CN113788795B - 一种水溶性聚集诱导发光纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents

一种水溶性聚集诱导发光纳米粒子及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种水溶性聚集诱导发光纳米粒子及其制备方法和应用。该水溶性聚集诱导发光纳米粒子由单一两亲性化合物自组装而成，所述的两亲性化合物的结构式如式(a)所示，其中：R1选自H，‑CH3，‑OH，‑OCH3，‑NH2，‑N(CH3)2，‑F和‑NO2的一种，R2选自H，‑CH3，‑OH，‑OCH3，‑NH2，‑N(CH3)2，‑F和‑NO2的一种，n为1～6之间的整数。本发明提出的聚集诱导发光纳米粒子可用于高效的细胞成像，此外，该纳米粒子的自组装特性还可用于运载药物、核酸、抗体等，具有广阔的应用前景。
Figure DDA0003290344390000011

Description

一种水溶性聚集诱导发光纳米粒子及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米材料技术领域，尤其涉及一种水溶性聚集诱导发光纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术
目前，化学发光是用于生物成像最方便和灵敏的方法之一，大多数用于生物成像的分子探针为有机荧光分子探针，因具有灵敏度高、选择性好、检测限低等优点而被广泛研究。然而，传统的荧光生色团在聚集状态下荧光会减弱甚至消失，这种现象被称作聚集荧光淬灭(ACQ)。生命体系和自然环境多以水为介质，而有机荧光分子大都具有疏水特性，水溶性普遍较差，导致传统染料在固态或聚集态应用时效率大大降低，难以完成生物体内长期的成像及信号追踪。而辅助溶解的有机溶剂，也可能给生物应用带来隐患。
唐本忠院士研究组所定义的“聚集诱导发光现象”，突破了传统荧光聚集猝灭的瓶颈，实现了关于荧光探针分子的变革。聚集诱导发光分子可以在特定的条件下形成聚集体，荧光效率出现显著的增加甚至由暗到明的突跃，聚集诱导发光荧光探针在水中聚集和荧光增强的独特性质可以实现低浓度、大荧光信号及长期追踪，使其越来越多地应用于细胞成像等生物检测中。单纯的小分子聚集诱导发光荧光探针同样存在水溶性问题，亟待解决该问题。
发明内容
本发明解决了现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种水溶性聚集诱导发光纳米粒子及其制备方法和应用，本发明将疏水的聚集诱导发光基团与亲水基团结合成两亲性聚集诱导发光探针，自组装成水溶性的纳米探针，是发挥聚集诱导发光特性同时解决有机溶剂隐患的有效途径。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种水溶性聚集诱导发光纳米粒子，所述的水溶性聚集诱导发光纳米粒子由单一两亲性化合物自组装而成，所述的两亲性化合物的结构式如式(a)所示：
Figure BDA0003290344370000021
其中：R1选自H，-CH3，-OH，-OCH3，-NH2，-N(CH3)2，-F和-NO2的一种，R2选自H，-CH3，-OH，-OCH3，-NH2，-N(CH3)2，-F和-NO2的一种，n为1～6之间的整数。
本发明提出的纳米粒子具有优异的水溶性和聚集诱导发光的特性，为疾病的诊断、治疗效果评价等方面提供更多可用的检测手段，对提升我国居民健康水平具有重要的现实意义和价值。
优选地，式1中，当R1为H时，R2选自H，-CH3，-OH，-OCH3，-NH2，-N(CH3)2，-F和-NO2其中的一种，当R1不为H时，R1和R2相同，选自-CH3，-OH，-OCH3，-NH2，-N(CH3)2，-F和-NO2其中的一种。
本发明的第二个目的是保护上述两亲性化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将化合物1溶于无水二氯甲烷并冷却至0℃，加入EDCI、4-二甲氨基吡啶和三乙胺后，搅拌0.5～1h，然后在氮气保护下缓慢滴加溶于无水二氯甲烷的化合物2，20℃～30℃继续反应2～5h，除去溶剂，柱层析得到化合物3；
Figure BDA0003290344370000031
