CN113772658A - 一种富勒醇抗辐射防护剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富勒醇抗辐射防护剂，涉及辐射防护技术领域。本发明富勒醇抗辐射防护剂包括富勒醇C₆₀(OH)n，n＝25～40，还包括辅料海藻酸钠、苯甲酸钠和山梨醇。本发明并利用人包皮成纤维细胞(HFF‑1)和人永生化角质形成细胞(HacaT)为对象，研究X‑ray辐照下本发明富勒醇对细胞的保护作用及机理；结果表明本发明的富勒醇及富勒醇抗辐射防护剂可以保护细胞中SOD、CAT抗氧化酶的活性，提高GSH含量，从而减缓氧化应激反应，降低辐照对DNA的损伤，降低细胞凋亡比率。

Description

一种富勒醇抗辐射防护剂

技术领域

本发明涉及辐射防护技术领域，更具体的说是涉及一种富勒醇抗辐射防护剂。

背景技术

放射治疗是利用一种或多种电离辐射对恶性肿瘤及一些良性病进行治疗的手段。在造福病患的同时，也会因为电离辐射导致放射性皮肤损伤，例如引起皮肤发生红斑、色素沉着、干性脱皮、湿性脱皮、溃疡、坏死及皮肤萎缩等反应，亦称为放射性皮炎(X,γ,β等射线辐照后对局部皮肤组织发生损伤的反应)。放射性皮炎可严重影响患者的生存质量，且长期不愈或反复发作，进而引发全身感染，危害患者生命，同时延误治疗进程，并影响治疗效果。

因此，提供一种抗辐射防护剂减轻电离辐射对皮肤的损伤是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种富勒醇及富勒醇抗辐射防护剂，在X-ray辐照前使用，可以保护细胞中SOD、CAT抗氧化酶的活性，提高GSH含量，从而减缓氧化应激反应，降低辐照对DNA的损伤，降低细胞凋亡比率。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种富勒醇，含有25～40个羟基，由以下方法制备而成：

(1)将500mg富勒烯C₆₀溶解在300ml甲苯溶液中，备用；

(2)往富勒烯C₆₀的甲苯溶液中加入10ml 30％氢氧化钠溶液和5ml 25％TBAH水溶液，搅拌均匀后，再加入70ml 30％双氧水，40℃下搅拌反应4h，此时甲苯相由紫色变为无色，水相呈黄色至棕色；

(3)利用分液漏斗去除甲苯相，保留水相；

(4)将水相转移至3000分子量的透析袋中，透析除去水相中的小分子NaOH、TBAH、H₂O₂，至透析袋外纯水电导率10μS/cm，透析完全；

(5)取出透析袋中的水溶液，旋蒸除去溶剂水；再加入5ml蒸馏水溶解，再加入到50ml乙醇中，有大量固体析出，过滤得到土黄色固体，加入乙醇洗涤3次，烘干，即得富勒醇[C₆₀(OH)_n，n＝25～40]。

本发明的另一目的是，提供一种富勒醇抗辐射防护剂，包括上述富勒醇C₆₀(OH)_n，n＝25～40。

优选的，所述富勒醇C₆₀(OH)_n在抗辐射防护剂中的浓度为0.5～2mg/100mL。

更优选的，所述富勒醇C₆₀(OH)_n在抗辐射防护剂中的浓度为1mg/100mL。

优选的，每100mL富勒醇抗辐射防护剂中还包括辅料：200mg海藻酸钠、500mg苯甲酸钠和1500mg山梨醇，以纯化水补足。

本发明的再一目的是，提供上述富勒醇抗辐射防护剂的制备方法，包括以下步骤：按照上述配比将所述富勒醇、海藻酸钠、苯甲酸钠和山梨醇溶解于纯化水中，搅拌均匀。

本发明的又一目的是，提供上述富勒醇或上述富勒醇抗辐射防护剂在制备抗辐射药物中的应用

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种富勒醇及富勒醇抗辐射防护剂，并利用人包皮成纤维细胞(HFF-1)和人永生化角质形成细胞(HacaT)为对象，研究X-ray辐照下本发明富勒醇对细胞的保护作用及机理；结果表明本发明的富勒醇及富勒醇抗辐射防护剂可以保护细胞中SOD、CAT抗氧化酶的活性，提高GSH含量，从而减缓氧化应激反应，降低辐照对DNA的损伤，降低细胞凋亡比率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明富勒醇[C₆₀(OH)_n，n＝25～40]的透射电子显微镜TEM图片；

