CN113755645A - 一种检测罗湖病毒的荧光定量rt-pcr引物对和探针，试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测罗湖病毒的荧光定量RT‑PCR引物对和探针，试剂盒和检测方法。所述引物对序列如SEQ ID NO:1和2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示。采用本发明要保护的引物探针序列的RT‑qPCR方法灵敏度数据明确，灵敏度可达到2.5×10^‑8ng/μL，且特异性好、重复性高。

Description

一种检测罗湖病毒的荧光定量RT-PCR引物对和探针，试剂盒 和检测方法

技术领域

本发明涉及检测领域，尤其涉及一种检测罗湖病毒的荧光定量RT-PCR引物对和探针，试剂盒和检测方法。

背景技术

罗非鱼是很多发展中国家的主要食用蛋白质来源，也是许多渔民和养殖者的重要经济来源。罗非鱼养殖已成为保障全球粮食安全和满足人类营养需求的重要产业。

2009年以来，以色列、厄瓜多尔、埃及、泰国、哥伦比亚等国相继暴发养殖和野生罗非鱼大量死亡事件。直到2014年，才发现其致病病原是新型RNA病毒——罗湖病毒。罗湖病毒是2012年由美国科学家首次发现的危害罗非鱼的一种病毒，它是一种新型的RNA病毒，由10个独特的基因片段组成，直径55-75nm，目前仍未确定其分类地位，极有可能是正粘病毒科的一种新型病毒，与熟知的流感病毒同属一科。罗湖病毒在24-33℃均可以生长，最适温度25℃，所以每年的5-10月份均可能导致发病。感染罗湖病毒的病鱼常见症状为：体色发黑，体表有溃烂，眼睛有明显的病变，发病前期晶状体浑浊，后期晶状体破裂发炎，眼睛内容物浓缩，失去正常视觉功能。2018年Saengchan Senapin等，从无明显临床症状、无死亡的成年罗非鱼和鱼苗中检测出罗湖病毒，提示罗湖病毒可能像ISAV一样存在着变异株。

至今尚不清楚TiLV(罗湖病毒)的最初来源，野生或养殖的受TiLV感染的鱼群是目前已知的唯一传染源。有证据表明，病鱼的眼睛、大脑和肝脏常常含有高浓度的病毒，其肌肉组织也可能存在病毒。因此，发病死亡的罗非鱼可能是重要的病毒污染源。罗湖病毒是否会通过非罗非鱼物种和其它有机体(如食鱼鸟类和哺乳动物)携带，通过冷冻罗非鱼产品进行传播，目前尚不确定，但粮农组织指出，罗湖病毒有可能比目前已知的分布范围更广，给全球罗非鱼养殖造成严重威胁。

虽然该病原体不会引起公共卫生问题，但可以导致受感染种群大量死亡，感染的鱼因抵抗力变差感染其他病原菌，倘若人生食也有被其他病菌感染的风险。

目前，还未将TiLV列入检疫名录，也无相应的检测方法。因此，了解TiLV的流行病学和诊断技术，对预防和控制这种外来病具有重要意义。

国外已经在病毒的细胞培养、组织病理学、RT-PCR，nested RT-PCR,semi-nestedRT-PCR,SYBR quantitative RT-PCR、原位杂交等检测技术方面进行了研究，并建立了相应的检测方法。因为分子生物学方法具有快速、灵敏、简便的特点，大多数国家都采用其对TiLV进行监测和诊断，在检测和诊断时，也大多采用片段3基因，片段3编码假设蛋白。

现有检测TiLV的分子生物学方法，大多是针对假设蛋白基因片段，如JaphetteEsther Kembou Tsofack等根据基因片段3(Genebank序列号KJ605629)建立了巢氏RT-PCR方法；Dong等建立的半巢氏RT-PCR方法也是根据片段3建立的；泰国PitchapornWaiyamitra等研究人员也是根据片段3保守序列设计引物探针建立了RT-qPCR检测方法；PTattiyapong等建立的SYBR green RT-qPCR方法，也是根据片段3设计的引物探针，GenBank序列号为KX631923；国内刘助红等同样是根据基因片段3(Genebank序列号KJ605629)建立的RT-LAMP方法。“一种罗湖病毒的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及方法”“一种罗湖病毒Taq-man探针荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法”根据编码RNA聚合酶的片段1设计引物序列。“一种罗湖病毒Taq-man探针荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法”是根据TiLV-AD-2016、TiLV-4-2011、TiLV-TV1、TiLV-TV2、TiLV-TV3、TiLV-TV4、TiLV-TV5、TiLV-TV6、TiLV-TV7及其实验室分离自广东的两株TiLV等11个TiLV S1基因序列设计的引物探针；无灵敏度的数据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测罗湖病毒(TiLV)的荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)的引物和探针及其试剂盒；通过编码RNA聚合酶的片段1对罗湖病毒进行检测。