(2)将所述的化合物3和化合物4溶于THF/H2O体积比为4/1的混合溶液中，加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠后，在氮气保护下50℃～70℃反应2～5h，反应结束后抽干溶剂，加入二氯甲烷并用饱和EDTA溶液萃取，有机相经MgSO4干燥、过滤、浓缩，最后通过柱层析得到化合物5；
Figure BDA0003290344370000032
(3)将所述的化合物5溶于甲醇中，缓慢加入过量的乙二胺，20℃～40℃反应1～3天，除去溶剂，粗产物通过透析纯化，冻干得到目标化合物6；
Figure BDA0003290344370000041
上述方法的反应式合并如式i所示：
Figure BDA0003290344370000042
其中：R1选自H，-CH3，-OH，-OCH3，-NH2，-N(CH3)2，-F和-NO2的一种，R2选自H，-CH3，-OH，-OCH3，-NH2，-N(CH3)2，-F和-NO2的一种，n为1～6之间的整数。
本发明提出的两亲性化合物(树形分子)具有准确的结构式和分子量，且可以通过结构调整获得不同特性的化合物，避免了传统纳米粒子结构未知、重复性差的问题。
优选地，步骤(1)中化合物1与EDCI的摩尔比为1:1.5～3，EDCI与4-二氨基吡啶的摩尔比为1:1，EDCI与三乙胺的摩尔比为1:1～2，化合物1与化合物2的摩尔比为1:1～1.5。
优选地，步骤(2)中化合物3与化合物4的摩尔比为1～1.2:1，化合物3与五水硫酸铜的摩尔比为5～10:1，化合物3与抗坏血酸钠的摩尔比为2.5～5:1。
优选地，上述两亲性化合物的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)将化合物1溶于无水二氯甲烷并冷却至0℃，加入EDCI、4-二甲氨基吡啶和三乙胺后，搅拌0.5h，然后在氮气保护下缓慢滴加溶于无水二氯甲烷的化合物2，25℃继续反应3h，除去溶剂，柱层析得到化合物3；
(2)将所述的化合物3和化合物4溶于THF/H2O体积比为4/1的混合溶液中，加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠后，在氮气保护下60℃反应3h，反应结束后抽干溶剂，加入二氯甲烷并用饱和EDTA溶液萃取，有机相经MgSO4干燥、过滤、浓缩，最后通过柱层析得到化合物5；
(3)将所述的化合物5溶于甲醇中，缓慢加入过量的乙二胺，30℃反应2天，除去溶剂，粗产物通过透析纯化，冻干得到目标化合物6。
本发明第三个目的是保护上述水溶性聚集诱导发光纳米粒子的制备方法，通过薄膜分散法来实现，包括如下步骤：将所述的两亲性化合物溶于甲醇中，然后通过旋转蒸发仪除去溶剂，在瓶底形成薄膜，然后加入去离子水，并利用超声分散，滤膜过滤后，得到所述的水溶性聚集诱导发光纳米粒子。本发明通过两亲性化合物(树形分子)自组装而成聚集诱导发光纳米粒子水溶性好，避免了有机溶剂的使用。
本发明第四个目的是保护水溶性聚集诱导发光纳米粒子在制备细胞成像试剂中的应用。本发明提出的水溶性聚集诱导发光纳米粒子可用于高效的细胞成像，此外，这种纳米粒子的自组装特性还可用于运载药物、核酸、抗体等，具有广阔的应用前景。
本发明的第五个目的是保护一种荧光纳米探针，包括负载上述水溶性聚集诱导发光纳米粒子。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明提出的两亲性化合物(树形分子)具有准确的结构式和分子量，且可以通过结构调整获得不同特性的化合物，避免了传统纳米粒子结构未知、重复性差的问题。
(2)本发明提出的两亲性树形分子自组装而成聚集诱导发光纳米粒子水溶性好，避免了有机溶剂的使用。
(3)本发明提出的聚集诱导发光纳米粒子可用于高效的细胞成像，此外，这种纳米粒子的自组装特性还可用于运载药物、核酸、抗体等，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是实施例1水溶性聚集诱导发光纳米粒子在不同浓度水溶液中的紫外吸收光谱图；
图2是实施例1水溶性聚集诱导发光纳米粒子在不同浓度水溶液中的荧光发射光谱图；
图3是实施例1水溶性聚集诱导发光纳米粒子的水合直径大小和分布(DLS)图；
图4是实施例1水溶性聚集诱导发光纳米粒子的TEM图；
