产率：41.3％)。

MS m/z(ESI):390.3[M+1]

第三步

(9H-芴-9-基)甲基(4-(溴甲基)-2-甲氧基苄基)氨基甲酸酯3d

将3c(495mg，3.07mmol)加入到20mL氢溴酸和4mL四氢呋喃中，加热至85℃反应2小时。反应液减压浓缩，冰浴下加入饱和碳酸钠溶液调节pH大于7，用二氯甲烷萃取(20mL×3)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(60mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题产物3d(596mg，产率：100％)。

MS m/z(ESI):452.2[M+1]

第四步

4-(4-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)甲基)-3-甲氧基苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯3f

将哌嗪-1-甲酸叔丁酯3e(200mg，1.07mmol，供应商：韶远)加入到10mL乙腈中，加入碳酸钾(244mg，1.77mmol)，再加入3d(400mg，0.88mmol)，加毕，室温搅拌反应1.2小时。反应液减压浓缩，残余物中加入30mL水中，用乙酸乙酯萃取(15mL×3)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物3f(354mg，产率：71.8％)。

MS m/z(ESI):558.3[M+1]

第五步

4-(4-(氨基甲基)-3-甲氧基苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯3g

将3f(354mg，0.63mmol)加入到2mL二氯甲烷中，加入4mL二乙胺，室温搅拌4小时。反应液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化所得残余物，得到标题产物3g(202mg，产率：94.9％)。

MS m/z(ESI):336.4[M+1]

第六步

4-(4-(((2-乙氧基-2-氧代乙基)氨基)甲基)-3-甲氧基苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯3h将3g(202mg，0.60mmol)加入到8mL四氢呋喃中，滴加溴乙酸乙酯(105mg，0.63mmol)，再滴入三乙胺(183mg，1.81mmol)，加毕，室温搅拌反应23小时。反应液减压浓缩，所得残余物中加入水20mL，用二氯甲烷萃取(10mL×3)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化，得到标题产物3h(210mg，产率：82.7％)。

MS m/z(ESI):422.4[M+1]

第七步

4-(4-(((2-丁氧基-6-氯-5-甲酰基嘧啶-4-基)(2-乙氧基-2-氧代乙基)氨基)甲基)-3-甲氧基苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯3i

将1f(130mg，0.52mmol)加入到8mL四氢呋喃中，加入3h(210mg，0.50mmol)，加入三乙胺(76mg，0.75mmol)室温搅拌2小时。反应液减压浓缩，残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题产物3i(236mg，产率：74.7％)。MS m/z(ESI):634.3[M+1]

第八步

4-(4-((4-氨基-2-丁氧基-6-氨基甲酰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)-3-甲氧基苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯3j

将3i(236mg，0.37mmol)加入到7M的氨的甲醇溶液(20mL)中，闷罐130℃搅拌反应22小时。反应液冷却至室温，减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化，得到标题产物3j(104mg，产率：49.2％)。

MS m/z(ESI):568.3[M+1]

第九步

将3j(104mg，0.18mmol)加入到4mL三氯氧磷中，升至85℃反应1小时。反应液冷却至室温，减压浓缩，所得残余物中加入10mL饱和碳酸氢钠溶液，用二氯甲烷:甲醇(:V＝10:1)的混合溶剂(8mL×6)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液减压，所得残余物进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm；流动相:A-水(10mmol NH₄OAc)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物3(13mg，产率：15.8％)。

MS m/z(ESI):450.3[M+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.60(br,2H),7.40(s,1H),6.93(s,1H),6.74(dd,2H),5.22(s,2H),4.20(t,2H),3.82(s,3H),3.55(s,2H),2.68-2.60(m,4H),2.33-2.25(m,4H),1.64-1.60(m,2H),1.49-1.41(m,1H),1.39-1.33(m,2H),0.91(t,3H).

实施例2-4 4

(S)-N-(1-(4-((4-氨基-2-丁氧基-6-氰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)苄基)吡咯烷-3-基)乙酰胺4

将化合物2(3mg，0.007mmol)加入到2mL二氯甲烷中，加入乙酸(0.86mg，0.014mmol)，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(2.5mg，0.014mmol)，加入1-羟基苯并三唑(2.2mg，0.014mmol)，加入N,N-二异丙基乙胺(2.7mg，0.021mmol)，加毕室温搅拌反应2小时。反应液减压浓缩，所得残余物溶于二甲亚砜(2mL)，用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：Sharpsil-T Prep C18 5μm30*150mm；流动相:A-水(10mmolNH₃HCO₃)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：30mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩得到标题产物4(3.1mg，产率：93.9％)。

MS m/z(ESI):462.3[M+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.95-7.93(d,1H),7.78-7.50(br,2H),7.40(s,1H),7.32-7.23(m,2H),7.19-7.13(m,2H),5.30(s,2H),4.25(t,2H),4.13-4.05(m,1H),3.56-3.45(m,2H),2.64-2.55(m,1H),2.37-2.29(m,1H),2.27-2.20(m,1H),2.08-1.95(m,2H),1.80(s,1H),1.74(s,3H),1.70-1.60(m,2H),1.54-1.43(m,1H),1.42-1.34(m,1H),0.91(t,3H).

实施例2-5 5

4-氨基-2-丁氧基-7-(2-甲氧基-4-((4-(甲基氨基)哌啶-1-基)甲基)苄基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲腈5

第一步

(1-(4-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)甲基)-3-甲氧基苄基)哌啶-4-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯5b

将甲基(哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯5a(202mg，0.947mmol，供应商：韶远)加入到10mL乙腈中，加入碳酸钾(257mg，1.89mmol)，再加入3d(428mg，0.95mmol)，加毕，室温搅拌反应2小时。反应液减压浓缩，残余物中加入30mL水中，用乙酸乙酯萃取(15mL×3)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物5b(327mg，产率：58.9％)。

MS m/z(ESI):586.3[M+1]

第二步

(1-(4-(氨基甲基)-3-甲氧基苄基)哌啶-4-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯5c

将5b(327mg，0.56mmol)加入到3mL二氯甲烷中，加入6mL二乙胺，室温搅拌3.5小时。反应液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化所得残余物，得到标题产物5c(197mg，产率：97.0％)。

MS m/z(ESI):364.3[M+1]

第三步

(4-((4-((叔丁氧羰基)(甲基)氨基)哌啶-1-基)甲基)-2-甲氧基苄基)甘氨酸乙酯5d

将5c(187mg，0.514mmol)加入到6mL四氢呋喃中，滴加溴乙酸乙酯(86mg，0.514mmol)，再滴入三乙胺(104mg，1.03mmol)，加毕，室温搅拌反应4小时。反应液减压浓缩，所得残余物中加入水20mL，用二氯甲烷萃取(10mL×3)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化，得到标题产物5d(203mg，产率：87.7％)。

MS m/z(ESI):450.3[M+1]

第四步

N-(2-丁氧基-6-氯-5-甲酰基嘧啶-4-基)-N-(4-((4-((叔丁氧羰基)(甲基)氨基)哌啶-1-基)甲基)-2-甲氧基苄基)甘氨酸乙酯5e

将1f(124mg，0.498mmol)加入到8mL四氢呋喃中，加入5d(203mg，0.452mmol)，加入三乙胺(69mg，0.679mmol)室温搅拌3.5小时。反应液减压浓缩，残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题产物5e(180mg，产率：60.0％)。

MS m/z(ESI):662.1[M+1]

第五步

(1-(4-((4-氨基-2-丁氧基-6-氨基羰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)-3-甲氧基苄基)哌啶-4-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯5f

将5e(180mg，0.27mmol)加入到7M的氨的甲醇溶液(20mL)中，闷罐130℃搅拌反应22小时。反应液冷却至室温，减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化，得到标题产物5f(53mg，产率：32.7％)。

MS m/z(ESI):596.3[M+1]