为实现上述目的，本发明提供一种检测罗湖病毒的荧光定量RT-PCR引物对和探针，其特征在于，所述引物对序列如SEQ ID NO:1和2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供一种检测罗湖病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，含有所述的引物对和探针。

进一步，还包括SEQ ID NO:4所示的DNA作为阳性对照。

本发明还提供一种检测罗湖病毒的荧光定量RT-PCR方法，其特征在于，含有如下步骤，对待测样本的DNA作为模板，进行荧光定量RT-PCR，根据结果来判断即可。

进一步，所述RT-PCR的反应体系以20μL为例，含有10μL的2×Probe RT-PCRMaster Mix；0.2μL的QN Probe RT-Mix；1μL 5μM所述引物对中的每条引物；1μL 5μM所述探针，1μL模板，余量为水。

进一步，所述RT-PCR的反应条件为，反转录45℃20min；预变性95℃5min；扩增95℃15s，60℃1min，40个循环；荧光收集设置在60℃退火延伸时进行。

进一步，还设置了阳性对照，阳性对照为所述试剂盒中SEQ ID NO:4所示的DNA。

进一步，根据结果来判断为，

阳性对照出现标准的S型扩增曲线，阴性对照无扩增曲线，试验结果成立；

样品出现典型的S型扩增曲线且Ct值≤35，判定为TiLV RT-qPCR结果阳性；

检测无扩增曲线即Ct值≥40，判定为TiLV RT-qPCR结果阴性；对于35＜Ct值＜40的样品，应进行重复检测。

本发明的荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)对罗湖病毒(TiLV)的扩增区域是片段1的特异性片段。

本发明涉及到的序列如下：

TiLV-qF:5’-CCCACTTACACAACGAGGAATGA-3’ (10μM) SEQ ID NO:1；

TiLV-qR:5’-GGTGGCAATCCCAAGTCAGTAG-3’ (10μM) SEQ ID NO:2；

TiLV-qP:VIC-CTCCCCACATGCCTG-MGB (5μM) SEQ ID NO:3。

检测罗湖病毒(TiLV)的荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)扩增序列：

cccacttacacaacgaggaatgaggacttcctccccacatgcctgggagggaagactgtaattagctttcaatctctac tgacttgggattgccacc。SEQ ID NO:4。

罗湖病毒(TiLV)标准质粒和慢病毒序列：

agatctgtgttgtcaaaggtctcggcagtatacactgctactgctagtgcagaacaacgggctatgatggctgcgcaggttgtagagtcaagaagacatgttcttaatggcgactgtactaagtacaatgaggcaatcgacgcagacacactactaaaagtgtgggatgcaataggcatggggtcgattggagtcatgctcgcttacatggtgcgcaggaaatgcgttctcattaaagacactctagtagagtgtccaggaggtatgttgatgggaatgttcaacgcaactgccaccttggcactacaagggacgactgacagattcctgtctttcagcgacgactttataacatcgtttaactcgcctgctgaattacgcgagatagaggacctgcttttcgcaagctgtcataacttgtcgctaaagaagagttacatttcagttgcctcactggaaataaactcgtgtaccctcactagggacggtgacctagccacagggttaggttgcactgctggtgtccccttcagggggccacttgtgactctgaaacagactgcagctatgttatctggcgctgttgactcaggagttatgccattccactcagcagaacgtctgttccagataaagcagcaggaatgtgcctataggtataacaaccccacttacacaacgaggaatgaggacttcctccccacatgcctgggagggaagactgtaattagctttcaatctctactgacttgggattgccacccattttggtaccaagtgcaccctgatggcccagacactatagatcagaaagtcctgtctgtccttgcctcaaagactcgcagaaggagaacccgactggaggctctctcagacttggaccccctggtccctcataggctcctcgtatcagagtcagacgttagcaagattagagcagctaggcaggctcacttgaagtctttaggtttggaac。SEQID NO:5。

