CN113789285A

CN113789285A - 一种芽孢杆菌HSY32、杀虫蛋白、cry-like杀虫基因及应用

Info

Publication number: CN113789285A
Application number: CN202111246045.3A
Authority: CN
Inventors: 徐志霞; 魏力; 王洋洋; 金映虹; 吴红萍; 李欣欣; 王锐萍; 张文飞
Original assignee: Hainan Normal University
Current assignee: Hainan Normal University
Priority date: 2021-10-26
Filing date: 2021-10-26
Publication date: 2021-12-14
Anticipated expiration: 2041-10-26
Also published as: CN113789285B

Abstract

本发明涉及一种芽孢杆菌HSY32、杀虫蛋白、cry‑like杀虫基因及应用，生物活性测定表明杀虫蛋白、cry‑like杀虫基因对秀丽隐杆线虫和南方根结线虫具有很高的毒性，可用于农业害虫的防治。

Description

一种芽孢杆菌HSY32、杀虫蛋白、cry-like杀虫基因及应用

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌HSY32、杀虫蛋白、 cry-like杀虫基因及应用。

背景技术

线虫对农作物的危害极大，可寄生在植物体各个部位，吸取寄主养分用于自身生长繁殖，不仅直接对寄主造成伤害，而且可导致外界病原如病毒、真菌、细菌的入侵，加重寄主植物的病害。寄生线虫种类达4,100多种，破坏程度最为严重的是根结线虫和囊肿线虫，严重影响全球粮食作物产量与品质。国际上公认的共有十大类毁灭性线虫，据美国一项研究机构调查显示，由于寄生线虫的危害，全球农林作物导致的损失高达800多亿美元。

线虫多是在植物的地下部分活动，破坏植物组织，已经造成了巨大的经济损失，其防治难度高于其他昆虫类的防治。植物寄生线虫的防治主要包括物理防治、化学防治和生物防治。物理防治主要包括旱季深翻土壤暴晒、对染病地块停耕消毒、作物播种前期拌药处理、利用大水漫灌土地等均起到一定的成效。然而，面对耕地减少、土地荒漠化、人口数量激增等现实问题，物理防治的操作空间有限，效果不明显，易反复发作，防治极其不彻底。化学防治主要是利用药剂，通过线虫表皮吸收或是直接进入肠道使线虫中毒死亡，如二溴氯丙烷、DTT等，土壤施药后对大多数地下害虫都有毒杀作用，但是对于有益的昆虫，比如蚯蚓同样致死。有些药品是麻痹线虫致死，比如克线磷、氯唑磷等，作物播种前期进行拌种处理或者穴施作物根际周围使用。化学杀虫剂的杀虫效力高，具有见效快，用药成本较低等特点，但是，农药的高毒和高残留影响了人们的身体健康，也极易导致无辜的动物中毒或死亡，污染水源河道，农产品的品质也得不到保障。随着人们绿色科学环保意识的提高，农田里化学农药的使用量正逐年递减，具有危害性农药将逐步退出田间舞台。

生物防治主要是利用线虫的一些自然天敌，比如杀线虫微生物和杀线虫植物，以及某些微生物或者植物所产生的杀线虫代谢物。1985年Bone等人首次证实 Bt的Cry蛋白对线虫有活性以来，从有关Bt对防治寄生线虫的研究引起了人们极大的关注。到目前为止，已经报道具有杀线虫活性的Bt晶体蛋主要有Cry1、 Cry5、Cry6、Cry12、Cry13、Cry14、Cry21与Cry55共8大类。2003年Wei 等发现杀线虫晶体蛋白Cry5B、Cry6A、Cry21A和Cry14A对多种线虫都表现有活性，而表现最为优异的是Cry5B晶体蛋白。其中对秀丽隐杆线虫有活性的蛋白，对其它五种寄生线虫大多同样也有活性。但是，目前鲜有菌株和基因实际用于大田防治作物线虫，非常有必要挖掘更多可用于线虫生物防治的微生物资源和基因资源。

发明内容

本发明提供一种芽孢杆菌HSY32，其特征在于，所述芽孢杆菌HSY32属于蕈状芽孢杆菌Bacillus mycoides，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO：M2021869。保藏日期为2021年7月12日。分类命名：蕈状芽孢杆菌 Bacillus mycoides。保藏地址：中国武汉武汉大学