第六步

将5f(53mg，0.089mmol)加入到4mL三氯氧磷中，升至90℃反应1.5小时。反应液冷却至室温，减压浓缩，所得残余物溶于二甲亚砜(3mL)，用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：Sharpsil-T Prep C18 5μm 30*150mm；流动相:A-水(10mmol NH₃HCO₃)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：30mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩得到标题产物5(10mg，产率：23.5％)。

MS m/z(ESI):478.0[M+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.71-7.51(br,2H),7.41(s,1H),6.93(s,1H),6.79-6.70(m,3H),5.23(s,2H),4.20(t,2H),3.82(s,3H),3.39(s,3H),2.77-2.68(m,3H),2.28-2.24(m,3H),1.95-1.88(m,3H),1.76-1.73(d,2H),1.67-1.58(m,2H)1.42-1.32(m,2H),0.89(t,3H)

实施例2-6 6

4-氨基-2-丁氧基-7-(4-((4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)甲基)-2-甲氧基苄基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲腈6

将化合物3(29mg，0.063mmol)加入到5mL乙腈中，加入碳酸钾(26mg，0.19mmol)，再加入2-溴乙醇(12mg，0.096mmol)，升温至80℃搅拌反应4小时。反应液减压浓缩，加水(10mL)，用氯仿萃取(10mL×3)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(15mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液减压浓缩，所得残余物用薄层色谱法展开剂体系A纯化，得到标题产物6(17mg，产率：54.0％)。

MS m/z(ESI):494.3[M+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.60(br,2H),7.41(s,1H),6.96(s,1H),6.79(d,1H),6.72(d,1H),5.23(s,2H),4.20(t,2H),3.83(s,3H),3.65-3.43(m,5H),2.69-2.33(m,10H),1.68-1.65(m,2H),1.41-1.32(m,2H),0.90(t,3H).

实施例2-7 7

4-((4-(4-((4-氨基-2-丁氧基-6-氰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)苄基)哌嗪-1-基)甲基)-N-(2-(甲基氨基)乙基)苯甲酰胺7

第一步

(2-(4-(氯甲基)苯甲酰氨基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯7c

将4-(氯甲基)苯甲酰氯7a(586mg,3.10mmol,供应商adamas)溶于无水四氢呋喃(20mL)中，依次加入(2-氨基乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯7b(540mg,3.10mmol,供应商韶远)和三乙胺(628mg,6.21mmol)，氩气保护，室温下搅拌2小时。减压浓缩除去有机溶剂，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题产物7c(905mg，产率：89.3％)。

MS m/z(ESI):327.1[M+1]

第二步

(2-(4-((4-(4-((4-氨基-2-丁氧基-6-氰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)苄基)哌嗪-1-基)甲基)苯甲酰氨基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯7d

将化合物1(20.7mg,45.40μmol)加入到N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，依次加入三乙胺(13mg,0.13mmol)和7c(17.8mg,0.54mmol)，氩气保护，加热至50℃搅拌5小时。反应液冷却至室温，加水(10mL)，用二氯甲烷萃取(20mL×3)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(20mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液减压浓缩，所得残余物用薄层层析法以洗脱剂体系A纯化，得到标题产物7d(32.0mg，产率：99.3％)。

MS m/z(ESI):710.2[M+1]

第三步

往7d(32.0mg,45.08μmol)中加入4M的氯化氢的1,4-二氧六环溶液(3mL)，室温搅拌1小时。减压浓缩，残余物溶于二甲亚砜(2mL)，用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：Sharpsil-T Prep C18 5μm 30*150mm；流动相:A-水(10mmol NH₃HCO₃)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：30mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩得到标题产物7(21mg产率：76.4％)。

MS m/z(ESI):610.2[M+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.38(s,1H),7.78(d,2H),7.57(br,2H),7.40(s,1H),7.34(d,2H),7.25(d,2H),7.16(d,2H),5.29(s,2H),4.24(t,2H),3.48(s,2H),2.67(s,2H),2.40-2.22(m,8H),2.04-1.95(m,2H),1.70-1.60(m,2H),1.48-1.35(m,3H),1.32-1.19(m,5H),0.90(t,3H).

实施例2-8 8

4-氨基-7-(4-((4-(2-氨基乙基)哌嗪-1-基)甲基)-2-甲氧基苄基)-2-丁氧基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲腈盐酸盐8

第一步

(2-(4-(4-((4-氨基-2-丁氧基-6-氰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)-3-甲氧基苄基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯8a

将化合物3(167mg，0.37mmol)加入到10mL乙腈中，加入碳酸钾(308mg，2.23mmol)，再加入2-溴乙基氨基甲酸叔丁酯(334mg，1.49mmol)，升温至80℃搅拌反应16小时。反应液减压浓缩，加水(10mL)，用二氯甲烷萃取(10mL×3)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(15mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化，得到标题产物8a(95mg，产率：43.0％)。

MS m/z(ESI):593.2[M+1]

第二步

将8a(95mg，0.16mmol)加入到0.5mL二氯甲烷中，加入4M盐酸二氧六环溶液(3mL)，室温搅拌反应1小时。反应液减压浓缩，依次用正己烷(10mL×2)和甲基叔丁基醚(10mL×2)打浆，真空干燥，得到标题产物8(85mg产率：100％)。

MS m/z(ESI):493.2[M+1]

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ7.53(s,1H),7.38(s,1H),7.28(d,1H),7.16(d,1H),5.48(s,2H),4.56(t,2H),4.42(s,2H),3.96(s,3H),3.79-3.54(m,4H),3.52-3.41(m,4H),3.22-3.14(m,2H),2.97-2.89(m,2H),1.89-1.80(m,2H),1.57-1.48(m,2H),1.01(t,3H).

实施例2-9 9

(R)-N-(2-(4-(4-((4-氨基-2-丁氧基-6-氰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)-3-甲氧基苄基)哌嗪-1-基)乙基)-2-环丙基-2-羟基乙酰胺9

将化合物8(15mg，28.35μmol)溶于二氯甲烷(5mL)和甲醇(0.5mL)中，加入三乙胺(6mg，59.29μmol)，再加入9a(16mg，141.23μmol，采用文献“Journal of the ChemicalSociety,Chemical Communications,1991,#5,p.326-327”公开的方法制备而得)，然后依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(16mg，85.05μmol)，1-羟基苯并三唑(11mg，85.05μmol)，室温下搅拌反应1小时。反应液浓缩后进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：Sharpsil-T Prep C18 5μm 30*150mm；流动相:A-水(10mmol NH₃HCO₃)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：30mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物9(6mg，产率：35.8％)。

MS m/z(ESI):591.2[M+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.63(br,2H),7.51(t,1H),7.40(s,1H),6.94(s,1H),6.77(d,1H),6.71(d,1H),5.36(d,1H),5.22(s,2H),4.20(t,2H),3.82(s,3H),3.53(t,1H),3.40(s,2H),3.20-3.12(m,2H),2.47-2.22(m,10H),1.68-1.56(m,2H),1.42-1.33(m,2H),1.05-0.97(m,1H),0.89(t,3H),0.40-0.32(m,2H),0.31-0.23(m,2H).

实施例2-10 10

(S)-N-(2-(4-(4-((4-氨基-2-丁氧基-6-氰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)-3-甲氧基苄基)哌嗪-1-基)乙基)-2-环丙基-2-羟基乙酰胺10

将化合物8(15mg，28.35μmol)溶于二氯甲烷(5mL)和甲醇(0.5mL)中，加入三乙胺(6mg，59.29μmol)，再加入10a(17mg，146.40μmol，，采用文献“Journal of the ChemicalSociety,1988,110,p.2959”公开的方法制备而得)，然后依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(17mg，88.68μmol)，1-羟基苯并三唑(13mg，85.44μmol)，室温下搅拌反应1小时。反应液浓缩后进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：色谱柱：Sharpsil-T Prep C18 5μm 30*150mm；流动相:A-水(10mmol NH₃HCO₃)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：30mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物10(6mg，产率：35.8％)。

MS m/z(ESI):591.2[M+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.60(br,2H),7.51(t,1H),7.40(s,1H),6.93(s,1H),6.77(d,1H),6.71(d,1H),5.36(d,1H),5.22(s,2H),4.20(t,2H),3.82(s,3H),3.53(t,1H),3.40(s,2H),3.18-3.12(m,2H),2.46-2.21(m,10H),1.67-1.56(m,2H),1.41-1.32(m,2H),1.05-0.97(m,1H),0.89(t,3H),0.38-0.32(m,2H),0.31-0.24(m,2H).