运用本发明提供的引物和探针对罗湖病毒(TiLV)进行检测，灵敏度高，准确度高。

本发明引物探针序列在设计过程中，需要把30个毒株31个片段1的全基因序列信息进行比对，找出保守序列，这并不是所有研究人员都能通过引物设计软件能够做到的，再设计了三套引物探针，最终从最初3套引物探针的不断试验中筛选出来本发明要保护的引物探针序列，采用本发明要保护的引物探针序列的RT-qPCR方法灵敏度数据明确，灵敏度可达到2.5×10^-8ng/μL，且特异性好、重复性高，因此具有创造性。

附图说明

图1是TiLV 30个毒株的31个片段1的全基因序列信息部分对比情况图。

图2是TiLV 30个毒株的31个片段1的全基因序列信息部分对比情况图。

图3是TiLV 30个毒株的31个片段1的全基因序列信息部分对比情况图。

图4是RT-qPCR的引物探针最佳浓度的结果图。

图5是RT-qPCR的退火温度和重复性的结果图。

图6是RT-qPCR的灵敏度的结果图。

图7为现有技术“一种罗湖病毒Taq-man探针荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法”的灵敏度试验结果图。

图8是RT-qPCR的标准曲线的结果图。

图9是RT-qPCR特异性试验结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例用到的TiLV质粒、VNNV质粒，是由厦门普诺普和生物技术有限公司合成的。实施例用到的TiLV慢病毒、VNNV慢病毒是由厦门安提海拉生物科技有限公司合成的，模拟真病毒。实施例用到的NNV真病毒，是由本实验室日常检测检出的样品核酸。其他病毒核酸由深圳海关技术中心提供。

实施例用到的TiLV核酸浓度：TiLV质粒，5μg/mL；NNV质粒，5μg/mL；VNNV慢病毒,20μg/mL；TiLV慢病毒，25μg/mL。

以下实验的PCR条件为：

RT-qPCR的反应体系以20μL为例，含有10μL的2×Probe RT-PCR Master Mix；0.2μL的QN Probe RT-Mix；1μL 5μM权利要求1中的引物对中的每条引物；1μL 5μM权利要求1中的探针，1μL模板，余量为水。

反应条件为，反转录45℃20min；预变性95℃5min；扩增95℃15s，60℃1min，40个循环；荧光收集设置在60℃退火延伸时进行。

结果来判断为，

阳性对照出现标准的S型扩增曲线，阴性对照无扩增曲线，试验结果成立；

样品出现典型的S型扩增曲线且Ct值≤35，判定为TiLV RT-qPCR结果阳性；

检测无扩增曲线即Ct值≥40，判定为TiLV RT-qPCR结果阴性；对于35＜Ct值＜40的样品，应进行重复检测。

以下实验中，当没有交代成分和用量的时候，参见上述反应条件。

实施例1：引物的筛选实验

本发明(TiLV RT-qPCR)引物探针序列在设计过程中，参考了全部TiLV 30个毒株31个片段1的全基因序列信息，包括：毒株TH-2013(片段1的GenBank登录号：MN687685)、TH-2014(片段1的GenBank登录号：MN687695)、TH-2015(片段1的GenBank登录号：MN687705)、TH-2016-CN(片段1的GenBank登录号：MN687725)、TH-2016-CU(片段1的GenBank登录号：MN687715)、TH-2017(片段1的GenBank登录号：MN687735)、TH-2018-K(片段1的GenBank登录号：MN687755)、TH-2018-N(片段1的GenBank登录号：MN687745)、TH-2019(片段1的GenBank登录号：MN687765)、BD-2017(片段1的GenBank登录号：MN939372)、BD-2017-181(片段1的GenBank登录号：MT466437)、BD-2019-E3(片段1的GenBank登录号：MT466457)、BD-2019-E1(片段1的GenBank登录号：MT466447)、WVL18053-01A(片段1的GenBank登录号：MH319378)、WVL19031-01A(片段1的GenBank登录号：MN193513)、WVL19054(片段1的GenBank登录号：MN193523)、CL(片段1的GenBank登录号：KY615742)、F3-4(片段1的GenBank登录号：MK425010)、TV1(片段1的GenBank登录号：KX631921)、TV2(片段1的GenBank登录号：KX631931)、TV3(片段1的GenBank登录号：KX631932)、TV4(片段1的GenBank登录号：KX631933)、TV5(片段1的GenBank登录号：KX631934)、TV6(片段1的GenBank登录号：KX631935)、TV7(片段1的GenBank登录号：KX631936)、Til-4-2011(片段1的GenBank登录号：KU751814、NC_029926、KU751814)、NBC02(片段1的GenBank登录号：MN602587)、NBC03(片段1的GenBank登录号：MN602588)、NBC04(片段1的GenBank登录号：MN602590)、NBC06(片段1的GenBank登录号：MN602589)。