图5是实施例1水溶性聚集诱导发光纳米粒子的细胞成像图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。除特别说明，本发明使用的设备和试剂为本技术领域常规市购产品。本发明提出的化合物4按照已发表文献(Angewandte Chemie,2012,124(34):8606-8612)公开的步骤合成。
实施例1
水溶性聚集诱导发光纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
(1)将化合物1-1(4-(1,2,2-三苯基乙烯基)-[1,1'-联苯]-4-羧酸)(453mg，1.0mmol)溶于10mL无水二氯甲烷并冷却至0℃，加入EDCI(383mg，2.0mmol)、4-二甲氨基吡啶(244mg，2.0mmol)和三乙胺(304mg，3.0mmol)后，搅拌0.5h，然后在氮气保护下缓慢滴加溶于无水二氯甲烷的化合物2-1(叠氮十二烷-1-胺)(226mg，1.0mmol)，在25℃继续反应3h，除去溶剂，柱层析得到化合物3-1共549mg，产率83％；
(2)将化合物3-1(330mg，0.5mmol)和化合物4(714mg，0.5mmol)溶于THF/H2O(v：v)＝4/1的混合溶液中，加入五水硫酸铜(12mg，0.05mmol)和抗坏血酸钠(19.8mg，0.1mmol)后，在氮气保护下60℃反应3h，反应结束后抽干溶剂，加入二氯甲烷并用饱和EDTA溶液萃取3次，有机相经MgSO4干燥、过滤、浓缩，最后通过柱层析得到化合物5-1共794mg，产率76％；
(3)将化合物5-1(627mg，0.3mmol)溶于甲醇中，缓慢加入过量的乙二胺，在30℃搅拌2天，除去溶剂后，粗产物通过MWCO＝1000的透析膜进行透析纯化，然后冻干得到目标化合物6-1共660mg，产率95％；
(4)将化合物6-1 5.0mg溶于2.0mL甲醇中，通过旋转蒸发仪除去溶剂，在瓶底形成薄膜，然后加入2.0mL去离子水，利用超声分散20min，经过0.22μm滤膜过滤后，得到聚集诱导发光纳米粒子6-1，将聚集诱导发光纳米粒子冻干后保存在4℃冰箱中。
上述方法的反应式如下式所示：
Figure BDA0003290344370000081
将聚集诱导发光纳米粒子6-1溶于DMSO中配置成浓度为1.0mM的储液，然后配置成含水质量百分比分别为0％、50％和98％的溶液，聚集诱导发光纳米粒子6-1浓度为20μM，图1为聚集诱导发光纳米粒子在不同浓度水溶液中的紫外吸收光谱图，如图1所示，随着含水百分比的增加，纳米粒子的紫外吸收逐渐变强，最大吸收峰显著增强，且吸收峰的位置逐渐蓝移。该结果说明聚集诱导发光纳米粒子的状态发成了变化，导致紫外吸收情况发生改变。
将聚集诱导发光纳米粒子6-1溶于DMSO中配置成浓度为1.0mM的储液，然后配置成含水质量百分比分别为0％、50％和98％的溶液，聚集诱导发光纳米粒子6-1浓度为20μM，图2为聚集诱导发光纳米粒子在不同浓度水溶液中的荧光发射谱图，如图2所示，随着含水百分比的增加，聚集诱导发光纳米粒子发射的荧光逐渐变强。
称取聚集诱导发光纳米粒子6-1固体溶于超纯水中，稀释成100μM的纳米胶束溶液，用孔径为0.45μm的滤膜过滤后，取1-2mL样品，用DLS测定纳米胶束的水合直径和粒径分布。图3为聚集诱导发光纳米粒子的水合直径大小和分布图，如图3所示，聚集诱导发光纳米粒子的水合直径在14nm左右，具有较好的均一性。
称取聚集诱导发光纳米粒子6-1固体溶于去离子水中，稀释成40μM的纳米胶束溶液，用孔径为0.22μm的滤膜过滤后，取10μL样品滴于镀碳膜铜网上，红外灯下干燥30min直至水分完全挥发，用5μL质量浓度1％的醋酸双氧铀溶液复染30秒，立即用滤纸吸干染色液，通过TEM观察样品形态学特性。图4为聚集诱导发光纳米粒子6-1的TEM图，如图4所示，聚集诱导发光纳米粒子的直径在12nm左右，比DLS结果偏小，这是由于TEM测试的是已经干燥的纳米粒子，是实际尺寸，而DLS是溶液状态下的复合离子粒径(水合直径)，包括纳米颗粒的核以及膨胀的胶团。因此，该结果符合实际情况。
实施例2
水溶性聚集诱导发光纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