本发明的另一实施方案提供一种杀虫蛋白(Cry-like蛋白)，其特征在于所述杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一实施方案提供一种cry-like杀虫基因，其特征在于所述cry-like杀虫基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一实施方案提供上述芽孢杆菌HSY32在制备上述杀虫蛋白、 cry-like杀虫基因中的应用。

本发明的另一实施方案提供上述杀虫蛋白和/或cry-like杀虫基因在制备防治农业害虫药物中的应用。所述农业害虫优选线虫目昆虫，进一步优选秀丽隐杆线虫、南方根结线虫。

本发明的有益效果是：本发明提供一种新杀虫蛋白及其cry-like杀虫基因，生物活性测定表明杀虫蛋白、cry-like杀虫基因对秀丽隐杆线虫和南方根结线虫具有很高的毒性。表明杀虫蛋白和cry-like杀虫基因可用于农业害虫的防治。

附图说明

图1是菌株HSY32伴胞晶体蛋白扫描电镜观察图；

图2是cry-like基因PCR扩增片段琼脂电泳分析图；注：M为核酸分子大小标准(bp)，Lane1为cry-like基因片段，分子大小2871bp；

图3是采用Maximum Parsimony(MP)方法MEGA X软件构建Cry-like和其它杀线虫蛋白的系统进化树图；

图4是Cry-like蛋白二级结构和三维结构预测图；注：A为Cry-like蛋白二级结构，蓝色：helix，红色：sheet，绿色：turn，紫色：coil。B为Cry-like的三维结构，α螺旋：紫色，β折叠：黄色，β转角：绿色

图5是cry-like基因在大肠杆菌异源表达及其纯化SDS-PAGE分析图；注： PM为蛋白分子量标准，Lane1为pET-30a质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞IPTG 诱导表达，Lane2为cry-like基因转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞IPTG诱导表达，Lane3为表达Cry-like蛋白纯化产物。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

实施例1菌株HSY32的筛选与鉴定

从海南岛的东南部吊罗山热带原始雨林采集土壤样品，然后，在实验室采用醋酸钠高温分离方法筛选土壤样品的芽孢杆菌，通过光学显微镜和扫描电镜观察鉴定出产伴胞晶体蛋白的芽孢杆菌。称取5g左右土壤放入20mL BPA(牛肉膏 0.3％，蛋白胨0.5％，氯化钠0.5％)培养基中，充分振荡，30℃摇床培养4-5h， 75℃水浴15min，取1mL上清稀释至10^-3、10^-4和10^-5，各吸取200μL均匀涂布于NB(牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，氯化钠3.4％)培养平板，30℃倒置培养3d，挑取形态各异的单菌落划平板。芽孢杆菌培养3-5d形成芽孢后，进一步利用考马斯亮蓝染色和光学显微镜观察观察到无色芽孢和蓝色的伴胞晶体。

实施例2扫描电镜观察晶体蛋白

菌株HSY32在G-Tris培养基中28℃培养96h左右至芽孢完全形成，用牙签刮取约0.1g培养好的处于平板中心位置的菌苔，用预冷的1mol/L NaCl洗涤菌体3次，最后悬浮于100μL无菌水中。取5μL芽孢和晶体蛋白的混合物小心涂布在洁净的载玻片中央，待自然风干后油镜(×1500)观察样品密度是否分布均匀，要求视野中芽孢和晶体排列稀疏，易于区分观察。确定菌体密度分布后，将同一批次有样品的载玻片浸没在体积分数2.5％戊二醛固定液中，4℃避光固定24h，先后用体积分数30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％乙醇分别洗脱15min，再用无水乙醇脱水15min。置于通风橱中，将样品浸入六甲基二硅胺烷(HMDS)中浸泡15min，重复2次。将样品用扫描电镜(德国蔡司 EVOMA10/LS10)在20kV电压条件下进行伴胞晶体蛋白观察拍照。

实施例3菌株HSY32基因组DNA提取

将HSY32的单菌落用灭菌牙签接种于5mL LB的液体培养基中，放置于恒温摇床28℃，220rpm过夜活化；第二天按1％的量将菌液转接到新鲜的5mL LB液体培养基中继续培养4-6h，直到OD₆₀₀值为2.0左右，然后10,000rpm离心2min收集菌体；加入1mL J Buffer[0.1MTris HCl(pH 8.0)、0.1M EDTA(pH 8.0)、0.15M NaCl]洗涤沉淀；将沉淀重新悬浮于500μL预先加入溶菌酶至20 mg/mL的J Buffer中，并且及时吹打均匀，然后置于37℃水浴锅中孵育30min (期间振荡3-5次)；使用等体积苯酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)抽提，离心10min，12,000rpm，小心吸取上清；向离心管中加入1mL的无水乙醇并混匀，12,000rpm离心10min，弃去上清；向离心管中加入500μL 70％乙醇洗涤, 然后自然风干30min后，加入50μL的TE溶液(10mmol/L Tris·HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0)并混匀。取5μL DNA样品在0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，Gelred Plus核酸染料染色后，在凝胶成像仪(Bio-Rad Gel Doc XR+，美国)上观察电泳条带。