把上述30个毒株的31个片段1的全基因序列信息进行比对，找出保守序列，确保扩增的特异性，这需要进行大量的分析工作：31个基因同时使用软件分析时，经常出现卡顿情况，好多分析软件无法同时完成这么多序列的对比。因此先选择其中12个基因进行对比分析，找出具有大部分保守序列的区域，设计引物探针，使引物探针序列处于保守区即没有基因不同的区域。然后将引物探针序列在其余19个基因序列中进行查找分析，若能够在其余19个基因序列中查找到所设计的引物探针序列，则说明该引物探针序列在TiLV的保守区。分析时，碱基对应，标明其相似之处；若有错配或者突变，再研究其他序列的此处碱基信息，如果某处碱基31个基因序列中仅有3-4个基因序列不同，可忽略；如果超过5个，则是非保守区。选择的序列，要至少有1段超过100个碱基的保守片段，如果仅有几个突变碱基，而且找不到更好的片段，引物探针设计时可选择简并碱基。见图1-图3所示30个毒株的31个片段1的全基因序列信息部分对比情况图。其中图1可以看出比对序列左侧增加了10个字母和“.”用来对准基因序列。图2可以看出第1202-1224个碱基为TiLV-qF的序列，其中只有TV6在1216处碱基不是G，而是A，可考虑使用碱基G，而不用使用兼并碱基。图3可以看出第1277-1298个碱基为TiLV-qF序列的颠倒互补序列。图中1291处碱基为C的有5条，碱基为T的有7条，但由于位于5’端，因此此处扩增时碱基互补并不太重要，可以考虑选择稍多数的C。TiLV-qF序列的颠倒互补序列为：CTACTGACTTGGGATTGCCACC(SEQ ID NO:6)，第1232-1246个碱基是TiLV-qP序列。均处于保守区。

申请人通过分析，设计了三套引物探针，将设计好的引物探针序列在其余19个基因序列中进行查找分析，此引物探针序列能够扩增出所有TiLV毒株的基因。其序列如下SEQID NO:1-3,SEQ ID NO:7-12所示，再最终筛选到的本发明的引物和探针序列(如SEQ IDNO:1-3所示)，其灵敏度数据明确，灵敏度可达到为2.5×10^-8ng/μL。

最初3套引物和探针序列：

实施例2引物、探针的终浓度实验

见图4。其中的A～D依次为TiLV-qP终浓度分别为0.25、0.125、0.0625、0.03125μM(对应的使用浓度分别为5、2.5、1.25、0.625μM)。A1/B1/C1/D1～A6/B6/C6/D6表示TiLV-qF/qR终浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625μM(对应的使用浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μM)。将原始浓度为5μM的探针TiLV-qP、原始浓度为10μM的引物TiLV-qF和TiLV-qR，分别进行10倍梯度稀释。第一组，图4的A，6个荧光定量PCR管中均加入使用浓度为5μM的探针TiLV-qP 0.5μL(对应的终浓度0.25μM)，A1～A6管分别加入使用浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μM的引物TiLV-qF和TiLV-qR各0.5μL(对应的终浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625μM)；第二组，图4的B，6个荧光定量PCR管中均加入使用浓度为2.5μM的探针TiLV-qP 0.5μL(对应的终浓度0.125μM)，B1～B6管分别加入使用浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μM的引物TiLV-qF和TiLV-qR各1μL；第三组，图4的C，6个荧光定量PCR管中均加入使用浓度为1.25μM的探针TiLV-qP 1μL(对应的终浓度0.0625μM)，C1～C6管分别加入使用浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μM的引物TiLV-qF和TiLV-qR各1μL；第四组，图4的D，6个荧光定量PCR管中均加入使用浓度为0.625μM的探针TiLV-qP 1μL(对应的终浓度0.03125μM)，D1～D6管分别加入使用浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μM的引物TiLV-qF和TiLV-qR各1μL。反应条件：反转录45℃20min；预变性95℃5min；扩增95℃15s，60℃1min，40个循环。荧光收集设置在60℃退火延伸时进行。正常Ct值的范围是15～35，本组试验结果表明，图4的A的TiLV-qP终浓度为0.5μM时，扩增灵敏度最高，且Ct值在正常范围内，因此优选图4的A；A图中A1、A2 Ct值均为20.5，A3 Ct值为21.2，选择Ct值更小的A1、A2；扩增曲线A2的引物浓度更低，从节省试剂角度考虑，优选扩增曲线A2。因此最佳的引物TiLV-qF、TiLV-qR、探针TiLV-qP终浓度均终浓度为0.25μM(对应的使用浓度分别为5μM)。

