CN111110635A - 一种包含富勒醇纳米颗粒的药物组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种药物组合物，包括式(1)所示的富勒醇纳米颗粒以及抗CD47单克隆抗体。本发明还提供了所述药物组合物以及式(1)所示的富勒醇纳米颗粒用于制备抗肿瘤药物的用途。本发明提供的药物组合物以及富勒醇纳米颗粒能够显著增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力，非常适合用于制备抗肿瘤药物，而且，药物用量小，毒性低，用药安全性能够得到保障，极其具有临床应用价值。[C_2m(OH)_x]_n式1。

Description

一种包含富勒醇纳米颗粒的药物组合物及其用途

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种包含富勒醇纳米颗粒的药物组合物以及其用途。

背景技术

癌症治疗的传统策略是专注于对肿瘤细胞的直接杀伤，近些年来，免疫疗法在肿瘤治疗领域越来越受到重视。肿瘤免疫治疗的核心在于激活免疫系统，恢复或增强免疫细胞对肿瘤细胞的免疫反应。根据免疫系统的类型可以分为先天性免疫和获得性免疫，其中，巨噬细胞介导的程序性细胞清除(Macrophage mediated Programed Cell Removal,PrCR)作为一种先天性免疫反应，是机体清除受损伤或疾病细胞的一种重要方式，促进机体的免疫巡查和免疫监督。

然而，肿瘤细胞也可表达很强的拒吞噬信号分子CD47从而逃脱巨噬细胞的“追捕”。与此同时，肿瘤细胞表面也存在促吞噬信号分子：钙网蛋白(calreticulin，CRT)。因此，增强促吞噬信号和降低拒吞噬信号，打破肿瘤细胞的吞噬信号平衡成为重要的治疗策略。研究发现，当细胞发生免疫原性细胞死亡时，会诱导CRT的暴露，目前已知的能够诱导免疫原性细胞死亡的药物主要为蒽环类或蒽醌类化疗药物，如阿霉素、伊达比星、米托蒽醌等，它们能够诱导CRT的暴露，促进ATP和高迁移率族蛋白1向胞外的释放，激活巨噬细胞对细胞的吞噬。但是，这些化疗药物存在毒副作用大、容易引起耐药性等缺陷，一直以来受到人们的诟病。因此，需要寻找一种新型的安全有效的药物来代替传统的蒽环类或蒽醌类化疗药物，增加细胞表面CRT的暴露，激活巨噬细胞的免疫吞噬。

富勒醇纳米颗粒是一种典型的碳纳米材料，由碳原子构成纳米碳笼，其表面存在许多羟基基团，富勒醇纳米颗粒具有很好的生物亲和性，同时，由于羟基基团的存在，毒性大大降低，生物相容性和安全性已得到了研究人员的广泛认可，而且还具有合成方法简单、制备效率高、合成成本低等优点，因此，基于富勒醇纳米颗粒的优势，扩大其应用范围和领域具有非常重要的研究价值。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种药物组合物，其具有加强巨噬细胞免疫吞噬的作用，可用于制备抗肿瘤药物。

本发明的另一目的是提供所述药物组合物的用途。

本发明的另一目的是提供富勒醇纳米颗粒的用途。

本发明提供的药物组合物，包括式(1)所示的富勒醇纳米颗粒以及抗CD47单克隆抗体(克隆号：B6H12)，

[C_2m(OH)_x]_n 式1

式(1)中，m表示25～45的整数，x表示10～40的整数，n表示1～200的整数。

本发明的发明人发现，富勒醇纳米颗粒能够诱导肿瘤细胞表面CRT的暴露，促进巨噬细胞介导的免疫吞噬，从而达到肿瘤治疗的目的，尤其是与抗CD47单克隆抗体联合使用，效果更加显著。

式(1)中，n表示团聚形成纳米颗粒的富勒醇分子数，用于本发明的富勒醇的分子粒径约为0.8～1nm，可通过分子相互作用团聚成纳米颗粒物。在溶剂环境中，可以通过超声波等方法控制颗粒物的尺寸，形成团聚分子数(n值)为1～200的纳米颗粒，其粒径分布范围在0.8～200nm。