实施例4菌株HSY32的种属鉴定

HSY32菌株基因组DNA，利用细菌16S rDNA序列通用引物27F/1492R(27F: 5`-AGAGTT TGA TCA TGG CTC AG-3`,1492 R:5`-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3`)进行PCR扩增((Bio-Rad T100 Thermal Cycler,美国，PCR反应条件：预变性94℃5min，然后进入30循环，94℃变性45s，57℃退火45s， 72℃延伸2min。PCR扩增产物进行琼脂糖(1.0％)凝胶电泳，PCR片段大小为 1500bp左右，使用上海生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，并对纯化的PCR产物进行Sanger测定(上海生工生物工程公司，上海)，获得的序列为SEQ NO.3。用BLAST软件与GenBank中已登录的16S rDNA序列进行同源性分析。16SrDNA序列同源性分析表明SEQ NO.3与Bacillus mycoides菌株NBRC 101238的16S rDNA序列(GeneBank NO:NR_113996.1) 最为相似(序列覆盖度为98％，相似性为99.6％)，基本可以认定其为芽孢杆菌HSY32属于Bacillus mycoides。

实施例5菌株HSY32基因组测序和新型毒素蛋白鉴定

采用高通量Illumina测序技术对Bt菌株的基因组DNA进行Paired-End测序，对样品500bp文库依次采用下列步骤对原始数据进行处理：1)截取read1的 1bp-90bp，截取read2的1bp-90bp；2)去除质量值连续≤20的碱基数达到一定程度的reads(默认40％，设置为20个；3)去除含N的碱基数目总和达到一定比例的reads(默认10％,设置为4bp)；4)去除adapter污染(默认adapter序列与read序列有15bp的overlap,设置为15bp)；5)去除duplication污染；6)过滤小片段污染。拼接获得的相互部分重叠的基因组连续片段。逐步把它们拼接形成序列更长的重叠群，直到得到完整序列的过程称为重叠群组装，使用SOAPdenovo短序列组装软件(网址及版本号： http://soap.genomics.org.cn/soapdenovo.html；版本:1.05)对处理后的reads数据进行组装，经多次调整后主要参数K设置为75，得到最优的组装结果。

菌株HSY32基因大小为6,711,949bp，由798个scaffold组成，基因组的 G+C含量为35.4％。基因组序列进一步使用RAST软件(https://rast.nmpdr.org/) 和本地blast注释，HSY32基因组中共存在7,070个基因，发现1个新型的Cry 杀虫蛋白，其开放阅读框(ORF-0018)大小为2,871bp(SEQ NO.2)，编码956 个氨基酸(SEQ NO.1)，命名为Cry-like蛋白。Cry-like蛋白与已知杀线虫蛋白 Cry5、Cry6、Cry12、Cry13、Cry14、Cry21和Cry55氨基酸序列使用MUSCLE 进行多重序列比对。利用MEGA X软件构建系统进化树，采用MaximumParsimony(MP)方法，系统可信度检测采用自举法(bootstrapping)重复1000次进行。系统进化分析表明Cry-like独立为一个新分支，为一类新型毒素蛋白。

ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白质等电点为6.42、分子量大小为109kDa、化学式为C₄₈₆₁H₇₅₂₃N₁₃₀₇O₁₅₀₉S₁₈。SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_sopma.html)和 SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)分别预测蛋白质的二级结构和三维结构。

