CN113777064A - 一种炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测试剂盒及其检测方法，试剂盒包括检测试剂和反应板，反应板包括由下往上依次叠装的底层、定量层和研磨层；底层上形成有若干个用于固定比色皿的凹槽；定量层上贯穿设有若干个定量杯，每个定量杯底部均开有滴孔；研磨层内形成有研磨腔体，研磨腔体内设有研磨机构，研磨腔体的底部开有若干个滤孔。该试剂盒具有研磨破壁、浸提、过滤、定量、静置等功能，仅采用该试剂盒就能实现对炭角菌胞内多糖的提取，再配合分光光度计即可进行体外抗氧化活性检测，整个检测过程得到大幅度简化，降低了样品溶液的受污染概率，提高了检测结果的可靠性，为炭角菌保健功效及相关药物的研究提供了重要保障。

Description

一种炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测试剂盒及其检测 方法
技术领域
本发明涉及真菌检测技术领域，具体涉及一种炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
真菌多糖是真菌中分离出的由10个以上的单糖以糖苷键连接而成的不溶于高浓度乙醇、正丁醇及丙酮等有机溶剂的高分子聚合物，是从真菌子实体、菌丝体及发酵液中分离出的代谢产物。大量药理实验表明，真菌多糖可以消除体内的自由基，具有抗氧化性，因而具有免疫调节、抗肿瘤、降低糖脂、延缓衰老等活性，己被广泛应用于医疗保健领域”。到目前为止，已有300余种多糖类化合物从天然产物中被分离出来，其中从中草药、食药用菌中提取的水溶性多糖最为重要。
炭角菌科(Xylariaceae)，是真菌门、子囊菌亚门、核菌纲、球壳目的一科。由于炭角菌生长环境特殊，采掘困难，自然资源极为稀少。已有的对其发酵菌丝体的研究表明：其菌丝体富含蛋白质和氨基酸，包括7种人体必需氨基酸；人体必需的18种矿质元素，发酵菌丝体中含有16种，其中人体缺乏的锌、钙、铁、锰等元素含量更高。炭角菌菌体中粗多糖含量极高，并且炭角菌的发酵制品中成功提取出纯度较高的并证明了其有着较高的抗氧化性特征的12个物质。因此，检测炭角菌胞内多糖的抗氧化活性对医疗保健药物的研发具有十分重要的意义。
目前，炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测的指标主要包括还原性、对羟自由基的清除能力、氧自由基的清除能力、DPPH自由基的清除能力等。而检测的主要方法是在试管中加入对应的试剂，然后加入炭角菌样品溶液，采用分光光度计测定吸光值，根据反应溶液的颜色判断抗氧化活性。其中，在制取炭角菌样品溶液时，需要进行研磨破壁、浸提、过滤、定量等操作，然后再使用检测试剂盒内比色皿以及相关检测试剂对样品溶液进行检测，整个过程需要用到多种实验仪器，增加了操作的复杂性，且反复转移样品溶液可能会造成溶液的污染失效，影响检测的准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测试剂盒及其检测方法，其解决了炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性的现有检测方式存在的操作复杂、易造成样品污染、影响检测准确性等缺陷。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
一种炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测试剂盒，包括检测试剂和反应板，所述检测试剂包括炭角菌胞内多糖提取溶剂和多糖抗氧化活性检测试剂，所述反应板包括由下往上依次叠装的底层、定量层和研磨层；
所述底层上形成有若干个用于固定比色皿的凹槽；
所述定量层上贯穿设有若干个定量杯，每个定量杯底部均开有滴孔，所述滴孔与底层的比色皿一一对应连通；
所述研磨层内形成有研磨腔体，所述研磨腔体内设有研磨机构，研磨腔体的底部开有若干个滤孔，所述滤孔与定量层的定量杯一一对应连通。
进一步改进在于，所述凹槽的四周设有可拆卸滤纸。