本发明提供的药物组合物中，n优选可以表示1～20的整数。

本发明提供的药物组合物中，富勒醇纳米颗粒的粒径优选可以为0.8～20nm。

本发明提供的药物组合物中，所述富勒醇纳米颗粒与抗CD47单克隆抗体的用量比可于任意范围内调节，优选的质量比可以为1﹕0.1～10；更优选可以为1﹕0.5～3；最优选可以为1﹕1。

本发明提供的药物组合物可按药剂领域中的现有方法制备成各种剂型，并可通过多种途径给予或施用，取决于是否需要局部或全身治疗和所治疗的区域。例如，可局部(如，透皮、皮肤、眼和粘膜包括鼻内、阴道和直肠)给药、肺(如，通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括通过喷雾器；气管内、鼻内)给药、口服或肠胃外给药(如，静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注)、颅内(如，鞘内或脑室内)给药等。

本发明提供的药物组合物包括但不限于以下剂型：片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气雾剂(固体或溶于液体溶媒)、软膏剂、软和硬明胶胶囊、栓剂、注射剂、冻干剂等。

本发明提供的药物组合物优选为液体剂型，如注射剂、悬浮剂等。在溶剂环境中，可以通过溶剂选择、浓度控制、超声波等方法调整纳米颗粒的粒径。当本发明的药物组合物为液体剂型时，其中的富勒醇纳米颗粒的浓度优选可以为1～10mg/mL，液体剂型的溶剂包括但不限于水、生理盐水、葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液等。

本发明提供的药物组合物中，还可以包含除活性成分外的药学上可接受的载体，包括但不限于赋形剂、粘合剂、润滑剂、填充剂、崩解剂、乳化剂、稳定剂、着色剂、矫味剂、防腐剂、吸收促进剂等。药学上可接受的载体还可以包括载药系统，以实现药物的缓释或控释。

本发明提供的药物组合物中，载药系统可以为常见的纳米载药系统，优选可以为敏感性纳米脂质体，例如，pH值敏感性脂质体、氧化还原敏感性脂质体、辐射敏感性脂质体、光热敏感性脂质体等，最优选为肿瘤敏感性脂质体，即对肿瘤部位具有敏感性的脂质体。通过纳米载药系统，可增加药物在肿瘤部位的靶向作用，促进药物在肿瘤部位的富集，实现肿瘤区域免疫系统的局部活化，进一步增强肿瘤治疗效果。

本发明提供的药物组合物可单独施用，亦可和其他免疫制剂、药物等联合使用。

本发明还提供了以上技术方案任一项所述的药物组合物用于制备抗肿瘤药物的用途。

本发明还提供了式(1)所示的富勒醇纳米颗粒用于制备抗肿瘤药物的用途，

[C_2m(OH)_x]_n 式1

式(1)中，m表示25～45的整数，x表示10～40的整数，n表示1～200的整数。

本发明提供的富勒醇纳米颗粒用途中，n优选可以表示1～20的整数。

本发明提供的富勒醇纳米颗粒用途中，纳米颗粒的粒径分布范围在0.8～200nm，优选可以为0.8～20nm。

本发明所述的药物组合物或富勒醇纳米颗粒可用于制备抗肿瘤药物，可包括所有的实体瘤及非实体瘤，包括但不限于肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、胃癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、中枢神经中枢系统赘疣、脊柱轴肿瘤、垂体腺瘤、胃肠道间质瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肥大细胞增多症、胶质瘤、肉瘤、淋巴瘤、血管肉瘤等。

本发明所述的抗肿瘤药物可以为肿瘤治疗药物，其中，“肿瘤治疗”不仅包括中止疾病或症状，还包括缓解、减轻、改善、抑制、控制、预防疾病或症状。

本发明提供的药物组合物以及富勒醇纳米颗粒能够增强CRT在细胞表面的暴露，因此能够明显增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力，尤其是富勒醇纳米颗粒与抗CD47单克隆抗体联合用药时，吞噬能力有着更加显著的提升，非常适合用于制备抗肿瘤药物。而且，用药后不会产生明显的体重变化，相对于传统的蒽环类或蒽醌类化疗药物，药物用量小，毒性低，用药安全性能够得到保障，极其具有临床应用价值。