实施例6 cry-like基因克隆表达

HSY32基因DNA为模板，利用cry-like基因特异引物(0018F:

cgggatccATGAATTCAAATCATCACAATGACTA；0018R:

cggaattcTCATTTACTGCTTGTTGAGCTTG)进行PCR扩增，退火温度为55℃，延伸时间为3min，反应进行35个循环，琼脂糖凝胶电泳检测cry-like基因条带接近于3000bp，大小与预测基因大小2,871bp相符。为了方便PCR产物与表达载体pET-28a连接，设计引物时引入了BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点(酶切位点为小写字母表示)。将已成功构建的表达重组质粒各自转入大肠杆菌 BL21(DE3)中。为了可溶性蛋白能够成功的表达，逐步探索表达的最优条件。考虑加入IPTG，IPTG和温度都做梯度处理，IPTG含量设置梯度0μL、50μL、 80μL，每个梯度做两个平行，温度设置28℃和37℃，每个温度设置6个平行。过夜活化表达菌株，第二天按1％的量转接，28℃、37℃200rpm振荡培养，约2h后菌体长至OD₆₀₀约为0.6时加入对应量的IPTG，放入摇床振荡培养约 9h后开始收集菌体，在4℃，9000rpm下收集，收集完后开始清洗三次，NaCl 或PBS缓冲液均可，菌体溶于适量预先冷冻的PBS缓冲液中，加入100mM PMSF使得最终工作浓度为1mM，超声波破碎仪(model VC-130,sonics and materials Inc，USA)破碎40min至溶液透明，4℃，12000rpm收集上清，每管上清离心三次左右以去除多余的菌体。用0.22μm的滤膜过滤蛋白上清，贴好标签于-20℃保存。用SDS-PAGE电泳检测是否表达成功。

实施例7制备纯化重组蛋白

4℃,12,000rmp离心10min收集IPTG诱导表达的蛋白，充分悬浮于等体积的PBS溶液。表达的蛋白N端含有6×histidine(His)-tagged标签，用Ni-NTA 琼脂糖纯化树脂(氨基三乙酸)纯化，用Ni柱在终浓度为250mM的咪唑下纯化蛋白，整个过程在冰上操作。装柱：在柱子下端加入蒸馏水，并关闭柱子的出口。将亲和层析填料混匀后取2mL加入到层析柱中，待其自然沉降；水洗层析柱：打开层析柱下方的塞子，等液体流干后盖上塞子，加入5mL的蒸馏水，待其沉降分层后流出液体，再清洗三次；平衡层析柱：加入5mL Wash Buffer平衡层析柱，待其沉降分层后流出液体，再平衡两三次；上样：将提前解冻的蛋白上清取 15mL加入Ni-NTA吸附粒中，轻轻混匀；将层析柱放于4℃200rpm振荡0.5-2h；振荡完毕后，打开塞子收集流出的液体；漂洗：立即用2mL的20mM的咪唑清洗，清洗约10次；洗脱：用1.5mL的ElutionBuffer洗脱四次，收集洗脱液；层析柱再生：20mL Elution Buffer清洗层析柱，5mL蒸馏水洗涤两次，加入5mL 20％乙醇，待其沉降后打开塞子，让20％乙醇流掉一半，盖好塞子和上面的盖子，将层析柱放入4℃保存。用SDS-PAGE电泳检测纯化蛋白。BSA蛋白作为标准浓度，Lowry方法用来测定表达蛋白的浓度。表达的蛋白溶于PBS缓冲液中，然后稀释成8个浓度进行生物活性测定。

实施例8 Cry-like蛋白对秀丽隐杆线虫毒性测定

将E.coli(OP50)于37℃培养约9h后，均匀涂布于提前倒好已干燥的ENG 固体培养平板上。用无菌的解剖刀割取1cm²的秀丽隐杆线虫培养基(ENG培养基)于涂了OP50的ENG培养平板上，用封口膜封好，盖上湿毛巾，置于20℃培养3-5天左右，可进行生物活性测定。

用M9缓冲液从线虫板上把线虫冲洗下来置于2mLEp管中，待虫体沉降后吸取上清于新的Ep管中，M9缓冲液清洗两遍，加入终浓度为0.1％的Triton-100 于M9缓冲液中重新悬浮。准备96孔的生测板。

将提前准备的已过滤的表达蛋白解冻，用PBS缓冲液调整表达的Cry-like 蛋白的浓度至500ng/mL，再设立PBS空白对照和Cry5Ba阳性对照，每个孔加约50头线虫，重复6次(生测的线虫总数约300头)。封口置于20℃培养，5d 后取出在显微镜下观察，根据线虫的活动性观察是否死亡，统计数据，计算致死率。几次触摸后无法响应的蠕虫标记为死亡。记录每孔死亡幼虫比例，利用校正死亡率＝[(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照率死亡率)]×100％，表达的 Cry-like蛋白对秀丽隐杆线幼虫的杀虫活性校正死亡率为100％。