(1)将化合物1-2(4'-(2,2-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基乙烯基)-[1,1'-联苯]-4-羧酸)(513mg，1.0mmol)溶于10mL无水二氯甲烷并冷却至0℃，加入EDCI(288mg，1.5mmol)、4-二甲氨基吡啶(183mg，1.5mmol)和三乙胺(152mg，1.5mmol)后，搅拌0.5h，然后在氮气保护下缓慢滴加溶于无水二氯甲烷的化合物2-2(叠氮十四烷-1-胺)(254mg，1.0mmol)，在30℃继续反应2.5h，除去溶剂，柱层析得到化合物3-2共584mg，产率78％；
(2)将化合物3-2(449mg，0.6mmol)和化合物4(714mg，0.5mmol)溶于THF/H2O＝4/1的混合溶液中，加入五水硫酸铜(30mg，0.12mmol)和抗坏血酸钠(48mg，0.24mmol)后，在氮气保护下50℃反应2h，反应结束后抽干溶剂，加入二氯甲烷并用饱和EDTA溶液萃取3次，有机相经MgSO4干燥、过滤、浓缩，最后通过柱层析得到化合物5-2共882mg，产率81％；
(3)将化合物5-2(653mg，0.3mmol)溶于甲醇中，缓慢加入过量的乙二胺，在25℃搅拌3天，除去溶剂后，粗产物通过MWCO＝1000的透析膜进行透析纯化，然后冻干得到目标化合物6-2共670mg，产率93％；
(4)将化合物6-2 5.0mg溶于2.0mL甲醇中，通过旋转蒸发仪除去溶剂，在瓶底形成薄膜，然后加入2.0mL去离子水，利用超声分散20min，经过0.22μm滤膜过滤后，可得到聚集诱导发光纳米粒子，将纳米粒子冻干后保存在4℃冰箱中。
上述方法的反应式如下式所示：
Figure BDA0003290344370000111
。
实施例3
水溶性聚集诱导发光纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
(1)将化合物1-3(4'-(2,2-双(4-氟苯基)-1-苯基乙烯基)-[1,1'-联苯]-4-羧酸)(489mg，1.0mmol)溶于10mL无水二氯甲烷并冷却至0℃，加入EDCI(575mg，3.0mmol)、4-二甲氨基吡啶(367mg，3.0mmol)和三乙胺(304mg，3.0mmol)后，搅拌0.5h，然后在氮气保护下缓慢滴加溶于无水二氯甲烷的化合物2-3(叠氮十六烷-1-胺)(424mg，1.5mmol)，在25℃继续反应5h，除去溶剂，柱层析得到化合物3-3共640mg，产率85％；
(2)将化合物3-3(376mg，0.5mmol)和化合物4(714mg，0.5mmol)溶于THF/H2O＝4/1的混合溶液中，加入五水硫酸铜(12mg，0.05mmol)和抗坏血酸钠(19.8mg，0.1mmol)后，在氮气保护下70℃反应5h，反应结束后抽干溶剂，加入二氯甲烷并用饱和EDTA溶液萃取3次，有机相经MgSO4干燥、过滤、浓缩，最后通过柱层析得到化合物5-3共840mg，产率77％；
(3)将化合物5-3(655mg，0.3mmol)溶于甲醇中，缓慢加入过量的乙二胺，在40℃搅拌1天，除去溶剂后，粗产物通过MWCO＝1000的透析膜进行透析纯化，然后冻干得到目标化合物6-3共657mg，产率91％；
(4)将化合物6-2 5.0mg溶于2.0mL甲醇中，通过旋转蒸发仪除去溶剂，在瓶底形成薄膜，然后加入2.0mL去离子水，利用超声分散20min，经过0.22μm滤膜过滤后，可得到聚集诱导发光纳米粒子，将纳米粒子冻干后保存在4℃冰箱中。
上述方法的反应式如下式所示：
Figure BDA0003290344370000131
实验例1
聚集诱导发光纳米粒子在细胞成像中的应用
将聚集诱导发光纳米粒子6-1溶于PBS缓冲溶液(10mM，pH＝7.4)中配置成浓度为500μM的储液(纳米探针)。
实验例通过激光共聚焦显微镜考察了聚集诱导发光纳米粒子在细胞成像中的应用情况：
将消化后的RAW264.7细胞接种在含10％的小牛血清的RPMI-1640培养液中，在37℃，5％CO2的无菌条件下持续培养24h使细胞贴壁，然后用灭菌的PBS缓冲溶液(pH＝7.4)洗三次。加入纳米探针并稀释至溶度为10μM，继续孵育4h，然后用PBS缓冲溶液洗三次，用于细胞成像。
图5为聚集诱导发光纳米粒子的细胞成像结果，如图5所示，聚集诱导发光纳米粒子能够有效进入细胞，实现细胞成像。
以上实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种水溶性聚集诱导发光纳米粒子，其特征在于，所述的水溶性聚集诱导发光纳米粒子由单一两亲性化合物自组装而成，所述的两亲性化合物的结构式如式(a)所示：