附图说明

图1为实验例1的富勒醇纳米颗粒的AFM的图像和粒径分布图表。

图2为实验例1的富勒醇纳米颗粒水合粒径分布图表和Zeta电势图表。

图3为实验例2的肿瘤球的形貌图像及尺寸结果图表。

图4为实验例2的肿瘤球的照片及成球率结果图表。

图5为实验例3所得的荧光显微细胞图像及细胞表面CRT暴露量结果图表。

图6为实验例3所得的细胞凋亡率结果图表。

图7为实验例4所得的电泳图及CRT整体表达量结果图表。

图8为实验例5所得的荧光显微细胞图像及CRT和PDI的共定位结果图表。

图9为实验例6所得的ICP-OES分析结果图表。

图10为实验例7所得的Fluo-4-AM检测结果图表。

图11为实验例8所得的同步辐射XRF图像。

图12为实验例9、10所得的巨噬细胞体外、体内的吞噬结果图表。

图13为实验例11所得的荷瘤小鼠的体重变化结果图表和肿瘤体积变化图表。

图14为实验例12所得的CD80和CD163的免疫组化分析结果图。

具体实施方式

下面通过制备例和实验例对本发明进行详细说明，以使本发明的特征和优点更清楚。但应该指出，制备例和实验例用于理解本发明的构思，本发明的范围并不仅仅局限于本文中所列出的制备例和实验例。

下述制备例和实验例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

制备例富勒醇纳米颗粒的制备

按照TBAH催化碱法的方法制备富勒醇，制备产物按照中国发明专利ZL03146028.3的方法进行分离纯化。

具体来说，使用NaOH法，在TBAH催化下，在甲苯溶液中将C₆₀与NaOH溶液进行反应，再经过滤、离子交换层析等分离、纯化过程，除去NaOH后，得到纯度大于99.99％的产物，冷冻干燥保存。

将制得的富勒醇溶解在生理盐水中，超声处理，形成颗粒物溶液。

用于实验例的富勒醇纳米颗粒为C₆₀(OH)₂₂。

实验例1富勒醇的表征

利用高分辨原子力显微镜(AFM)、动态光散射(DLS)和Zeta电势仪(Zeta-potential)对富勒醇纳米颗粒进行表征。

由图1可以看出，富勒醇纳米颗粒的粒径为1.89±0.44nm，且具有很好的分散性。

由图2的左图可以看出，DLS结果显示富勒醇纳米颗粒在PBS溶液(浓度为100μg/ml)中的水合粒径大约为22.93nm。

由图2的右图可以看出，Zeta电势测试结果显示，富勒醇纳米颗粒在含有10％血清的1640培养基中储存20天，依然保持了很好的分散性。

实验例2三维细胞球培养

在超低粘附6孔板中接入10⁴个人乳腺癌MCF-7细胞，加入含富勒醇纳米颗粒的完全培养基，低速旋转，7天后检测成球率和成球尺寸。

由图3可以看出，在12.5μg/ml、25μg/ml及50μg/ml的浓度下，培养基中加入富勒醇纳米颗粒后，对于三维培养的肿瘤球的形貌、尺寸没有明显影响。

由图4可以看出，在12.5μg/ml、25μg/ml及50μg/ml的浓度下，培养基中加入富勒醇纳米颗粒后，对于三维培养的肿瘤球的成球率没有明显影响。

实验例3 CRT暴露量检测

100g、3分钟离心收集按实验例2方法培养的对照组和处理组(加入50μg/ml的富勒醇纳米颗粒)肿瘤球，用预冷的PBS洗涤三次后，消化成单细胞，加入CRT一抗，4℃孵育1个小时。200g、3分钟离心收集细胞，用预冷的4％多聚甲醛4℃固定细胞10分钟后，PBS洗涤。加入稀释了100倍的荧光二抗室温条件下染色30分钟，PBS洗涤三次后，用confocal荧光显微镜和流式细胞仪分析细胞表面CRT的暴露量。