实施例9 Cry-like蛋白对南方根结线虫毒性测定

从感染的番茄的根结收获南方根结线虫((Meloidogyne incognita)的虫卵，通过用1％NaClO处理5-10分钟消毒，随后用无菌水洗涤。幼虫从18-25℃的水饱和滤纸片上的卵孵化出来，南方根结线虫幼虫被单独放入96孔微量滴定板的每个孔。这些含有浓度为500ng/mL的Cry-like毒素以及四环素和氯霉素(每种 30μg/ml)。每个孔中的最终体积为200μl。用BSA(20μg/ml)作为对照。线虫在20℃潮湿的室中孵育5天，并在解剖显微镜下检查死亡线虫数量。得出 Cry-like蛋白同样对南方根结线虫幼虫有很好的杀虫活性，校正死亡率达到100％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 海南师范大学

<120> 一种芽孢杆菌HSY32、杀虫蛋白、cry-like杀虫基因及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 956

<212> PRT

<213> 蕈状芽孢杆菌HSY32(Bacillus mycoides HSY32)

<400> 1

Met Asn Ser Asn His His Asn Asp Tyr Glu Ile Ile Asp Ser Asn Thr

1 5 10 15

Ser Pro Tyr Pro Ser Asn Lys Asn Asn Glu Tyr Ser Arg Tyr Pro Tyr

20 25 30

Thr His Asn Pro Asn Gln Pro Met Gln Asn Ala Asn Tyr Lys Asn Trp

35 40 45

Ile Asn Leu Cys Gln Glu Asn Thr Gln Tyr Gly Gln Asn Pro Glu Thr

50 55 60

Phe Asn Asp Thr Gln Thr Ala Val Val Thr Ser Leu Ala Ile Val Gly

65 70 75 80

Thr Ile Leu Ala Ile Pro Phe Pro Val Thr Gly Ala Gly Ile Thr Ile

85 90 95

Leu Gly Thr Leu Leu Pro Phe Val Trp Pro Ser Ser Ala Asp Thr Ser

100 105 110

Gln Gly Ile Trp Ile Ser Phe Ile Asn Ser Thr Glu Val Leu Ile Asp

115 120 125

Lys Thr Ile Asn Ser Gln Thr Lys Thr Asn Ala Val Arg Glu Leu Gln

130 135 140

Gly Leu Gln Ser Asn Val Gln His Tyr Gln Asn Leu Leu Gln Ser Trp

145 150 155 160

Leu Lys Ser Lys Asn Asn Val Ser Phe Gln Thr Ala Val Ser Gln Ala

165 170 175

Phe Thr Ala Ala His Ser His Phe Leu Arg Ser Met Asn Tyr Phe Lys

180 185 190

Gly Val Gln Asn Gln Glu Glu Asn Ile Leu Leu Leu Pro Ile Tyr Ala

195 200 205

His Ala Ala Asn Leu His Leu Leu Leu Leu Arg Asp Ala Ser Ile Tyr

210 215 220

Gly Lys Glu Trp Gly Phe Ser Pro Gln Glu Ile Asn Ile Phe Tyr Asn

225 230 235 240

Asn Gln Thr Ser Leu Thr Asn Glu Tyr Ile Glu His Cys Thr Gln Ser

245 250 255

Tyr Asn Thr Gly Leu Ser Ile Val Lys Thr His Tyr Leu Arg Lys Phe

260 265 270

Asp Trp Asn Asn Phe Asn Ser Phe Arg Arg Glu Met Thr Ile Lys Val

275 280 285

Leu Asp Ile Ile Ala Leu Phe Ser Asn Tyr Asp Thr His Lys Tyr Pro

290 295 300

Val Thr Ile Asn Asn Thr Leu Leu Pro Lys Thr Glu Leu Thr Arg Glu

305 310 315 320

Ile Tyr Thr Lys Ala Asn Ser Gly Asp Thr Pro Pro Lys Asp Gly Leu

325 330 335

Asp Gln Val Glu Gln Ala Leu Thr Arg Thr Pro His Leu Phe Thr Trp

340 345 350

Leu Asn Gln Leu Ile Leu Phe Ala Ser Lys Asn Asp Tyr Ser Thr Phe

355 360 365

Ser Leu Thr Ala Asn Gln Asn Cys Val Ile Lys Thr Asn Glu Arg Ile

370 375 380

Cys Ser Thr Glu Lys Ile Tyr Gly Glu Lys Arg Thr Asn Asp Thr Ile

385 390 395 400

Asn Gln Ile Asn Leu Asp Arg Phe Asn Ile Asp Lys Ile Thr Met Phe