进一步改进在于，所述滴孔的孔径大小被配置成：允许液体呈液滴状滴落。
进一步改进在于，所述定量层以及定量杯采用透明材质制成，定量层与定量杯为一体式结构。
进一步改进在于，所述定量层表面覆盖有一层吸水纸，所述吸水纸上开有用于定量杯穿过的孔洞。
进一步改进在于，所述定量层上设有可拆卸盖体。
进一步改进在于，所述研磨层由若干独立板块组成，每个独立板块内均形成有一个研磨腔体。
进一步改进在于，所述研磨机构包括转轴、横杆、微型电机、以及若干转动研磨片和固定研磨片，所述转轴活动设于研磨腔体内部，所述转动研磨片间隔分布在转轴上，所述微型电机设于研磨层外侧边且与转轴端部连接，所述横杆与转轴平行设置，所述固定研磨片间隔分布在横杆上，且固定研磨片与转动研磨片一一对应接触。
进一步改进在于，所述横杆有两根，两根横杆分列在转轴的上、下方，且横杆的两端均通过弹簧件与研磨腔体内壁柔性连接，所述固定研磨片呈半圆环形，且两根横杆上位置对应的两个固定研磨片构成圆环形后与同一转动研磨片接触，所述转动研磨片呈圆形，转动研磨片用于与固定研磨片接触的侧面上形成有凸起，所述凸起呈圆心角小于180°的扇形，且凸起的其中一半径边缘的厚度为突变式变为零，另一半径边缘的厚度为渐变式变为零。
本发明还提供了一种利用上述试剂盒进行炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测方法，步骤包括：
步骤一、将炭角菌剪碎后加入到研磨层的研磨腔体内，启动研磨机构进行研磨，研磨一段时间后，往研磨腔体内加入炭角菌胞内多糖提取溶剂，继续研磨得到浸提液，浸提液经滤孔流至定量层的定量杯内；
步骤二、待定量杯内的浸提液全部装满时，将研磨层卸除，静置，浸提液逐滴滴落至底层的比色皿中；
步骤三、待定量杯中浸提液完全滴落时，将定量层卸除，往比色皿中加入多糖抗氧化活性检测试剂，同时以未添加浸提液的多糖抗氧化活性检测试剂比色皿作为空白对照，利用分光光度计检测各比色皿的吸光度，根据吸光度计算对应炭角菌的抗氧化活性值。
本发明的有益效果在于：该试剂盒具有研磨破壁、浸提、过滤、定量、静置等功能，仅采用该试剂盒就能实现对炭角菌胞内多糖的提取，再配合分光光度计即可进行体外抗氧化活性检测，整个检测过程得到大幅度简化，降低了样品溶液的受污染概率，提高了检测结果的可靠性，为炭角菌保健功效及相关药物的研究提供了重要保障。
附图说明
图1为炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测试剂盒拆分后的示意图；
图2为图1中A部分的放大图；
图3为转动研磨片和固定研磨片的平面结构示意图；
图4为转动研磨片的立体示意图；
图5为炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测试剂盒叠装后的示意图；
图中：1、底层；11、比色皿；12、凹槽；13、可拆卸滤纸；2、定量层；21、定量杯；22、滴孔；23、吸水纸；24、可拆卸盖体；3、研磨层；31、研磨腔体；32、研磨机构；321、转轴；322、横杆；323、微型电机；324、转动研磨片；325、固定研磨片；326、弹簧件；327、凸起；33、滤孔。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
实施例1：检测试剂盒的设置
结合图1至图4所示，一种炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测试剂盒，包括检测试剂和反应板，检测试剂包括炭角菌胞内多糖提取溶剂和多糖抗氧化活性检测试剂，反应板包括由下往上依次叠装的底层1、定量层2和研磨层3；
底层1上形成有若干个用于固定比色皿11的凹槽12，较佳的，凹槽12形状与比色皿11形状匹配，且凹槽12深度超过比色皿11高度的二分之一，便于固定；
定量层2上贯穿设有若干个定量杯21，每个定量杯21底部均开有滴孔22，滴孔22与底层1的比色皿11一一对应连通，在叠装后由滴孔22滴落的浸提液会直接落入底层1的比色皿11内；