由图5可以看出，处理组的CRT暴露量明显多于对照组，说明富勒醇可诱导人乳腺癌MCF-7细胞表面的CRT暴露。

CRT的暴露与免疫原性细胞死亡有着密切的关系。进行细胞凋亡检测实验，由图6可以看出，处理组的早期细胞凋亡率和总细胞凋亡率都明显高于对照组，说明富勒醇能够诱导三维细胞的细胞凋亡。

实验例4 CRT表达量检测

按实验例2方法培养并收集肿瘤球，用SDS细胞裂解液充分裂解细胞，提取总蛋白。加入溴酚蓝电泳缓冲液，100℃加热5分钟。将制备好的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，经转膜、封闭、一抗孵育过夜、二抗孵育1小时后，进行wester blot的曝光，检测肿瘤球中总CRT含量的变化。

由图7可以看出，对照组和不同浓度富勒醇处理的处理组之间没有明显变化，说明富勒醇对CRT整体表达量无明显影响。

实验例5细胞表面CRT来源分析

按实验例2方法培养并收集肿瘤球，用胰酶消化成单细胞。用4％的多聚甲醛固定，经过打孔、封闭、一抗(CRT和PDI)孵育过夜和二抗孵育1小时后，用Hochest33342复染细胞核，进行confocal荧光显微镜成像，利用共定位分析CRT和PDI的共定位效率。

由图8可以看出，富勒醇处理的处理组减少了CRT与内质网的共定位。

实验例6测定细胞球内钙离子含量变化

100g、3分钟离心收集按实验例2方法培养的对照组和不同浓度处理组的肿瘤球，用预冷的PBS洗涤三次后，冻干样品，用于ICP-OES分析。

由图9可以看出，富勒醇可显著降低三维球细胞中的钙含量，且呈剂量依赖性。

实验例7钙离子探针分析细胞内钙含量变化

100g、3分钟离心收集按实验例2方法培养的对照组和处理组的肿瘤球，用预冷的PBS洗涤三次后，用胰酶将肿瘤球消化成单细胞，用无钙的细胞外液重悬，接种在confocal小皿中，加入Fluo 4-AM染料，孵育20分钟后，用confocal荧光显微镜进行拍照，分析细胞内的荧光变化。

由图10可以看出，富勒醇可显著降低三维球细胞中的钙含量。

实验例8同步辐射XRF成像分析单细胞钙含量变化

将实验例7的细胞样品置于Mylar膜上，培养2h进行初步贴壁，用PBS清洗之后，放入异戊烷中，置于液氮中速冻，取出后-35℃冷冻干燥。样品在上海光源硬x射线成像站(BL15U1)进行XRF mapping成像。

由图11可以看出，处理组细胞中钙离子明显减少，与Fluo 4-AM检测以及ICP-OES分析的结果一致。

实验例9体外吞噬实验

从8-10周龄的BalB/c雌性小鼠腹腔中提取原代单核细胞，体外培养72小时，收集巨噬细胞。将肿瘤细胞用CFSE进行活细胞标记。将巨噬细胞和标记了的肿瘤细胞在超低粘附96孔板中共培养4h(分为四组：10μg IgG、100μg/mL富勒醇+10μg IgG、10μg抗CD47单克隆抗体以及100μg/mL富勒醇+10μg抗CD47单克隆抗体)，收集样品，用F4/80-APC抗体室温标记15分钟，上流式细胞仪，分析吞噬率。

吞噬率＝F4/80⁺CFSE⁺/(F4/80⁺CFSE⁺+F4/80⁺CFSE)×100％

实验例10体内吞噬实验

将肿瘤细胞用CFSE进行活细胞标记(分组同实验例9)，注射入8-10周龄的BalB/c雌性小鼠腹腔中，30分钟后腹腔灌洗，收集细胞，用F4/80-APC抗体室温标记15分钟，上流式细胞仪，分析吞噬率。