Figure FDA0003290344360000011
其中：R1选自H，-CH3，-OH，-OCH3，-NH2，-N(CH3)2，-F和-NO2的一种，R2选自H，-CH3，-OH，-OCH3，-NH2，-N(CH3)2，-F和-NO2的一种，n为1～6之间的整数。
2.根据权利要求1所述的水溶性聚集诱导发光纳米粒子，其特征在于，式1中，当R1为H时，R2选自H，-CH3，-OH，-OCH3，-NH2，-N(CH3)2，-F和-NO2其中的一种，当R1不为H时，R1和R2相同，选自-CH3，-OH，-OCH3，-NH2，-N(CH3)2，-F和-NO2其中的一种。
3.权利要求1所述的两亲性化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将化合物1溶于无水二氯甲烷并冷却至0℃，加入EDCI、4-二甲氨基吡啶和三乙胺后，搅拌0.5～1h，然后在氮气保护下缓慢滴加溶于无水二氯甲烷的化合物2，20℃～30℃继续反应2～5h，除去溶剂，柱层析得到化合物3；
(2)将所述的化合物3和化合物4溶于THF/H2O体积比为4/1的混合溶液中，加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠后，在氮气保护下50℃～70℃反应2～5h，反应结束后抽干溶剂，加入二氯甲烷并用饱和EDTA溶液萃取，有机相经MgSO4干燥、过滤、浓缩，最后通过柱层析得到化合物5；
(3)将所述的化合物5溶于甲醇中，缓慢加入过量的乙二胺，20℃～40℃反应1～3天，除去溶剂，粗产物通过透析纯化，冻干得到目标化合物6；
上述方法的反应式如式i所示：
Figure FDA0003290344360000021
其中：R1选自H，-CH3，-OH，-OCH3，-NH2，-N(CH3)2，-F和-NO2的一种，R2选自H，-CH3，-OH，-OCH3，-NH2，-N(CH3)2，-F和-NO2的一种，n为1～6之间的整数。
4.根据权利要求3所述的两亲性化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中化合物1与EDCI的摩尔比为1:1.5～3，EDCI与4-二氨基吡啶的摩尔比为1:1，EDCI与三乙胺的摩尔比为1:1～2，化合物1与化合物2的摩尔比为1:1～1.5。
5.根据权利要求3所述的两亲性化合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中化合物3与化合物4的摩尔比为1～1.2:1，化合物3与五水硫酸铜的摩尔比为5～10:1，化合物3与抗坏血酸钠的摩尔比为2.5～5:1。
6.根据权利要求3所述的两亲性化合物的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)将化合物1溶于无水二氯甲烷并冷却至0℃，加入EDCI、4-二甲氨基吡啶和三乙胺后，搅拌0.5h，然后在氮气保护下缓慢滴加溶于无水二氯甲烷的化合物2，25℃继续反应3h，除去溶剂，柱层析得到化合物3；
(2)将所述的化合物3和化合物4溶于THF/H2O体积比为4/1的混合溶液中，加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠后，在氮气保护下60℃反应3h，反应结束后抽干溶剂，加入二氯甲烷并用饱和EDTA溶液萃取，有机相经MgSO4干燥、过滤、浓缩，最后通过柱层析得到化合物5；
(3)将所述的化合物5溶于甲醇中，缓慢加入过量的乙二胺，30℃反应2天，除去溶剂，粗产物通过透析纯化，冻干得到目标化合物6。
7.权利要求1所述的水溶性聚集诱导发光纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述的两亲性化合物溶于甲醇中，然后通过旋转蒸发仪除去溶剂形成薄膜，然后加入去离子水分散，滤膜过滤后，得到所述的水溶性聚集诱导发光纳米粒子。
8.权利要求1所述的水溶性聚集诱导发光纳米粒子在制备细胞成像试剂中的应用。
9.一种荧光纳米探针，其特征在于，包括负载权利要求1所述的水溶性聚集诱导发光纳米粒子。
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