图2附图为X射线辐照诱导细胞损伤模型的结果，其中A为HFF-1细胞，B为HacaT细胞；

图3附图为不同浓度富勒醇抗辐射防护剂对HFF-1和HacaT细胞活力的影响，其中A、C为HFF-1细胞，B、D为HacaT细胞；

图4附图为富勒醇抗辐射防护剂干预X射线辐照诱导下HacaT细胞损伤试验；

图5附图为富勒醇抗辐射防护剂干预X射线辐照诱导下HFF-1细胞损伤试验；

图6附图为富勒醇抗辐射防护剂(较低浓度)干预X射线辐照诱导下HacaT细胞损伤试验；

图7附图为富勒醇抗辐射防护剂干预X射线辐照诱导对HacaT细胞中MDA含量的影响；

图8附图为富勒醇抗辐射防护剂干预X射线辐照诱导对HacaT细胞中SOD含量的影响；

图9附图为富勒醇抗辐射防护剂干预X射线辐照诱导对HacaT细胞中CAT含量的影响；

图10附图为富勒醇抗辐射防护剂干预X射线辐照诱导对HacaT细胞中GSH含量的影响；

图11附图为富勒醇抗辐射防护剂干预X射线辐照诱导对HacaT细胞中活性氧(ROS)含量的影响；

图12附图为富勒醇抗辐射防护剂干预X射线辐照诱导对HacaT细胞中8-OHdG含量的影响；

图13附图为富勒醇抗辐射防护剂干预X射线辐照诱导HacaT细胞Hoechst33258染色图片；

图14附图为富勒醇抗辐射防护剂干预X射线辐照诱导HacaT细胞凋亡细胞比例统计图；

图15附图为富勒醇抗辐射防护剂干预X射线辐照诱导HacaT细胞凋亡相关蛋白印记条带图片；

图16附图为富勒醇抗辐射防护剂干预X射线辐照诱导HacaT细胞凋亡相关蛋白印迹条带相对灰度值；

注：以上附图中涉及的blank为非辐照组，control为富勒醇阴性对照组(辐照组)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种富勒醇抗辐射防护剂，所用到的材料和试剂均为市售可得，例如人包皮成纤维细胞(HFF-1)和人永生化角质形成细胞(HacaT)来自厦门大学公共卫生学院；DMEM/F-12培养基购自Sigma-Aldrich(美国)；胎牛血清购自Gibico(美国)；生化检测试剂盒购自南京建成生物有限公司(中国)。试验所用到的方法，如无特别提及，均为常规方法，在此不再一一赘述。

本发明数据处理利用SPSS25.0软件对数据进行统计学分析，利用GraphPad Prism7和CorelDRAW等软件进行图表绘制。计量资料数据以3次重复实验数值表示为均数±标准误；两组间比较用t检验，显著差异用*或#表示；多组间比较用单因素方差分析(ANOVA)，不同组间显著差异用不同字母表示。P<0.05表示差异具有统计学意义。

实施例1

富勒醇[C₆₀(OH)_n，n＝[25～40]的制备方法：

(1)将500mg富勒烯C₆₀溶解在300ml甲苯溶液中，备用；

(2)往富勒烯C₆₀的甲苯溶液中加入10ml30％氢氧化钠溶液和5ml 25％TBAH水溶液，搅拌均匀后，再加入70ml 30％双氧水，40℃下搅拌反应4h，此时甲苯相由紫色变为无色，水相呈黄色至棕色；

(3)利用分液漏斗去除甲苯相，保留水相；

(4)将水相转移至3000分子量的透析袋中，透析除去水相中的小分子NaOH、TBAH、H₂O₂，至透析袋外纯水电导率10μS/cm，透析完全；

(5)取出透析袋中的水溶液，旋蒸除去溶剂水；再加入5ml蒸馏水溶解，再加入到50ml乙醇中，有大量固体析出，过滤得到土黄色固体，加入乙醇洗涤3次，烘干，即得富勒醇[C₆₀(OH)_n，n＝25～40]。