研磨层3内形成有研磨腔体31，研磨腔体31顶部开口，用于装入炭角菌以及多糖抗氧化活性检测试剂，研磨腔体31内设有研磨机构32，用于对炭角菌进行研磨破壁，使多糖成分析出，研磨腔体31的底部开有若干个滤孔33，滤孔33与定量层2的定量杯21一一对应连通。进一步的，滤孔33为带有滤网的圆孔，孔径大小优选0.5-1cm，且可以带有开关阀门。
上述炭角菌胞内多糖提取溶剂可以针对不同类型的多糖提供不同的溶剂，例如：针对水溶性多糖采用80℃热蒸馏水，料液比为1:55(g/mL)；针对酸溶性多糖采用酸浓度为0.18mol/L的醋酸缓冲液，料液比为1:40(g/mL)；针对碱溶性多糖采用浓度为5％的NaOH溶液，料液比为1:20(g/mL)。
上述多糖抗氧化活性检测试剂可以针对不同的检测指标提供不同的试剂，例如：以还原性为检测指标，可以采用pH6.6的磷酸缓冲液和质量分数为1％的铁氰化钾溶液作为检测试剂，其原理为利用样品将铁氰化钾(K3Fe(CN)6)还原为亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6)，亚铁氰化钾再与Fe3+作用，生成亚铁氰化铁(普鲁士蓝)，以在700nm波长处检测普鲁士蓝的吸光度表示还原性的大小，吸光度越高，样品的还原性就越强，即抗氧化活性越强；又例如：以对羟自由基(·OH)的清除能力为检测指标，则可以采用0.15mol/L的磷酸缓冲液(pH7.4)、番红溶液(520μg/mL)、6mmol/L的EDTA Na2Fe2+、6％的H2O2,测520nmOD值，吸光度越高说明样品的清除能力越强。
优选的，凹槽12的四周设有可拆卸滤纸13，可拆卸滤纸13可以在取出比色皿11时将比色皿11表面擦拭干净，这样省去了再去擦拭的步骤，保证了检测的准确性。
优选的，滴孔22的孔径大小被配置成：允许液体呈液滴状滴落。针对炭角菌的浸提液，滴孔22的孔径大小一般设置为0.2-0.4mm。在定量杯21内的浸提液静置并缓慢滴落，该过程需要一定的时间，该时间可进一步促进多糖的提取。
优选的，定量层2以及定量杯21采用透明材质制成，例如石英玻璃、透明塑料等，以方便观察定量杯21是否装满。定量层2与定量杯21可以采用分体式结构，也可采用一体式结构，采用一体式结构时可以防止定量杯21与定量层2接触的表面存在缝隙，使渗出的液体从缝隙流出。
优选的，定量层2表面覆盖有一层吸水纸23，吸水纸23上开有用于定量杯21穿过的孔洞。使用时，将吸水纸23套在定量层2的表面，吸水纸23用于承载定量杯21溢出的液体，这样可以保持装置干燥性，溢出的液体不会因为震动或操作问题污染其他定量杯21内的液体。
优选的，定量层2上设有可拆卸盖体24，可在静置过程中将定量层2盖住，避免受到外界环境的影响。
优选的，底层1可以为最大的一块板，定量层2与底层1的板面大小相匹配，而研磨层3由若干独立板块组成，每个独立板块内均形成有一个研磨腔体31。这样可以加入不同的炭角菌胞内多糖提取溶剂，同时检测炭角菌胞内不同类型(水溶性、酸溶性、碱溶性)的多糖的抗氧化活性，进而可以得到炭角菌胞内多糖中具有抗氧化活性的多糖类型。
作为一种优选实施例，本发明中研磨机构32包括转轴321、横杆322、微型电机323、以及若干转动研磨片324和固定研磨片325，转轴321活动设于研磨腔体31内部，转动研磨片324间隔分布在转轴321上，微型电机323设于研磨层3外侧边且与转轴321端部连接，横杆322与转轴321平行设置，固定研磨片325间隔分布在横杆322上，且固定研磨片325与转动研磨片324一一对应接触。转动研磨片324和固定研磨片325的表面均设置为糙面，启动微型电机323时，转轴321带动转动研磨片324转动，使得转动研磨片324贴着固定研磨片325转动，可对落入两研磨片之间以及紧贴转动研磨片324外侧的炭角菌进行研磨。
进一步的，横杆322有两根，两根横杆322分列在转轴321的上、下方，且横杆322的两端均通过弹簧件326与研磨腔体31内壁柔性连接，固定研磨片325呈半圆环形，且两根横杆322上位置对应的两个固定研磨片325构成圆环形后与同一转动研磨片324接触，转动研磨片324呈圆形，转动研磨片324用于与固定研磨片325接触的侧面上形成有凸起327，凸起327呈圆心角小于180°的扇形，优选的是10-30℃，且凸起327的其中一半径边缘的厚度为突变式变为零，另一半径边缘的厚度为渐变式变为零。