实施例2-11 11

(R)-N-(1-(4-((4-氨基-2-丁氧基-6-氰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)-3-甲氧基苄基)哌啶-4-基)-2-环丙基-2-羟基-N-甲基乙酰胺11

将化合物5(11mg，23.34μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，加入三乙胺(12mg，118.81μmol)，再加入9a(27mg，233.43μmol)，然后加入O-(7-氮杂苯并三氮唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(18mg，47.34μmol)。室温下搅拌反应48小时。反应液进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：Sharpsil-T Prep C18 5μm 30*150mm；流动相:A-水(10mmol NH₃HCO₃)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：30mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物11(4mg，产率：29.8％)。

MS m/z(ESI):576.2[M+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.62(br,2H),7.41(s,1H),7.01-6.91(m,1H),6.83-6.77(m,1H),6.75-6.66(m,1H),5.23(s,2H),4.85(d,1H),4.61(d,1H),4.20(t,2H),3.96(t,1H),3.84(s,3H),3.51-3.41(m,5H),2.92-2.80(m,2H),2.70(s,2H),2.07-1.91(m,2H),1.83-1.55(m,4H),1.45-1.32(m,2H),1.12-0.97(m,1H),0.89(t,3H),0.42-0.21(m,4H).

实施例2-12 12

(S)-N-(1-(4-((4-氨基-2-丁氧基-6-氰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)-3-甲氧基苄基)哌啶-4-基)-2-环丙基-2-羟基-N-甲基乙酰胺12

将化合物37(14mg，29.18μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1.5mL)中，加入三乙胺(15mg，148.51μmol)，再加入41a(34mg，292.81μmol)，然后加入O-(7-氮杂苯并三氮唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(23mg，60.49μmol)。室温下搅拌反应48小时。反应液进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：Sharpsil-T Prep C18 5μm 30*150mm；流动相:A-水(10mmol NH₃HCO₃)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：30mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物49(6mg，产率：35.7％)。

MS m/z(ESI):576.3[M+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.63(br,2H),7.41(s,1H),6.94(s,1H),6.79(d,1H),6.71(d,1H),5.22(s,2H),4.85(d,1H),4.62(d,1H),4.20(t,2H),3.96(t,1H),3.83(s,3H),3.48-3.41(m,5H),2.90-2.80(m,2H),2.70(s,2H),2.07-1.91(m,2H),1.83-1.55(m,4H),1.45-1.32(m,2H),1.08-0.97(m,1H),0.89(t,3H),0.43-0.23(m,4H).

三、偶联物中间体连接子-药物制备实施例

实施例3-1 LD-1

N-((5R,13S)-1-(4-(4-((4-氨基-2-丁氧基-6-氰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)-3-甲氧基苄基)哌嗪-1-基)-13-苄基-5-环丙基-4,9,12,15,18-五氧代-6-氧杂-3,8,11,14,17-五氮杂十九-19-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺LD-1

第一步

(R)-2-环丙基-2-羟基乙酸苄酯LD-1b

(S)-2-环丙基-2-羟基乙酸苄酯LD-1c

将2-环丙基-2-羟基乙酸LD-1a(7.4g，63.7mmol，采用专利申请“WO2013106717”公开的方法制备而得)溶于200mL乙腈中，依次加入碳酸钾(35g，253.6mmol)，溴化苄(9.3g，54.4mmol)和四丁基碘化铵(500mg，1.36mmol)。将反应液室温搅拌16小时，通过硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯(10ml)淋洗，合并滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以展开剂体系B纯化所得残余物4.1g，进一步手性拆分纯化(分离条件：色谱柱：CHIRALPAK AY-3(AY30CD-TJ004),0.46cm I.D.×15cm L；流动相:Hexane/EtOH＝85/15(V/V)，流速：1mL/min)，得到标题产物LD-1b(1.1g)和LD-1c(1.2g)。

53b：HPLC纯度99.8％，保留时间5.019分钟，分析方法(色谱柱：CHIRALPAK AY-3(AY30CD-TJ004),0.46cm I.D.×15cm L，流动相：Hexane/EtOH＝85/15(V/V))53c：HPLC纯度100％，保留时间6.624分钟，分析方法(色谱柱：CHIRALPAK AY-3(AY30CD-TJ004),0.46cmI.D.×15cm L，流动相：Hexane/EtOH＝85/15(V/V))

第二步

(R)-10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酸苄酯LD-1e

将2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)甲基乙酸酯LD-1d(3.1g，8.41mmol,采用专利申请“CN105829346A”公开的方法制备而得)溶于四氢呋喃(55mL)中，加入LD-1b(2.0g，9.70mmol)，冰水浴冷却至0～5℃，加入叔丁醇钾(1.89g，16.84mmol)，冰水浴下搅拌10分钟。加入乙酸乙酯(30mL)和水(20mL)，静置分层，水相用氯仿(30mL×5)萃取，合并有机相。有机相减压浓缩，所得残余物溶于1,4-二氧六环(32mL)和水(8mL)，加入碳酸钠(1.78g，16.79mmol)和氯甲酸-9-芴基甲酯(2.18g，8.42mmol)，室温搅拌2小时。反应液中加入水(30mL)，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(30mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用柱层析法以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物LD-1e(1.3g，产率：30.0％)。

MS m/z(ESI):515.2[M+1]

第三步

(R)-10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酸LD-1f

将LD-1e(1.29g，2.51mmol)溶于乙酸乙酯(15mL)中，加入钯碳(260mg，含量10％，干型)，氢气置换三次，室温搅拌反应5小时。反应液用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯(20mL)和甲醇(20mL)淋洗，滤液浓缩，得到粗品标题产物LD-1f(980mg)，产品不经纯化直接进行下一步反应。

MS m/z(ESI):425.1[M+1]

第四步

2,4-二甲氧基苄基(R)-10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酸酯LD-1g

将粗品LD-1f(980mg，2.31mmol)溶于二氯甲烷(15mL)中，加入2,4-二甲氧基苄醇(777mg，4.62mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(664mg，3.46mmol)和4-二甲氨基吡啶(28mg，0.23mmol)，室温搅拌一小时。减压浓缩除去有机溶剂，加入20mL水，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(30mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用柱层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物LD-1g(810mg，产率：61.1％)。

MS m/z(ESI):575.0[M+1]

第五步

2,4-二甲氧基苄基(R)-2-((2-氨基乙酰氨基)甲氧基)-2-环丙基乙酸酯LD-1h

将LD-1g(1.01g，1.76mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入5mL二乙胺，室温搅拌2小时。反应液减压浓缩，加入10mL甲苯减压浓缩，重复两次；加入10mL正己烷打浆，倾倒出上层正己烷，重复三次，减压浓缩得到粗品标题产物LD-1h(619mg)，产品不经纯化直接用于下一步反应。

第六步

2,4-二甲氧基苄基(2R,10S)-10-苄基-2-环丙基-23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-6,9,12,15,18-五氧代-3-氧杂-5,8,11,14,17-五氮杂二十三酸酯LD-1j