405 410 415

Ser Pro Asn Asn Ile Arg Thr Leu Val Asn Ala Leu His Phe Tyr Gln

420 425 430

Gly Thr Ile Thr Gln Ala Ile Tyr Asn Pro Gly Asn Glu Ile Ser Ser

435 440 445

Gln Pro Ile Leu Thr Phe Glu Ile Pro Pro Val Thr Arg Asn Asn Lys

450 455 460

Thr Phe Asn His Ile Leu Ser Tyr Met Thr Thr Ala Val Asp Asn Ser

465 470 475 480

Ile Ala Thr Asp Pro Lys Thr Ser Gly Ser Arg Gln Ile Ala Phe Ala

485 490 495

Trp Thr His Ser Ser Val Asp Ser Lys Asn Thr Ile Gln Glu Lys Val

500 505 510

Ile Thr Ala Ile Pro Ala Ile Lys Ala Gln Phe Phe Lys Tyr Pro Asn

515 520 525

Ile Val Lys Asn Pro Gly His Leu Gly Gly Asp Leu Ile Ser Phe Lys

530 535 540

Thr Pro Asn Ser Val Asn Glu Lys Pro Leu Leu Asn Leu Gln Cys Gln

545 550 555 560

Val Ser Asn Phe Thr Leu Ser Asn Pro Gln Asn Tyr Ala Ile Arg Ile

565 570 575

Arg Tyr Ala Ala Asn Gln Arg Ile Gly Val Asn Val Asn Ile Ser Gly

580 585 590

Arg Pro Ser Arg Ser Phe Thr Thr Ser Asp Thr Met Ser Ser Ser Ile

595 600 605

Asn Gln Gly Gln Phe Leu Tyr Arg Gln Phe Gly Tyr Val Asp Val Phe

610 615 620

Thr Arg Thr Asn Pro Ile Ser Leu Ser Ser Asn Ser Leu Ile Thr Ile

625 630 635 640

Asp Ile Glu Pro Ser Ser Pro Leu Thr Gln Asn Thr Ile Phe Ala Ile

645 650 655

Asp Arg Ile Glu Phe Ile Pro Leu Asn His Phe Gln Thr Phe Glu Asn

660 665 670

Glu Gln Gln Thr Ile Glu Thr Ile Gln Asn Gln Thr Asn Asp Leu Phe

675 680 685

Ile Asp Tyr Thr Lys Asn Thr Leu Lys Thr Glu Val Thr Asp Tyr Gln

690 695 700

Ile Asp Gln Thr Ala Thr Thr Ile Glu Ser Ile Ser Glu Lys Gln Tyr

705 710 715 720

Pro Gln Glu Lys Met Ile Leu Leu Asp Glu Ile Lys His Ala Lys Gln

725 730 735

Leu Ser Tyr Ser Arg Asn Leu Leu Gln Asn Gly Asp Phe Gln Asp Leu

740 745 750

Ile Gly Trp Thr Ile Asn Asn Asp Val Thr Val Gln Thr Lys Asn Pro

755 760 765

Val Phe Lys Ala Ser Ser Leu Tyr Met Pro Gly Ala Arg Thr Ile Asp

770 775 780

Thr Thr Val Phe Pro Asn Tyr Ile Tyr Gln Lys Ile Asp Glu Ser Lys

785 790 795 800

Leu Lys Pro Tyr Thr Arg Tyr Leu Val Arg Gly Phe Ile Glu Ser Ser

805 810 815

Lys Asp Leu Glu Val Tyr Ile Thr Arg Tyr Asn Lys Glu Ile Asp Thr

820 825 830

Ile Met Asn Val Pro Asn Asp Phe Ile Ser Ile Gln Pro Tyr Asp Gln

835 840 845

Thr Asp Tyr Thr Thr Thr Gln Ile Ser Pro Asn Leu Thr Thr Ser His

850 855 860

Asn Ser Cys Thr Cys Glu Ser Thr Arg Leu Pro Thr Thr Cys Gln Asp

865 870 875 880

Pro His Ala Phe Ser Phe Phe Ile Asp Thr Gly Asn Leu His Phe Asn

885 890 895

Glu Asn Leu Gly Ile Ser Ile Leu Phe Lys Ile Ser Asn Pro Asn Gly

900 905 910

Tyr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Glu Val Ile Glu Glu Gln Pro Leu Thr