实施例3 RT-qPCR的退火温度和重复性实验

见图5的RT-qPCR的退火温度和重复性的结果图。其中A～E的退火温度依次为50℃、55℃、60℃、65℃、70℃。将原始浓度为5μg/mL的TiLV质粒进行10倍梯度稀释，分别为5×10^-2～5×10^-7μg/mL。图5的A，除了模板按照优选的反应体系配制试剂，平均分装到6组(每组重复3次)共18个荧光PCR反应管中。第1组至第6组的荧光PCR反应管分别加入5×10^-2～5×10^-7ng/μL梯度稀释的TiLV质粒各1μL，按照退火温度50℃进行RT-qPCR；图5的B，反应体系完全相同，按照退火温度55℃进行RT-qPCR；图5的C，反应体系完全相同，按照退火温度60℃进行RT-qPCR；图5的D，反应体系完全相同，按照退火温度65℃进行RT-qPCR；图5的E，反应体系完全相同，按照退火温度70℃进行RT-qPCR。反应条件：反转录45℃20min；预变性95℃5min；扩增95℃15s，退火延伸温度分别为50、55、60、65、70℃1min，40个循环。荧光收集设置在50、55、60、65、70℃退火延伸时进行。试验结果显示，退火温度55-60℃，同等核酸浓度扩增曲线Ct值基本一致，且重复性好；退火温度65-70℃，灵敏度降低。通常荧光PCR退火温度选择60℃，因此本RT-qPCR最佳退火温度选择60℃，且重复性好。

实施例4 RT-qPCR的灵敏度的探究实验

见图6和图7。图6中线条1～8依次表示TiLV质粒终浓度分别为2.5×10^-2～2.5×10^-9ng/μL(对应的使用浓度分别为5×10^-1～10^-8ng/μL)。

将原始浓度为5μg/mL的TiLV质粒进行10倍梯度稀释，分别为5×10^-1～5×10^-8μg/mL。除了模板按照优选的反应体系配制试剂，平均分装到8个荧光PCR反应管中，分别加入5×10^-1～5×10^-8ng/μL梯度稀释的TiLV质粒(TiLV质粒终浓度分别为2.5×10^-2～2.5×10^{- 9}ng/μL)各1μL。按照优选反应条件进行RT-qPCR。反应条件：反转录45℃20min；预变性95℃5min；扩增95℃15s，60℃1min，40个循环。荧光收集设置在60℃退火延伸时进行。试验结果显示本文建立的检测罗湖病毒(TiLV)的荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)方法，灵敏度为2.5×10^-8ng/μL(即线条7)。

申请人合成了现有技术“一种罗湖病毒Taq-man探针荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法”的引物和探针，进行了灵敏度的研究，结果见图7。反应体系中除了模板其他均按照其体系进行(反应体系25μL)，图7中曲线1-7分别加入5×10^-2～5×10^-8ng/μL梯度稀释的TiLV质粒(TiLV质粒终浓度分别为2.5×10^-3～2.5×10^-9ng/μL)各1μL，曲线8中加入水1μL。显示灵敏度为2.5×10^-7ng/μL。

实施例5 RT-qPCR的标准曲线的探究实验

见图8。线条1～6依次表示TiLV质粒终浓度分别为2.5×10^-2～2.5×10^-7ng/μL(对应的质粒使用浓度为5×10^-1～10^-6ng/μL)。

将原始浓度为5μg/mL的TiLV质粒进行10倍梯度稀释，分别为5×10^-1～5×10^-6μg/mL。除了模板按照优选的反应体系配制试剂，平均分装到6组(每组重复4次)共24个荧光PCR反应管中。第1组至第6组的荧光PCR反应管分别加入5×10^-1～5×10^-6ng/μL梯度稀释的TiLV质粒各1μL。反应条件：反转录45℃20min；预变性95℃5min；扩增95℃15s，60℃1min，40个循环。荧光收集设置在60℃退火延伸时进行。绘制标准曲线。图8显示R²为0.99745，PCR扩增效率为0.91，扩增效果极好，说明此引物探针的设计和浓度比例以及反应条件均最佳。