将粗品LD-1h(619mg，1.76mmol)溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺，加入(S)-2(-2-(-2-(6-(2,5-二氧代-1H-吡咯-1-基)已酰氨基)乙酰氨基)乙酰氨基)-3-苯基丙酸LD-1i(831mg，1.76mmol，采用专利申请“EP2907824”第144页Formula 142公开的方法制备而得)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(584mg，2.11mmol)，室温搅拌1小时。加入60mL水，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(30mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用柱层析法以展开剂体系A纯化所得残余物，得到标题产物LD-1j(1.0g，产率：70.5％)。

MS m/z(ESI):824.2[M+18]

第七步

(2R,10S)-10-苄基-2-环丙基-23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-6,9,12,15,18-五氧代-3-氧杂-5,8,11,14,17-五氮杂二十三酸LD-1k

将LD-1j(50mg，62.0μmol)加入反应瓶，加入0.12mL氯仿助溶，加入2mL1％(v/v)的三氟乙酸的二氯甲烷溶液，冰水浴降温至0-5℃，加入三乙基硅烷(29.1mg，250.2μmol)，冰浴搅拌反应40分钟。冰浴下加入5mL二氯甲烷稀释，冰浴下减压浓缩，残余物用10mL正己烷打浆，倾倒出上层正己烷，重复三次，然后加入10mL甲基叔丁基醚，自然升至室温打浆，重复多次至滤液PH值接近7，过滤，收集滤饼，油泵抽干，得到粗品产物LD-1k(41mg)，产品不经纯化直接进行下一步反应。

MS m/z(ESI):655.2[M-1]

第八步

将化合物8(15mg，28.35μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入三乙胺(6mg，59.40μmol)。将LD-1k(41mg，62.43μmol)溶于冰浴预冷的1mL N,N-二甲基甲酰胺中，然后滴加入上述反应液中，再加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(12mg，43.34μmol)。升至室温，搅拌反应1小时。反应液进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：Sharpsil-T Prep C18 5μm 30*150mm；流动相:A-水(10mmol NH₃HCO₃)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：30mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物LD-1(5mg，产率：15.6％)。

MS m/z(ESI):1131.2[M+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.58(t,1H),8.33(t,1H),8.15(d,1H),8.09(t,1H),8.03(t,1H),7.77-7.48(m,3H),7.40(s,1H),7.26-7.20(m,4H),7.18-7.13(m,1H),6.99(s,2H),6.93(s,1H),6.76(d,1H),6.70(d,1H),5.22(s,2H),4.61(t,1H),4.52-4.44(m,1H),4.42-4.38(m,1H),4.19(t,2H),3.81(s,3H),3.78-3.57(m,10H),3.22-3.14(m,2H),3.04(dd,1H),2.82-2.74(m,2H),2.43-2.27(m,8H),2.10(t,2H),2.06-1.95(m,2H),1.65-1.58(m,2H),1.52-1.42(m,4H),1.40-1.33(m,2H),1.21-1.11(m,2H),1.02-0.93(m,1H),0.89(t,3H),0.43-0.29(m,4H).

实施例3-2 LD-2

N-((5S,13S)-1-(4-(4-((4-氨基-2-丁氧基-6-氰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)-3-甲氧基苄基)哌嗪-1-基)-13-苄基-5-环丙基-4,9,12,15,18-五氧代-6-氧杂-3,8,11,14,17-五氮杂十九-19-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺LD-2

第一步

(S)-10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酸苄酯LD-2a

将LD-1c(252mg,1.22mmol)加入反应瓶，加入4mL二氯甲烷，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入叔丁醇锂(98mg,1.22mmol)，冰水浴下搅拌反应15分钟，变澄清，加入LD-1d(300mg,814.3μmol)，冰水浴下搅拌2.5小时。加水(10mL)，分液，水相用二氯甲烷(8mL×2)萃取，合并有机相后用水(10mL×1)洗，饱和食盐水(10mL×2)洗，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得粗品。用硅胶柱色谱法以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物LD-2a(282mg，产率：67.2％)。

第二步

(S)-10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酸LD-2b

将LD-2a(280mg，0.554mmol)溶于8mL乙酸乙酯中，加入钯碳(84mg，含量10％，干型)，氢气置换三次，室温搅拌反应3小时。反应液用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，滤液浓缩，得到粗品标题产物LD-2b(230mg)，产品不经纯化直接进行下一步反应。

第三步

2,4-二甲氧基苄基(S)-10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酸酯LD-2c

将粗品LD-2b(230mg，541.8μmol)溶于7mL二氯甲烷中，依次加入2,4-二甲氧基苯甲醇(136.7mg,812.7μmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(155mg,808.5μmol)和4-二甲氨基吡啶(6.6mg,53.5μmol)，室温搅拌16小时。反应液用10mL二氯甲烷稀释后，用水(10mL×1)洗，饱和食盐水(10mL×2)洗，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得粗品。用薄层层析以展开剂体系A纯化所得残余物，得到标题产物LD-2c(159mg，产率：51.0％)

第四步

2,4-二甲氧基苄基(S)-2-((2-氨基乙酰氨基)甲氧基)-2-环丙基乙酸酯LD-2d

将LD-2c(920mg，1.60mmol)溶于4mL二氯甲烷中，加入8mL二乙胺，室温搅拌1.5小时。反应液减压浓缩，加入10mL甲苯减压浓缩，重复两次；加入10mL正己烷打浆，倾倒出上层正己烷，重复三次，减压浓缩得到粗品标题产物LD-2d(564mg)，产品不经纯化直接用于下一步反应。

第五步

2,4-二甲氧基苄基(2S,10S)-10-苄基-2-环丙基-23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-6,9,12,15,18-五氧代-3-氧杂-5,8,11,14,17-五氮杂二十三酸酯LD-2e

将粗品LD-2d(564mg，1.60mmol)溶于8mL N,N-二甲基甲酰胺，加入(S)-2(-2-(-2-(6-(2,5-二氧代-1H-吡咯-1-基)已酰氨基)乙酰氨基)乙酰氨基)-3-苯基丙酸LD-1i(756mg，1.60mmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(532mg，1.92mmol)，室温搅拌1小时。加入60mL水，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(30mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用柱层析法以展开剂体系A纯化所得残余物，得到标题产物LD-2e(756mg，产率：58.5％)。

MS m/z(ESI):824.2[M+18]

第六步(2S,10S)-10-苄基-2-环丙基-23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-6,9,12,15,18-五氧代-3-氧杂-5,8,11,14,17-五氮杂二十三酸LD-2f

将LD-2e(50mg，62.0μmol)加入反应瓶，加入0.12mL氯仿助溶，加入2mL1％(v/v)的三氟乙酸的二氯甲烷溶液，冰水浴降温至0-5℃，加入三乙基硅烷(29.1mg，250.2μmol)，冰浴搅拌反应40分钟。冰浴下加入5mL二氯甲烷稀释，冰浴下减压浓缩，残余物用10mL正己烷打浆，倾倒出上层正己烷，重复三次，然后加入10mL甲基叔丁基醚，自然升至室温打浆，重复多次至滤液PH值接近7，过滤，收集滤饼，油泵抽干，得到粗品产物LD-2f(41mg)，产品不经纯化直接进行下一步反应。

MS m/z(ESI):655.2[M-1]

第七步

将化合物8(15mg，28.35μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入三乙胺(6mg，59.40μmol)。将LD-2f(41mg，62.43μmol)溶于冰浴预冷的1mL N,N-二甲基甲酰胺中，然后滴加入上述反应液中，再加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(12mg，43.34μmol)。升至室温，搅拌反应1小时。反应液进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：Sharpsil-T Prep C18 5μm 30*150mm；流动相:A-水(10mmol NH₃HCO₃)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：30mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物LD-2(6mg，产率：18.7％)。

MS m/z(ESI):1131.3[M+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.61(t,1H),8.33(t,1H),8.22-7.98(m,3H),7.77-7.50(m,3H),7.40(s,1H),7.32-7.12(m,5H),7.07-6.88(m,3H),6.83-6.67(m,2H),5.23(s,2H),4.62(t,1H),4.53-4.40(m,2H),4.19(t,2H),3.82(s,3H),3.78-3.44(m,10H),3.25-3.15(m,2H),3.05(d,1H),2.85-2.77(m,2H),2.45-2.23(m,8H),2.17-1.89(m,4H),1.68-1.57(m,2H),1.54-1.12(m,8H),1.02-0.95(m,1H),0.89(t,3H),0.44-0.29(m,4H).