在转动研磨片324贴着固定研磨片325转动时，凸起327会顶起(由渐变式半径边缘顶起)与其对应的两个固定研磨片325中其中一个，顶起后横杆322移动、两端弹簧件326压缩或伸长，这样转动研磨片324与顶起的固定研磨片325之间的非凸起327区域产生间隙，使得炭角菌落入间隙内，继续转动，凸起327脱离(由突变式半径边缘脱离)该固定研磨片325，脱离后在弹簧件326的作用下，横杆322以及该固定研磨片325具有恢复原位的趋势，压迫并转动研磨间隙之间的炭角菌，当转动研磨片324继续转动，凸起327又会顶起另一个固定研磨片325，如此循环。在循环过程中，实现了将炭角菌送入两研磨片之间，提高了研磨效率；同时，横杆322以及固定研磨片325快速、短距离地反复移动，产生了微振动效果，进而可以促进下层溶液的混合和提取。
实施例2：炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测
(一)炭角菌的制取
(1)菌种来源：市购后经分离而得。
(2)菌种培养基：(2.1)平板培养基：综合PDA，pH自然。(2.2)液体培养基：葡萄糖2％、蛋白胨1％、pH自然。(2.3)合成培养基(g)A：MnSO4·4H2O 0.001g、FeSO4·7H2O0.005g、ZnSO4·7H2O 0.01g、NaCl 0.25g、CuSO4·4H20 0.01g、NaHPO4 1.00g、葡萄糖30g、天门冬氨酸4.00g，蒸馏水定溶至1000mL。B：CaCO3 0.25g、NaCl 0.20g、MgSO4 0.20g、KHPO41.00g、Na2HPO4 1.00g、葡萄糖30g、天门冬氨酸4.00g,蒸馏水定溶至1000mL。以上培养基均于15磅灭菌30min后使用。
(3)发酵培养：250mL三角瓶装液体培养基150mL,用直径lcm的打孔器在长满菌丝的平板培养基上打孔，每瓶接入5块菌丝块，150r/min，28℃摇床培养7天。实验室中试：250L发酵罐装液体培养基180L,接种1％的上述250mL三角瓶培养7天的菌丝体，25℃培养，溶氧量≥40％。
(二)炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测
结合图5所示，利用上述试剂盒进行炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测，方法步骤包括：
步骤一、将发酵培养得到的炭角菌剪碎后加入到研磨层3的研磨腔体31内，启动研磨机构32进行研磨，研磨一段时间后，根据常规的操作步骤往研磨腔体31内加入炭角菌胞内多糖提取溶剂，继续研磨得到浸提液，浸提液经滤孔33流至定量层2的定量杯21内；
步骤二、待定量杯21内的浸提液全部装满时，将研磨层3卸除，静置，静置的同时浸提液逐滴滴落至底层1的比色皿11中；
步骤三、待定量杯21中浸提液完全滴落时，提取过程也基本完成，也实现了定量作用，此时将定量层2卸除，根据常规的操作步骤往比色皿11中加入多糖抗氧化活性检测试剂，同时以未添加浸提液的多糖抗氧化活性检测试剂比色皿11作为空白对照，利用分光光度计检测各比色皿11的吸光度，根据吸光度计算对应炭角菌的抗氧化活性值。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测试剂盒，包括检测试剂和反应板，其特征在于，所述检测试剂包括炭角菌胞内多糖提取溶剂和多糖抗氧化活性检测试剂，所述反应板包括由下往上依次叠装的底层(1)、定量层(2)和研磨层(3)；
所述底层(1)上形成有若干个用于固定比色皿(11)的凹槽(12)；
所述定量层(2)上贯穿设有若干个定量杯(21)，每个定量杯(21)底部均开有滴孔(22)，所述滴孔(22)与底层(1)的比色皿(11)一一对应连通；
所述研磨层(3)内形成有研磨腔体(31)，所述研磨腔体(31)内设有研磨机构(32)，研磨腔体(31)的底部开有若干个滤孔(33)，所述滤孔(33)与定量层(2)的定量杯(21)一一对应连通。