由图12可以看出，体内和体外实验证明富勒醇可增强巨噬细胞介导的免疫吞噬，尤其是联合抗CD47单克隆抗体后，巨噬细胞介导的免疫吞噬作用最明显。

实验例11肿瘤抑制效果实验

将人乳腺癌MCF-7细胞接种于BalB/c裸鼠右前肢，待肿瘤生长到80-100mm³后，将荷瘤小鼠分成对照组(Ctrl)、富勒醇纳米颗粒处理组(fNPs)、抗体组(mAb)、富勒醇联合半剂量抗体组(fNPs+1/2mAb)和富勒醇联合全剂量抗体组(fNPs+mAb)。隔天注射200μl/20g体重的药物(富勒醇为5mg/kg体重，半剂量抗体组的抗体剂量为2.5mg/kg体重，全剂量抗体组的抗体剂量为5mg/kg体重，抗体组的抗体剂量为5mg/kg体重)或生理盐水(对照组)。

记录小鼠的体重和肿瘤生长变化情况，分别绘制体重和肿瘤增长曲线。由图13的左图可以看出，各给药组没有造成小鼠体重的明显变化。由图13的右图可以看出，富勒醇纳米颗粒和抗体单独给药都能够抑制肿瘤的生长，而将两种药物联合使用之后，抑瘤效果更明显，说明富勒醇纳米颗粒和抗体联用能够起到协同效应。

实验例12体内巨噬细胞分型分析

将实验例11的肿瘤组织切片后进行CD80和CD163的免疫组化分析，CD80是M1型巨噬细胞的标记物，CD163是M2型巨噬细胞的标记物。由图14可以看出，免疫组化分析结果显示正常肿瘤组织中CD163表达量很高，CD80表达量相对较低，而经过富勒醇纳米颗粒的处理，肿瘤组织中的CD80表达量明显增高，CD163表达量降低，说明富勒醇纳米颗粒促进了巨噬细胞从M2型向M1型的转化。

由上述实验例可知，富勒醇纳米颗粒在三维培养体系下，对三维细胞的成球率、成球尺寸、形貌都不会产生影响。富勒醇纳米颗粒对肿瘤细胞的总CRT表达量没有影响，但可诱导内质网CRT的迁移，使Ca²⁺含量明显减少，内质网CRT向细胞膜移动，促进了CRT在细胞表面的暴露，因此能够显著增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力，从而达到抑制、缓解、治疗肿瘤的目的。尤其是富勒醇纳米颗粒与抗CD47单克隆抗体联合用药时，对肿瘤细胞的吞噬能力有着更加显著的提升。而且，用药后不会产生明显的体重变化，富勒醇纳米颗粒本身也具有生物相容性好、血液毒性低等特点，相对于传统的蒽环类或蒽醌类化疗药物，用药安全性能够得到保障。

本发明所描述的实施方式仅出于示例性目的，并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可在本发明的范围内作出各种其他替换、改变和改进，因而，本发明不限于上述实施方式，而仅由权利要求限定。

Claims (10)

1.一种药物组合物，其特征在于，包括式(1)所示的富勒醇纳米颗粒以及抗CD47单克隆抗体，

[C_2m(OH)_x]_n 式1

式(1)中，m表示25～45的整数，x表示10～40的整数，n表示1～200的整数。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述n表示1～20的整数。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述富勒醇纳米颗粒的粒径为0.8～20nm。

4.根据权利要求1-3任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述富勒醇纳米颗粒与抗CD47单克隆抗体的质量比为1﹕0.1～10；优选为1﹕0.5～3。

5.根据权利要求1-4任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为液体剂型，富勒醇纳米颗粒的浓度为1～10mg/mL。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为静脉注射剂。

7.根据权利要求1-6任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述载体为纳米载药系统，优选为肿瘤敏感性脂质体。

9.权利要求1-8任一项所述的药物组合物用于制备抗肿瘤药物的用途。

10.式(1)所示的富勒醇纳米颗粒用于制备抗肿瘤药物的用途，

[C_2m(OH)_x]_n 式1

式(1)中，m表示25～45的整数，x表示10～40的整数，n表示1～200的整数。

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