实施例3-3 LD-3

4-氨基-2-丁氧基-7-(4-((4-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)哌啶-1-基)甲基)-2-甲氧基苄基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲腈LD-3

将化合物5(11mg，0.023mmol)加入到3mL四氢呋喃中，加入LD-3a(16mg，0.115mmol)的1mL四氢呋喃溶液，再加入醋酸硼氢化钠(25mg，0.118mmol)并滴入一滴醋酸，室温搅拌反应6小时。反应液减压浓缩，所得残余物用薄层色谱法展开剂体系A纯化，得到标题产物LD-3(3mg，产率：21.4％)。

MS m/z(ESI):601.2[M+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.63(br,2H),7.40(s,1H),7.00(s,2H),6.91(s,1H),6.73(q,2H),5.22(s,2H),4.19(t,2H),3.82(s,3H),3.45(t,2H),3.36(s,3H),3.33-3.27(m,2H),2.79-2.73(m,2H),2.17(s,3H),2.04-1.97(m,2H),1.87-1.79(m,2H),1.66-1.56(m,2H),1.52-1.45(m,2H),1.39-1.32(m,2H),0.89(t,3H).

实施例3-4 LD-4

4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基(1-(4-((4-氨基-2-丁氧基-6-氰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)-3-甲氧基苄基)哌啶-4-基)(甲基)氨基甲酸酯LD-4

将化合物5(16mg，0.033mmol)加入到1mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入LD-4a(24mg，0.033mmol，供应商：Ark)，加入0.2mL吡啶，氩气置换三次，再加入1-羟基苯并三唑(10.2mg，0.067mmol)和N,N-二异丙基乙胺(8.65mg，0.067mmol)，室温搅拌反应4.5小时。反应液进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：Sharpsil-T Prep C18 5μm 30*150mm；流动相:A-水(10mmol NH₃HCO₃)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：30mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物LD-4(23mg，产率：63.7％)。

MS m/z(ESI):538.9[M/2+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.00(s,1H),8.14-8.06(m,2H),7.84-7.78(m,2H),7.62-7.55(m,3H),7.41(s,1H),7.32-7.25(m,3H),7.00(s,2H),6.02-5.95(m,2H),5.44-5.39(m,2H),5.25-5.21(m,2H),5.02-4.96(m,2H),4.40-4.35(m,2H),4.22-4.16(m,3H),3.88-3.80(m,4H),2.71(s,3H),2.68-2.65(m,2H),2.36-2.29(m,2H),2.19-2.09(m,3H),2.03-1.93(m,5H),1.71-1.58(m,6H),1.52-1.42(m,6H),1.39-1.31(m,4H),0.91-0.79(m,9H).

实施例3-5 LD-5

N-((4R,12S)-2-(1-(4-((4-氨基-2-丁氧基-6-氰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)-3-甲氧基苄基)哌啶-4-基)-12-苄基-4-环丙基-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧杂-2,7,10,13,16-五氮杂十八-18-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺LD-5

将化合物5(19mg，38.91μmol)溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺中，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入三乙胺(8mg，79.21μmol)。将LD-1k(46mg，70.05μmol)溶于冰浴预冷的1mL N,N-二甲基甲酰胺中，然后滴加入上述反应液中，再加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(21mg，75.89μmol)。升至室温，搅拌反应1小时。反应液进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：Sharpsil-T Prep C18 5μm 30*150mm；流动相:A-水(10mmol NH₃HCO₃)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：30mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物LD-5(8mg，产率：18.4％)。

MS m/z(ESI):1116.6[M+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.53-8.46(m,1H),8.35-8.28(m,1H),8.14(d,1H),8.08(t,1H),8.02(t,1H),7.60(br,2H),7.40(s,1H),7.30-7.12(m,5H),6.99(s,2H),6.93(d,1H),6.77(t,1H),6.73-6.67(m,1H),5.22(s,2H),4.60-4.43(m,3H),4.19(t,2H),3.82(s,3H),3.78-3.43(m,11H),3.05(d,2H),2.95-2.73(m,4H),2.72-2.65(m,2H),2.10(t,2H),2.05-1.90(m,4H),1.75-1.65(m,4H),1.63-1.32(m,6H),1.22-1.13(m,2H),1.11-0.96(m,1H),0.88(t,3H),0.55-0.35(m,3H),0.28-0.18(m,1H).

实施例3-6 LD-6

N-((4S,12S)-2-(1-(4-((4-氨基-2-丁氧基-6-氰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)-3-甲氧基苄基)哌啶-4-基)-12-苄基-4-环丙基-3,8,11,14,17-五氧代-5-氧杂

-2,7,10,13,16-五氮杂十八-18-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺LD-6

将化合物5(14mg，29.18μmol)溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺中，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入三乙胺(6mg，59.40μmol)。将LD-2f(41mg，62.43μmol)溶于冰浴预冷的1mL N,N-二甲基甲酰胺中，然后滴加入上述反应液中，再加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(17mg，61.44μmol)。升至室温，搅拌反应1小时。反应液进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：Sharpsil-T Prep C18 5μm 30*150mm；流动相:A-水(10mmol NH₃HCO₃)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：30mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物LD-6(6mg，产率：18.4％)。

MS m/z(ESI):1116.6[M+1]

实施例3-7

4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基(2-(4-(4-((4-氨基-2-丁氧基-6-氰基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)甲基)-3-甲氧基苄基)哌嗪-1-基)乙基)氨基甲酸酯LD-7

将8(15mg，0.028mmol)加入到1mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入LD-4a(24mg，0.032mmol)，再加入0.2mL吡啶，氩气置换三次，再加入1-羟基苯并三唑(13mg，0.085mmol)和N,N-二异丙基乙胺(11mg，0.085mmol)，室温搅拌反应16小时。反应液进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：Sharpsil-T Prep C18 5μm30*150mm；流动相:A-水(10mmolNH₃HCO₃)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：30mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物LD-7(8mg，产率：25.9％)。

MS m/z(ESI):1091.6[M+1]

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.03(s,1H),8.10(d,1H),7.82(d,1H),7.60(d,3H),7.48(s,1H),7.46-7.38(m,1H),7.28(d,2H),7.00(s,2H),6.80(d,1H),6.73-6.63(m,1H),6.13-5.96(m,2H),5.36-5.30(m,1H),5.27(s,2H),4.95(s,2H),4.43-4.30(m,2H),4.25-4.15(m,3H),3.88(s,3H),3.13-2.80(m,7H),2.73-2.63(m,2H),2.37-2.27(m,2H),2.24-2.06(m,3H),2.05-1.90(m,3H),1.76-1.56(m,4H),1.56-1.41(m,5H),1.40-1.32(m,3H),1.31-1.11(m,7H),0.97-0.72(m,9H).