2.根据权利要求1所述的一种炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测试剂盒，其特征在于，所述凹槽(12)的四周设有可拆卸滤纸(13)。
3.根据权利要求1所述的一种炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测试剂盒，其特征在于，所述滴孔(22)的孔径大小被配置成：允许液体呈液滴状滴落。
4.根据权利要求1所述的一种炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测试剂盒，其特征在于，所述定量层(2)以及定量杯(21)采用透明材质制成，定量层(2)与定量杯(21)为一体式结构。
5.根据权利要求1所述的一种炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测试剂盒，其特征在于，所述定量层(2)表面覆盖有一层吸水纸(23)，所述吸水纸(23)上开有用于定量杯(21)穿过的孔洞。
6.根据权利要求1所述的一种炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测试剂盒，其特征在于，所述定量层(2)上设有可拆卸盖体(24)。
7.根据权利要求1所述的一种炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测试剂盒，其特征在于，所述研磨层(3)由若干独立板块组成，每个独立板块内均形成有一个研磨腔体(31)。
8.根据权利要求1所述的一种炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测试剂盒，其特征在于，所述研磨机构(32)包括转轴(321)、横杆(322)、微型电机(323)、以及若干转动研磨片(324)和固定研磨片(325)，所述转轴(321)活动设于研磨腔体(31)内部，所述转动研磨片(324)间隔分布在转轴(321)上，所述微型电机(323)设于研磨层(3)外侧边且与转轴(321)端部连接，所述横杆(322)与转轴(321)平行设置，所述固定研磨片(325)间隔分布在横杆(322)上，且固定研磨片(325)与转动研磨片(324)一一对应接触。
9.根据权利要求8所述的一种炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测试剂盒，其特征在于，所述横杆(322)有两根，两根横杆(322)分列在转轴(321)的上、下方，且横杆(322)的两端均通过弹簧件(326)与研磨腔体(31)内壁柔性连接，所述固定研磨片(325)呈半圆环形，且两根横杆(322)上位置对应的两个固定研磨片(325)构成圆环形后与同一转动研磨片(324)接触，所述转动研磨片(324)呈圆形，转动研磨片(324)用于与固定研磨片(325)接触的侧面上形成有凸起(327)，所述凸起(327)呈圆心角小于180°的扇形，且凸起(327)的其中一半径边缘的厚度为突变式变为零，另一半径边缘的厚度为渐变式变为零。
10.一种利用权利要求1-9任一项所述试剂盒进行炭角菌胞内多糖体外抗氧化活性检测方法，其特征在于，步骤包括：
步骤一、将炭角菌剪碎后加入到研磨层(3)的研磨腔体(31)内，启动研磨机构(32)进行研磨，研磨一段时间后，往研磨腔体(31)内加入炭角菌胞内多糖提取溶剂，继续研磨得到浸提液，浸提液经滤孔(33)流至定量层(2)的定量杯(21)内；
步骤二、待定量杯(21)内的浸提液全部装满时，将研磨层(3)卸除，静置，浸提液逐滴滴落至底层(1)的比色皿(11)中；
步骤三、待定量杯(21)中浸提液完全滴落时，将定量层(2)卸除，往比色皿(11)中加入多糖抗氧化活性检测试剂，同时以未添加浸提液的多糖抗氧化活性检测试剂比色皿(11)作为空白对照，利用分光光度计检测各比色皿(11)的吸光度，根据吸光度计算对应炭角菌的抗氧化活性值。
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