实施例2

富勒醇[C₆₀(OH)_n，n＝25～40]表征：

将实施例1所得富勒醇用纯化水稀释成1mg/mL，滴于铜网上，自然干燥过夜，于透射电子显微镜(TEM,Hitachi HT-7800)观察并进行拍照，参见附图1。

将富勒醇用DMEM/F-12培养基稀释到0.5mg/ml于Zetasize马尔文激光粒度仪测定水合粒径及zeta电势，结果见表1。

表1富勒醇水合粒径和Zeta电势

实施例3

富勒醇抗辐射防护剂的制备：

3.1将1mg实施例1所得富勒醇[C₆₀(OH)_n，n＝25～40]溶于80ml纯化水中，再加入200mg海藻酸钠、500mg苯甲酸钠和1500mg山梨醇，以纯化水补足至100ml，搅拌均匀得富勒醇抗辐射防护剂。

3.2将0.5mg实施例1所得富勒醇[C₆₀(OH)_n，n＝25～40]溶于80ml纯化水中，再加入200mg海藻酸钠、500mg苯甲酸钠和1500mg山梨醇，以纯化水补足至100ml，搅拌均匀得富勒醇抗辐射防护剂。

3.3将2mg实施例1所得富勒醇[C₆₀(OH)_n，n＝25～40]溶于80ml纯化水中，再加入200mg海藻酸钠、500mg苯甲酸钠和1500mg山梨醇，以纯化水补足至100ml，搅拌均匀得富勒醇抗辐射防护剂。

实施例4

富勒醇抗辐射防护剂(实施例3.1所得富勒醇抗辐射防护剂)效果研究：

(1)细胞培养：人包皮成纤维细胞(HFF-1)和人永生化角质形成细胞(HacaT)培养条件按本课题组常规细胞培养，并进一步优化(人包皮成纤维细胞(HFF-1)和人永生化角质形成细胞(HacaT)在含有10％FBS的DMEM/F-12培养基于37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养)。

(2)建立X射线辐照诱导细胞损伤模型：

将HacaT细胞以1*10^{^4}个/孔铺于96孔板，培养22h；将HFF-1细胞以5*10^{^3}个/孔铺板，培养24h。然后用X射线生物学辐照仪RS2000以9.445Gy/min剂量率分别进行辐照。辐照剂量分别设置为0、25、50、100、200Gy。对于两种细胞而言，当辐照剂量达到50Gy时，两种细胞活力均显著下降，参见附图2，此时X射线辐照诱导细胞损伤的模型建立成功，因此确定建立细胞损伤模型的辐照剂量为50Gy。

(3)确定富勒醇抗辐射防护剂对细胞的安全浓度

将HacaT细胞以1*10^4个/孔铺于96孔板，培养22h；将HFF-1细胞以5*10^{^3}个/孔铺板，培养24h。随后以不同浓度的富勒醇抗辐射防护剂分别处理两种细胞(浓度以活性成分富勒醇计分别为12.5、25、50、100、200、1000、10000mg/L，浓度的表述方式延续至本文末)，培养20h后加入5mg/mL的MTT，继续培养4h之后，加入150微升的DMSO溶解。摇床上摇晃5min之后，用酶标仪检测490nm的吸光值。

不同浓度富勒醇抗辐射防护剂对HFF-1和HacaT细胞活力的影响，参见附图3。结果显示，对于HFF-1和HacaT细胞而言，C₆₀(OH)_n在200mg/L以内显示无细胞毒性，浓度达到1000mg/L，显示有细胞毒性。

(4)富勒醇抗辐射防护剂干预X射线辐照诱导下细胞损伤试验

将HacaT细胞以1*10^{^4}个/孔铺于96孔板，培养22h；X射线辐照前给予富勒醇抗辐射防护剂干预(分别为富勒醇阴性对照组(辐照组)，辐照前6h富勒醇12.5mg/L组、25mg/L组和50mg/L组，辐照前2h富勒醇12.5mg/L组、25mg/L组和50mg/L组，以及X射线空白组)，用X射线生物学辐照仪RS2000以9.445Gy/min剂量率进行辐照，最终辐照剂量为50Gy。辐照结束之后，富勒醇继续与细胞共孵育24h，参见附图4。