四、ADC偶联物实施例

ADC药物载量分析

毛细管电泳法分析CE-SDS计算ADC药物载药量

1、试剂和仪器：

SDS-Mw Analysis Kit：Beckman生产，货号390953，该试剂盒中包含SDS-MW凝胶分离缓冲液、SDS-MW样品缓冲液、酸性清洗液(0.1mol/L盐酸溶液)、碱性清洗液(0.1mol氢氧化钠溶液)、内标物质(10kDa)。也可采用北京博思雅生化技术研究院生产的SDS试剂盒，货号BSYK018，该试剂盒中包含CE-SDS凝胶缓冲液、CE-SDS样品缓冲液。

烷基化溶液(0.25mo碘乙酰胺溶液)：称取约0.046g碘乙酰胺，加入lmL超纯水溶解混匀，可于2-8℃避光保存7天。

毛细管电泳仪：SCIEX公司PA800plus；

毛细管：非涂层熔融石英毛细管(内径50μm)，切割至总长为30.2cm，高分辨率方法有效分离长度为20cm。

2、待测样品溶液制备

用SDS样品缓冲液将待测样品稀释至1mg/mL。取待测样品溶液(1mg/mL)95μL，加入0.8mol/L碘乙酰胺水溶液5μL，混匀。取空白对照95μL，加入0.8mol/L碘乙酰胺水溶液5μL，混匀。从样品管中分别取出75μL至样品瓶中，立即进行分析。

3、测定方法

1)毛细管的预处理：0.1mol/L氢氧化钠溶液在60psi压力下冲洗3分钟，然后用0.1mol/L盐酸溶液在60psi压力下冲洗2分钟，最后用纯水在70psi压力下冲洗1分钟。

2)毛细管的预填充：SDS凝胶分离缓冲液在50psi压力下冲洗15分钟。

样品进样：10kV反相极性电动进样，还原样品进样20秒。

分离：15kV下运行40分钟，反相极性。

样品室温度：18至25℃。

毛细管温度：18至25℃。

4、结果分析

基于抗体中打开的二硫键游离出的巯基都偶联上相应的药物，用Beckman软件对数据进行分析，以重链、非糖基化重链和轻链等校正峰面积分别占所有校正峰面积计算。根据公式：DAR＝[4*重链(H)峰面积+2*半抗(H-L)峰面积+4*双重链(H-H)峰面积+2*重重轻链(H-H-L)峰面积]/[重链(H)峰面积/2+半抗(H-L)峰面积/2+双重链(H-H)峰面积+重重轻链(H-H-L)峰面积+全抗峰面积]，最终计算出该ADC的加权平均值，即药物载量。

实施例4-1 ADC-1

在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，2.2mL，148.7nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，37.2μL，371.7nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物LD-4(1.6mg，1487nmol)溶解于120μL DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到偶联物FADC-1的示例性产物ADC-1的PBS缓冲液(2.03mg/mL，12.7mL)，于4℃储存。

CE-SDS计算平均值：y＝4.02。

实施例4-2 ADC-2

在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，1.56mL，105.3nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，55.8μL，558.1nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物LD-4(1.7mg，1580nmol)溶解于70μL DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到偶联物FADC-1的示例性产物ADC-2的PBS缓冲液(1.34mg/mL，14mL)，于4℃储存。

CE-SDS计算平均值：y＝7.85。

实施例4-3 ADC-3

在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，1.72mL，116.5nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，29.1μL，291.1nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物LD-5(1.3mg，1165nmol)溶解于50μl DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到偶联物FADC-2的示例性产物ADC-3的PBS缓冲液(1.69mg/mL，11.6mL)，于4℃储存。

CE-SDS计算平均值：y＝4.16。

实施例4-4 ADC-4

将化合物LD-6(1.3mg，1165nmol)溶解于50μl DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到偶联物FADC-3的示例性产物ADC-4的PBS缓冲液(1.65mg/mL，11.7mL)，于4℃储存。

CE-SDS计算平均值：y＝4.1。

实施例4-5 ADC-5

在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，1.57mL，106.1nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，26.5μL，265.2nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物LD-1(1.2mg，1061nmol)溶解于50μL DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到偶联物FADC-4的示例性产物ADC-5的PBS缓冲液(1.41mg/mL，11.02mL)，于4℃储存。

CE-SDS计算平均值：y＝3.81。

实施例4-6 ADC-6

在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，1.44mL，97.2nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，24.3μL，243.1nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物LD-2(1.1mg，972nmol)溶解于50μL DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到偶联物FADC-5的示例性产物ADC-6的PBS缓冲液(1.49mg/mL，10.69mL)，于4℃储存。

CE-SDS计算平均值：y＝3.82。

实施例4-7 ADC-7

在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，1.97mL，133.2nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，33.3μL，332.9nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物LD-3(0.8mg，1332nmol)溶解于50μL DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到偶联物混合物(FADC-6、FADC-6A和FADC-6B混合)的示例性产物ADC-7的PBS缓冲液(1.04mg/mL，8.96mL)，于4℃储存。

CE-SDS计算ADC-7的载药量平均值：y＝3.82。

实施例4-8 ADC-8

在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，1.36mL，91.6nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，22.9μL，229.1nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。

将化合物LD-7(1mg，916nmol)溶解于50μL DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到偶联物FADC-7的示例性产物ADC-8的PBS缓冲液(1.43mg/mL，10.6mL)，于4℃储存。

CE-SDS计算平均值：y＝4.16。

测试例：

生物学评价

测试例1、本公开化合物对人源TLR7激动活性的测定

本公开化合物对HEK-Blue^TM hTLR7稳转株细胞表达的hTLR7蛋白激活作用采用如下实验方法测定：

一、实验材料及仪器

1.DMEM(Gibco，10564-029),

2.胎牛血清(GIBCO,10099),

3.青链霉素(Gibco,15140-122),

4.台盼蓝溶液(Sigma,T8154-100ML),

5.Flexstation 3多功能酶标仪(Molecμlar Devices),

6.HEK-Blue^TM HTLR7细胞系(InvivoGen,hkb-hTLR7),

7.HEK-Blue检测试剂(InvivoGen,hb-det3)。

二、实验步骤

配置HEK-Blue检测培养基，取HEK-Blue检测干粉一袋，加入50mL去内毒素水溶解，再放入37℃培养箱，10分钟后无菌过滤。化合物先配制成20mM的原液；再用纯DMSO稀释至最高浓度为6×10⁶nM，经3倍梯度稀释，共10个点。

用培养基先把上述配制好的化合物稀释20倍，然后每孔加入20μl稀释后的化合物。取HEK-Blue^TM hTLR7细胞，先去掉上清，再加入2-5ml预热的PBS，放入培养箱1-2分钟，轻轻吹打细胞，台盼蓝染色计数。用HEK-Blue检测培养基重悬细胞调整浓度为2.2×10⁵个细胞/mL，加180μL细胞至上述已加入20μL药物的96孔细胞培养板中，37℃，培养6-16小时。

酶标仪读数，波长为620nm。可获得相应的OD值，经Graphpad Prism计算得到药物的EC₅₀值。

本公开化合物对人源TLR7激活作用可通过以上的试验进行测定，测得的EC₅₀值见表1。

表1本公开化合物对人源TLR7的EC₅₀。

化合物编号	EC<sub>50</sub>(nM)
		1	43
2	78
		4	54
5	61
		6	44
7	80
		8	25
9	43
		10	29
11	12
		12	24

结论：本公开化合物对人源TLR7具有明显的激活作用。

测试例2、本公开中化合物刺激外周血单个核细胞(PBMC)分泌IFN-α能力的测定

本公开中化合物刺激PBMC分泌IFN-α能力采用如下实验方法测定：

一、实验材料及仪器

1.RPMI 1640(Invitrogen,11875),

2.FBS(Gibco,10099-141),

3.Ficoll-Paque PREMIUM(GE,17-5442-02),

4.台盼蓝溶液(Sigma,T8154-100ML),

5.SepMateTM-50(Stemcell,15460),

6.Bright-Line^TM血细胞计数仪(Sigma,Z359629-1EA),

7.人源IFN-α试剂盒(cisbio,6FHIFPEB),

8.PHERAStar多功能酶标仪(BMG，PHERAStar)。

二、实验步骤

化合物用纯DMSO稀释，最高浓度为5mM，4倍梯度稀释，共9个点。然后取4μL化合物，加入到196μL含10％FBS的RMPI 1640培养基中，混匀。每孔取50μL至新的96孔细胞培养板。