915 920 925

Asp Gln Asn Ile Gln Tyr Val Asn Lys Lys Gln Thr Thr Asn Arg Asn

930 935 940

Arg Thr Lys Leu Phe Ser Ser Ser Thr Ser Ser Lys

945 950 955

<210> 2

<211> 2871

<212> DNA

<213> 蕈状芽孢杆菌HSY32(Bacillus mycoides HSY32)

<400> 2

atgaattcaa atcatcacaa tgactatgaa attattgatt caaacacttc accataccct 60

tctaataaaa ataatgaata ttctcgatat ccttacactc ataatccaaa tcaacctatg 120

cagaacgcaa attacaaaaa ctggattaat ttgtgtcaag agaatacaca atatggtcaa 180

aatccagaaa cttttaatga tacacaaact gcagttgtta catctttagc tatagttggt 240

acgatactag ctataccatt tccggttact ggtgctggta ttacaatact cggaacatta 300

ctgccttttg tttggccttc tagtgctgat acatcacaag gtatttggat cagttttatc 360

aatagtacgg aagtacttat cgataaaaca ataaatagtc aaacaaaaac aaatgcagta 420

agagaattac aggggttaca aagtaatgtt caacattatc aaaaccttct tcaaagttgg 480

ctaaaaagta aaaacaatgt atcttttcaa acagctgtaa gtcaagcttt tacagccgct 540

cattctcatt ttttaagatc catgaattac ttcaaaggag tacaaaatca agaagaaaat 600

atactattat tacctattta tgcgcatgct gcaaacttgc atttactttt attaagagac 660

gcttctatat atggtaaaga atggggattt tcaccgcagg aaatcaatat tttttataat 720

aaccaaacaa gtttgactaa cgaatatatt gaacattgta ctcaaagtta taatacagga 780

ttaagtatag ttaaaacaca ttatctaaga aaattcgatt ggaataactt taattcattt 840

cgtagagaaa tgactataaa agtattagat attattgctt tattttcaaa ttatgataca 900

cataaatatc ctgtaacaat aaataataca ctactaccta aaacagaact tacaagagaa 960

atatatacta aagctaattc tggtgatacc ccacctaaag atggtttaga tcaagtagaa 1020

caagcactta ctcgaactcc tcatttattt acttggttaa atcaattaat tttatttgca 1080

agtaaaaatg attattctac cttttcatta acagctaatc aaaattgtgt aataaaaaca 1140

aatgaacgca tatgttcaac tgaaaaaata tatggagaaa aaagaacaaa cgatacaatc 1200

aatcaaatta atttagatag atttaatatt gataaaatca caatgttctc tccaaacaat 1260

attcgtactc tagtaaatgc attacatttt tatcagggta caattactca agctatttat 1320

aatcctggaa acgaaatatc atcacaacca atattaactt ttgaaatacc acctgtaaca 1380

cgaaataata aaacttttaa tcatatttta tcttatatga caactgctgt tgataatagt 1440

atagcaactg atcccaaaac atcaggttct agacaaattg catttgcgtg gacacattca 1500

agtgtagatt ctaagaatac aattcaagaa aaagttatta ctgcaatccc agctataaaa 1560

gctcaatttt ttaaatatcc taacatagta aaaaaccctg gacatctagg tggagattta 1620

atttcattta aaactccaaa ttctgtaaat gaaaaaccat tattaaattt acaatgtcaa 1680

gtgagtaact ttactctttc taatcctcaa aattatgcta ttcgaattcg ttacgctgca 1740

aatcaacgaa tcggagtaaa tgtaaacata tcaggtagac cttcaagatc atttactaca 1800

tctgatacaa tgtccagctc tataaatcaa ggacaatttt tatatagaca atttggttat 1860

gtagatgttt ttacacgaac taatccaatc tcattatctt caaatagttt aataacaata 1920

gacattgaac catcatctcc attaactcaa aatactatat ttgcaattga cagaattgaa 1980

tttataccat taaatcattt ccaaacattc gaaaatgaac aacaaacaat cgaaactata 2040

caaaatcaga ccaatgattt atttatagat tatacaaaaa acacattaaa aacagaagtt 2100

accgattatc aaattgatca aacagccact acaatagaat ctatatcaga aaaacaatat 2160

ccacaagaaa aaatgatctt acttgatgaa atcaagcacg caaaacaact tagttattcg 2220

cgtaacttac ttcagaatgg ggattttcaa gatttaattg gttggacgat aaacaatgat 2280

gttacagttc aaactaaaaa tccagttttc aaagcatctt ctctttatat gcctggagct 2340