HFF-1细胞以5*10^{^3}个/孔铺板，培养24h，富勒醇抗辐射防护剂干预步骤同HacaT细胞，参见附图5。

本发明同时考察了低浓度富勒醇抗辐射防护剂干预X射线辐照诱导细胞损伤的情况，富勒醇的浓度设置为0.39mg/L组、0.78mg/L组、1.56mg/L组、3.13mg/L组、6.25mg/L组，于辐照前2h进行干预，其他步骤同上，结果参见附图6。

富勒醇抗辐射防护剂干预X射线辐照诱导下细胞损伤试验结果表明，对于HacaT细胞，辐照50Gy下，辐照前2h加入6.25、12.5mg/L C₆₀(OH)_n，表现出具有抗辐射能力；辐照前6h加入12.5、25mg/L C₆₀(OH)_n，表现出一定的抗辐射能力；相比较而言，辐照前2h加入C₆₀(OH)_n抗辐射能力更加明显。对于HFF-1细胞，辐照50Gy下，辐照前2h加入12.5mg/L C₆₀(OH)_n，表现出具有抗辐射能力；辐照前6h加入12.5、25、50mg/L C₆₀(OH)_n，具有一定的抗辐射能力，但变化不显著。因此，对于两种细胞而言，辐照前2h加入12.5mg/L C₆₀(OH)_n均表现出具有抗辐射能力。

(5)富勒醇抗辐射防护剂干预X射线辐照诱导对人永生化角质形成细胞中MDA、SOD、CAT、GSH含量的影响

以辐照剂量50Gy X射线辐照HacaT细胞，于辐照前2h分别加入富勒醇浓度12.5mg/L和25mg/L的富勒醇抗辐射防护剂干预，辐照后富勒醇继续与细胞共孵育24h，HacaT细胞中MDA含量变化参见附图7，SOD含量变化参见附图8，CAT含量变化参见附图9，GSH含量变化参见附图10。

附图7结果显示，仅富勒醇阴性对照组(辐照组)的MDA显著上升，在辐照前2h加入富勒醇浓度12.5、25mg/L的富勒醇抗辐射防护剂后，MDA含量下降。说明辐照前2h加入富勒醇抗辐射防护剂可以减少MDA的产生，从而减缓氧化应激的发生。

附图8-附图10结果显示，仅富勒醇阴性对照组(辐照组)的SOD、CAT和GSH显著下降，在辐照前2h加入富勒醇浓度12.5、25mg/L的富勒醇抗辐射防护剂后，SOD、CAT和GSH含量上升。说明辐照前2h加入的富勒醇抗辐射防护剂，能够保护SOD和CAT抗氧化酶，且提高GSH含量，从而减缓氧化应激的发生。

(6)富勒醇抗辐射防护剂干预X射线辐照诱导对人永生化角质形成细胞中活性氧(ROS)含量的影响

依据南京建成活性氧(ROS)检测试剂盒方法，在对HacaT细胞辐照前2h加入富勒醇浓度12.5mg/L、25mg/L的富勒醇抗辐射防护剂，X射线50Gy辐照后培养24h，5μM DCFH-DA染色30min，PBS清洗两次后，于倒置荧光显微镜Olympus IX51观察拍照。N＝3，在100X倍镜下每个挑六个视野进行统计，统计荧光强度，参见附图11。

结果显示，在50GyX射线辐照下，仅富勒醇阴性对照组(辐照组)的ROS明显上升，在辐照前2h加入富勒醇抗辐射防护剂后，ROS明显下降。

(7)富勒醇抗辐射防护剂干预X射线辐照诱导对人永生化角质形成细胞中8-OHdG含量的影响

8-OHdG是DNA损伤的分子标志物，测量细胞中8-OHdG的含量可以推测细胞DNA的损伤程度。在对HacaT细胞辐照前2h加入富勒醇浓度12.5mg/L、25mg/L的富勒醇抗辐射防护剂，X射线50Gy辐照后培养24h，依据莼试8-OHdG ELISA试剂盒方法检测8-OHdG含量，参见附图12。