所有试剂平衡到室温，取250mL培养瓶，将60mL血液和PBS+2％FBS加入其中，轻轻吹打混匀稀释。取50mLPBMC分离管SepMateTM-50，加入15mL淋巴细胞分离液Ficoll-PaquePREMIUM，然后加入30mL稀释后血液。1200g离心10分钟，室温。取上清，然后300g，离心8分钟。用含10％FBS的RMPI 1640培养基重悬并计数，调整PBMC数量至3.33×10⁶个细胞/mL，取150μL至已加入化合物的细胞培养板中，37℃，5.0％CO₂的培养箱中培养24小时。

将细胞培养板放入离心机中，1200rpm，室温离心10分钟。每孔取出150μL上清。先平衡人源IFN-α试剂盒中的试剂至常温，在避光条件下根据试剂盒说明书配制抗-IFN-α-Eu³⁺-穴状结合物(Anti-IFN-α-Eu³⁺-Cryptate conjugate)和抗-IFN-α-d2-结合物(Anti-IFN-α-d2-conjugate)，两者均以1：40的比例与结合缓冲液(conjugate Buffer)混匀。然后每孔加入16μL的离心取得的上清液。再每孔加入2μL刚配好的抗-IFN-α-Eu³⁺-穴状结合物和抗-IFN-α-d2-结合物，震荡混匀，室温避光孵育3小时。

在PHERAStar上用HTRF模式读数。我们将刺激产生最低检测限至少3倍以上细胞因子水平的最低药物浓度，定义为该化合物在该细胞因子刺激实验上的MEC(MinimalEffective Concentration)值。

本公开化合物刺激PBMC分泌IFN-α的能力通过以上的试验进行测定，测得的MEC值见表2。

表2本公开化合物刺激PBMC分泌IFN-α的MEC

化合物编号	MEC(nM)
		2	0.4
3	0.14
		4	0.52
5	0.03
		6	0.13
7	0.52
		8	0.03
9	0.13
		10	0.13
11	0.40
		12	0.48

结论：从刺激PBMC分泌IFN-α的活性的数据上看，本公开化合物具有起效浓度较低的优势。

测试例3、本公开中Her2-TLR7-ADC在肿瘤细胞存在的情况下刺激外周血单个核细胞(PBMC)分泌IFN-α能力的测定

本公开中Her2-TLR7-ADC在肿瘤细胞存在的情况下刺激PBMC分泌IFN-α能力采用如下实验方法测定：

一、实验材料及仪器

1.RPMI 1640培养基(Invitrogen,11875),

2.FBS(Gibco,10099-141),

3.Ficoll-Paque PREMIUM(GE,17-5442-02),

4.台盼蓝溶液(Sigma,T8154-100ML),

5.SepMateTM-50(Stemcell,15460),

6.Bright-Line^TM血细胞计数仪(Sigma,Z359629-1EA),

7.Human IFN-α试剂盒(cisbio,62HIFNAPEG),

8.PHERAStar多功能酶标仪(BMG，PHERAStar).

9.SK-BR-3(ATCC,HTB-30)

二、实验步骤

Her2-TLR7-ADC用无菌PBS稀释，最高浓度为5μM，4倍梯度稀释，共9个点。每孔取20μL至新的96孔细胞培养板。

所有试剂平衡到室温，取250mL培养瓶，将60mL血液和PBS+2％FBS加入其中，轻轻吹打混匀稀释。取50mLPBMC分离管SepMateTM-50，加入15mL淋巴细胞分离液Ficoll-PaquePREMIUM，然后加入30mL稀释后血液。1200g离心10分钟,室温。取上清，然后300g，离心8分钟。用含10％FBS的RMPI 1640培养基重悬并计数。调整PBMC数量至2.76×10⁶个细胞/mL，取90μL至已加入化合物的细胞培养板。同时将SK-BR-3胰酶消化离心后，用1640培养基重悬后调整细胞密度为2.76×10⁵个细胞/mL，取90μL至已加入化合物的细胞培养板。最后每孔总体积是200μL。37℃，5.0％CO₂的培养箱中培养24小时。

将细胞培养板放入离心机中，1200rpm，室温离心10分钟。每孔取出150μL上清。先平衡Human IFN-α试剂盒中的试剂至常温，在避光条件下根据试剂盒说明书稀释Anti-IFN-α-Eu3+-Cryptate conjugate和Anti-IFN-α-d2-conjugate，两者分别以1：20的比例与检测缓冲液(detection buffer)稀释，然后将稀释好的Anti-IFN-α-Eu3+-Cryptate conjugate和Anti-IFN-α-d2-conjugate按照1:1混匀。每孔加入16μL的样品上清液和标准品。再加入4μL的预先混匀的conjugate/d2溶液，每孔最后体积是20μL。室温避光孵育3小时。

本公开ADC偶联物刺激PBMC分泌IFN-α的能力通过以上的试验进行测定，测得的MEC值见表3。

表3本公开ADC刺激PBMC分泌IFN-α的MEC

偶联物编号	MEC(nM)
		ADC-1	1.04
ADC-3	5.24
		ADC-4	7.63
ADC-5	7.98
		ADC-6	8.01
ADC-7	12.5
		ADC-8	2.57

结论：从刺激PBMC分泌IFN-α的活性的数据上看，本公开ADC具有起效浓度较低的优势。

序列表

<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司

上海恒瑞医药有限公司

<120> 吡咯并嘧啶衍生物或其偶联物、其制备方法及其应用

<150> 202010529352.1

<151> 2020-06-11

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> Trastuzumab轻链

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 2

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> Trastuzumab重链

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> 四肽连接子

<400> 3

Gly Gly Phe Gly

1

Claims

1.一种具有通式(D-)所示结构的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中所述通式(D-)如下：

其中：

环A选自芳基和杂芳基；

G选自-O-、-S-、-C(O)-和共价键；

R⁵选自烷基、烷氧基、卤素、卤代烷基、羟基和羟烷基；

R⁶选自氢原子和烷基；优选氢原子；

R^7a选自环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；

R^8a选自选自氢原子和烷基；

通式(-D)中虚线

表示R^3a基团上的氧原子或氮原子，与接头单元或与配体共价连接；

n为0、1、2、3或4；

p为0、1、2、3或4；

q为0、1、2、3或4；且

r为1、2、3或4。

2.根据权利要求1所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其为通式(Pc-L-D)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物：

其中：

环A、G、R¹、R²、R^3a、R⁴、L¹、L²和n如权利要求1中所定义；

y选自1至10的整数或小数；

Pc为配体；L为接头单元。

3.根据权利要求1或2所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中y选自1至8的整数或小数，优选选自2至8的整数或小数，更优选选自3至8的整数或小数。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中Pc为抗体。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中所述的环A选自苯基，吡啶基或噻吩基；

优选地，环A选自：

所述的环A与L1和L2相连接。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中G为-O-。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中所述的L¹为亚烷基，L²为亚烷基。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中R¹为烷基。

9.根据权利要1至8中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐，其中R²相同或不同，且各自独立地为氢原子、烷基、烷氧基或卤素。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中R^a为杂环基，所述的杂环基优选选自自四氢吡咯基、哌啶基和亚哌嗪基。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中R^3a选自：

12.根据权利要求1至11中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中R⁴选自氢原子、烷基和氰基，优选为氰基。

13.根据权利要1至12中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中R⁵为烷基。

14.根据权利要1至13中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中R⁶选自氢原子和烷基。

15.根据权利要1至14中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中R^7a为苯基；R^8a为烷基。

16.根据权利要求2至15中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中接头单元-L-为-L^a-L^b-L^c-，

L^a选自

R⁷选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；

R¹⁰选自烷基、环烷基烷基和环烷基；

R¹¹选自氢原子、烷基和卤代烷基；

或者，R¹⁰和R¹¹与其相连接的碳原子一起形成C_3-6环烷基；

R¹²选自芳基或杂芳基。

17.根据权利要求16所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中W选自-(CH₂)₂-和-(CH₂)₅-。