cgaacaatag atactaccgt atttcccaat tatatctatc aaaaaataga tgaatctaaa 2400

ctaaaaccct atacacgtta tcttgttcga ggatttattg aaagtagtaa agacttagaa 2460

gtatatatta caagatataa caaagaaatc gatacaatca tgaatgtacc aaatgatttt 2520

atttctatcc aaccttatga ccaaacagac tatacaacaa cacaaatatc acccaatctc 2580

acaacatctc acaattcctg tacttgtgaa tcaactaggc tacctacaac ttgtcaagat 2640

ccgcatgcct tttcattctt tattgataca ggaaacttac atttcaacga aaatctaggt 2700

atttctattt tatttaaaat ttccaatcca aatggatacg ctaccttagg aaatctagaa 2760

gtcattgaag aacaaccatt aacagatcaa aacattcagt atgtaaataa aaaacaaaca 2820

acaaacagaa accgaacaaa gttattctca agctcaacaa gcagtaaatg a 2871

<210> 3

<211> 1462

<212> DNA

<213> 蕈状芽孢杆菌HSY32(Bacillus mycoides HSY32)

<400> 3

catctcttgt tccaccttag gcggctggct cctaaaggtt accccaccga cttcgggtgt 60

tacaaactct cgtggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg 120

catgctgatc cgcgattact agcgattcca gcttcatgta ggcgagttgc agcctacaat 180

ccgaactgag aacggtttta tgagattagc tccacctcgc ggtcttgcag ctctttgtac 240

cgtccattgt agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc 300

ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc accttagagt gcccaactta atgatggcaa 360

ctaagatcaa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga 420

cgacaaccat gcaccacctg tcactctgct cccgaaggag aagctctatc tctagagttt 480

tcagaggatg tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc 540

caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca gccttgcggc cgtactcccc 600

aggcggagtg cttaatgcgt taacttcagc actaaagggc ggaaaccctc taacacttag 660

cactcatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgtttgctc cccacgcttt 720

cgcgcctcag tgtcagttac agaccagaaa gtcgccttcg ccactggtgt tcctccatat 780

ctctacgcat ttcaccgcta cacatggaat tccactttcc tcttctgcac tcaagtctcc 840

cagtttccaa tgaccctcca cggttgagcc gtgggctttc acatcagact taagaaacca 900

cctgcgcgcg ctttacgccc aataattccg gataacgctt gccacctacg tattaccgcg 960

gctgctggca cgtagttagc cgtggctttc tggttaggta ccgtcaaggt gccagcttat 1020

tcaactagca cttgttcttc cctaacaaca gagttttacg acccgaaagc cttcatcact 1080

cacgcggcgt tgctccgtca gactttcgtc cattgcggaa gattccctac tgctgcctcc 1140

cgtaggagtc tgggccgtgt ctcagtccca gtgtggccga tcaccctctc aggtcggcta 1200

cgcatcgtcg ccttggtgag ccgttacctc accaactagc taatgcgacg cgggtccatc 1260

cataagtgac agccgaagcc gcctttcaat ttcgaactat gcagttcaaa atattatccg 1320

gtattagccc cggtttcccg gagttatccc agtcttatgg gtaggttacc cacgtgttac 1380

tcacccgtcc gccgctaact tcataagagc aagctcttaa tccattcgct cgactgcatg 1440

tatagcacgc ccgcctagct tt 1462

Claims

1.一种芽孢杆菌HSY32，其特征在于所述芽孢杆菌HSY32保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2021869，保藏日期为2021年7月12日。

2.一种杀虫蛋白，其特征在于所述杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种cry-like杀虫基因，其特征在于所述cry-like杀虫基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

4.权利要求1所述的芽孢杆菌HSY32在制备权利要求2所述的杀虫蛋白中的应用。

5.权利要求1所述的芽孢杆菌HSY32在制备权利要求3所述的cry-like杀虫基因中的应用。

6.权利要求2所述的杀虫蛋白在防治农业害虫中的应用。

7.权利要求3所述的cry-like杀虫基因在防治农业害虫中的应用。

8.权利要求6-7任一项所述的应用，其特征在于所述农业害虫优选线虫目昆虫，进一步优选秀丽隐杆线虫、南方根结线虫。