结果显示，在50GyX射线辐照下，仅富勒醇阴性对照组(辐照组)的8-OHdG明显上升，在辐照前2h加入浓度12.5、25mg/L的富勒醇抗辐射防护剂后，8-OHdG明显下降。以上结果说明辐照前2h加入富勒醇抗辐射防护剂，可以降低DNA损伤，从而增强富勒醇药物的抗辐射能力。

(8)富勒醇抗辐射防护剂干预X射线辐照诱导皮肤细胞凋亡通路蛋白表达影响

①Hoechst33258染色：Hoechst33258常用于细胞凋亡的检测，细胞发生凋亡时，细胞核呈蓝色致密浓染或者呈碎块状浓染。依据索莱宝Hoechst33258检测试剂盒方法，在对HacaT细胞辐照前2h加入富勒醇浓度12.5mg/L、25mg/L的富勒醇抗辐射防护剂，X射线50Gy辐照后培养24h后，用10μg/mL Hoechst33258染色40min，PBS清洗三次后，于倒置荧光显微镜Olympus IX51观察拍照。N＝3，在200X倍镜下每个挑六个视野进行统计，统计凋亡细胞所占的比例。

染色结果参见附图13，凋亡细胞比例结果参见附图14。在50Gy下，仅富勒醇阴性对照组(辐照组)细胞凋亡明显发生，在辐照前2h加入富勒醇浓度12.5、25mg/L的富勒醇抗辐射防护剂后，细胞凋亡率有所下降。表明辐照前2h加入富勒醇抗辐射防护剂，可以减少细胞的凋亡。

②Westernblot试验

收集X射线50Gy辐照后培养24h的HacaT细胞，按照实验室常规的方法制成蛋白样本，经过上样、电泳、电转、封闭、孵育一抗BAX(Abclonal,稀释比为1：1000)、Bcl2(Abclonal,稀释比为1：1000)、c-caspase3(Abcam,稀释比为1：1000)和二抗等步骤，获得凋亡相关蛋白的条带，内参为β-actin(Abcam,稀释比为1：4000)，利用Image J进行灰度分析。

富勒醇抗辐射防护剂干预X射线辐照诱导HacaT细胞凋亡相关蛋白印记条带参见附图15，蛋白印迹条带相对灰度值参见附图16。在X射线50Gy下，仅富勒醇阴性对照组(辐照组)的BAX蛋白表达上升，但没有显著变化。在辐照前2h加入富勒醇浓度12.5、25mg/L的富勒醇抗辐射防护剂后，Bcl2蛋白表达明显上升。以上结果说明辐照前2h加入富勒醇抗辐射防护剂，可以上调Bcl2蛋白表达，从而增强富勒醇抵抗辐射诱导细胞凋亡的能力。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种富勒醇，其特征在于，含有25～40个羟基。

2.一种富勒醇抗辐射防护剂，其特征在于，包括权利要求1所述富勒醇C₆₀(OH)_n，n＝25～40。

3.根据权利要求2所述的富勒醇抗辐射防护剂，其特征在于，所述富勒醇C₆₀(OH)_n在抗辐射防护剂中的浓度为0.5～2mg/100mL。

4.根据权利要求3所述的富勒醇抗辐射防护剂，其特征在于，所述富勒醇C₆₀(OH)_n在抗辐射防护剂中的浓度为1mg/100mL。

5.根据权利要求2至4任一所述的富勒醇抗辐射防护剂，其特征在于，每100mL富勒醇抗辐射防护剂中还包括辅料：200mg海藻酸钠、500mg苯甲酸钠和1500mg山梨醇，以纯化水补足。

6.一种富勒醇抗辐射防护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：按照权利要求5的配比将所述富勒醇、海藻酸钠、苯甲酸钠和山梨醇溶解于纯化水中，搅拌均匀。

7.权利要求1所述富勒醇或权利要2-5任一所述富勒醇抗辐射防护剂在制备抗辐射药物中的应用。

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