18.根据权利要求16或17所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中所述的L^b的肽残基为由一个或多个选自苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸中的氨基酸形成的氨基酸残基；优选为四肽残基、二肽残基和化学键；更优选为甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸的四肽残基或者缬氨酸-瓜氨酸的二肽残基。

19.根据权利要求16至18中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中接头单元L^c选自-NH-C(R⁸R⁹)-O-C(R¹⁰R¹¹)-C(O)-、-NH-R¹²-(CH₂)t-OC(O)-或化学键，t为1至6的整数；R¹²选自芳基和杂芳基；

优选的，L^c选自以下结构式：

R¹⁰选自烷基、环烷基烷基和环烷基；

R¹¹选自氢原子、烷基和卤代烷基；

或者，R¹⁰和R¹¹与其相连接的碳原子一起形成C_3-6环烷基。

20.根据权利要求16所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中接头单元-L-为-L^a-，-L^a-如权利要求16或17中所定义。

21.根据权利要求16至19中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中接头单元-L-为-L^a-L^b-L^c-，

L^a选自

其中W选自-(CH₂)₂-和-(CH₂)₅-；

L^c选自以下结构式：

R¹⁰选自烷基、环烷基烷基或环烷基；

R¹¹选自氢原子、烷基或卤代烷基；

或者，R¹⁰和R¹¹与其相连接的碳原子一起形成C_3-6环烷基。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其为通式(Pc-Lu-D)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐：

其中：

L^a、L^b、L^c如权利要求16中所定义；

Pc、y、环A、G、R¹、R²、R^3a、L¹、L²、n如权利要求2中所定义。

23.根据权利要求1至21中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，包含连接单元-L-，其中-L-选自：

其中a端与配体Pc相连，b端与药物端R^3a相连。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其选自以下结构式或其组合物：

其中Pc为配体；y选自1至10的整数或小数。

25.根据权利要求2至24中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中所述Pc为抗体。

26.根据权利要求25所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其中所述的抗体选自抗TLR7抗体、抗HER2(ErbB2)抗体、抗EGFR抗体、抗B7-H3抗体、抗c-Met抗体、抗HER3(ErbB3)抗体、抗HER4(ErbB4)抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD44抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD73抗体、抗CD105抗体、抗CEA抗体、抗A33抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗G250抗体、抗MUCl抗体、抗Lewis Y抗体、抗VEGFR抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin-C抗体、抗SLC44A4抗体和抗Mesothelin抗体；

优选的所述的抗体选自Trastuzumab、Pertuzumab、Nimotuzumab、Enoblituzumab、Emibetuzumab、Inotuzumab、Pinatuzumab、Brentuximab、Gemtuzumab、Bivatuzumab、Lorvotuzumab、cBR96和Glematumamab。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，其选自以下结构式：

其中y选自1至10的整数或小数；Trastuzumab为抗HER2抗体，其包含如SEQ ID NO：1所示的轻链和如SEQ ID NO：2所示的重链。

28.一种具有通式(D)所示结构的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐：

其中：

环A选自芳基和杂芳基；

G选自-O-、-S-、-C(O)-和共价键；

R^a选自键、亚烷基、环烷基和杂环基，其中所述的亚烷基、亚环烷基和亚杂环基各自独立地任选被选自烷基、烷氧基、卤素、卤代烷基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基和杂环基中的一个或多个取代基所取代；

R⁵选自烷基、烷氧基、卤素、卤代烷基、羟基和羟烷基；

R⁶选自氢原子和烷基；优选为氢原子；

R^6a选自烷基、烷氧基、卤素、卤代烷基、羟基和羟烷基；优选为烷基；

R^7a选自环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；

R^8a选自氢原子和烷基；

R¹⁰选自烷基、环烷基烷基或环烷基；优选环烷基；

R¹¹选自氢原子、烷基或卤代烷基；优选氢原子；

n为0、1、2、3或4；

p为0、1、2、3或4；

q为0、1、2、3或4；且

r为1、2、3或4。

29.根据权利要求28所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的环A选自苯基，吡啶基或噻吩基；

优选地，环A选自：

所述的环A与L¹和L²相连接。

30.根据权利要求28或29所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中G为-O-。

31.根据权利要求28至30中任一项所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的L¹为亚烷基，L²为亚烷基。

32.根据权利要求28至31中任一项所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中R¹为烷基。

33.根据权利要28至32中任一项所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中R²相同或不同，且各自独立地为氢原子、烷基、烷氧基或卤素。

34.根据权利要求28至33中任一项所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中R^a为杂环基，所述的杂环基优选自四氢吡咯基、哌啶基和哌嗪基。

35.根据权利要求28至34中任一项所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中R³选自：

36.根据权利要求28至35中任一项所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中R⁴选自氢原子、烷基或氰基，优选氰基。

37.根据权利要28至36中任一项所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中R⁵为烷基。

38.根据权利要28至37中任一项所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中R⁶选自氢原子和烷基。

39.根据权利要28至38中任一项所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其中R^7a为苯基；R^8a为烷基。

40.根据权利要求28至39中任一项所述的通式(D)所示的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其选自：

41.一种通式(Lu-D)所示的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐：

其中：

L^a‘选自

其中W选自-C_1-6烷基-和-C_1-6烷基-环烷基-，其中所述的-C_1-6烷基-或-C_1-6烷基-环烷基-各自独立地任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；优选地，其中W选自-(CH₂)₂-和-(CH₂)₅-；

R⁷选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；

R¹⁰选自烷基、环烷基烷基和环烷基；

R¹¹选自氢原子、烷基和卤代烷基；

或者，R¹⁰和R¹¹与其相连接的碳原子一起形成C_3-6环烷基；

R¹²选自芳基或杂芳基；

环A、G、R¹、R²、R^3a、R⁴、L¹、L²、n如权利要求2中所定义。

42.根据权利要求41所述的通式(Lu-D)所示的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，其选自：

43.一种制备如通式(Pc-Lu-D)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物的方法，其包括如下步骤：

将还原Pc后所得到Pc’与通式(Lu-D)进行偶联反应，得到通式(Pc-Lu-D)；

其中：

Pc为配体；L^a’如权利要求41中所定义；

环A、G、L¹、L²、L^a、L^b、L^c、R¹、R²、R^3a、R⁴、n和y如权利要求22中所定义。

44.一种配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，包含配体和连接至配体的药物，其中所述药物选自权利要求28至40中任一项所述的化合物，优选药物通过接头连接至配体，所述的配体优选为抗体。

45.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1至27中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂；或者，其含有治疗有效量的根据权利要求28至40中任一项所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

46.根据权利要求1至27中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物；或者，根据权利要求28至40中任一项所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐；或根据权利要求45所述的药物组合物在制备用于治疗或预防病毒感染或肿瘤的药物中的用途。

47.根据权利要求46所述的用途，其中所述的肿瘤为与TLR7、HER2、HER3、B7H3或EGFR表达相关的癌症。

48.根据权利要求1至27中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或其混合物；或者，根据权利要求28至40中任一项所述的化合物或其偶联物或其药学上可接受的盐；或根据权利要求45所述的药物组合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途，其中所述癌症优选选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝细胞癌、基底细胞癌、肾细胞癌、骨髓瘤、变应性鼻炎、哮喘、COPD、溃疡性结肠炎、肝纤维化、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、白血病、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌和淋巴瘤；

或者，在制备用于治疗由病毒引起的感染的药物中的用途，所述病毒选自：登革热病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、昆津病毒、墨累山谷脑炎病毒、圣路易脑炎病毒、鄂木斯克出血热病毒、牛病毒性腹泻病毒、济卡病毒、HIV、HBV、HCV、HPV、RSV、SARS和流感病毒。