实施例6 RT-qPCR特异性试验

见图9。线条1：TiLV质粒；2:TiLV慢病毒；3:真鲷虹彩病毒(RSIV)；4:锦鲤疱疹病毒(KHV)；5:流行性造血器官坏死病毒(EHNV)；6:金鱼造血器官坏死病毒(CyHV)；7:流行性溃疡综合征(EUS)；8:鲤春病毒血症(SVC)；9:传染性造血器官坏死病毒(IHNV)；10:传染性鲑鱼贫血病(ISA)；11:鲑鱼甲病毒(SAV)；12:病毒性出血性败血症(VHSV)；13:阴性对照。按照优选的反应体系(模板除外)配制试剂，平均分装到13个PCR反应管中。平均分装到13个荧光PCR反应管中，第1～13管分别加入初始浓度为5×10^-2ng/μL的TiLV质粒、TiLV慢病毒、真鲷虹彩病毒(RSIV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、金鱼造血器官坏死病毒(CyHV)、流行性溃疡综合征(EUS)、鲤春病毒血症(SVC)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、传染性鲑鱼贫血病(ISA)、鲑鱼甲病毒(SAV)、病毒性出血性败血症(VHSV)、RNase-free water各1μL。反应条件：反转录45℃20min；预变性95℃5min；扩增95℃15s，60℃1min，40个循环。荧光收集设置在60℃退火延伸时进行。试验结果显示本发明建立的检测罗湖病毒(TiLV)的荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)方法，特异性好。

实施例7

将建立的检测罗湖病毒(TiLV)的荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)方法应用于300份罗非鱼、石斑鱼等样品的罗湖病毒(TiLV)的检测，共检出TiLV 0份，与实际情况相符。

全国水产技术推广总站每年都进行罗湖病毒的专项检测工作，海关系统也有罗湖病毒的专项监测任务，本实验室参与了福建省水产技术推广总站采样和病毒检测工作，也但至今尚未检出一例，其他地区也未报道一例。可见国内TiLV尚未形成爆发之势，但仍需监控预防。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门海关技术中心

<120> 一种检测罗湖病毒的荧光定量RT-PCR引物对和探针，试剂盒和检测方法

<130> HGJSG-21001-CNI

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cccacttaca caacgaggaa tga 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtggcaatc ccaagtcagt ag 22

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctccccacat gcctg 15

<210> 4

<211> 97

<212> DNA

<213> 罗湖病毒（TiLV）

<400> 4

cccacttaca caacgaggaa tgaggacttc ctccccacat gcctgggagg gaagactgta 60

attagctttc aatctctact gacttgggat tgccacc 97

<210> 5

<211> 976

<212> DNA

<213> 罗湖病毒（TiLV）

<400> 5

agatctgtgt tgtcaaaggt ctcggcagta tacactgcta ctgctagtgc agaacaacgg 60

gctatgatgg ctgcgcaggt tgtagagtca agaagacatg ttcttaatgg cgactgtact 120

aagtacaatg aggcaatcga cgcagacaca ctactaaaag tgtgggatgc aataggcatg 180

gggtcgattg gagtcatgct cgcttacatg gtgcgcagga aatgcgttct cattaaagac 240

actctagtag agtgtccagg aggtatgttg atgggaatgt tcaacgcaac tgccaccttg 300

gcactacaag ggacgactga cagattcctg tctttcagcg acgactttat aacatcgttt 360

aactcgcctg ctgaattacg cgagatagag gacctgcttt tcgcaagctg tcataacttg 420

tcgctaaaga agagttacat ttcagttgcc tcactggaaa taaactcgtg taccctcact 480

agggacggtg acctagccac agggttaggt tgcactgctg gtgtcccctt cagggggcca 540

cttgtgactc tgaaacagac tgcagctatg ttatctggcg ctgttgactc aggagttatg 600

ccattccact cagcagaacg tctgttccag ataaagcagc aggaatgtgc ctataggtat 660

aacaacccca cttacacaac gaggaatgag gacttcctcc ccacatgcct gggagggaag 720

actgtaatta gctttcaatc tctactgact tgggattgcc acccattttg gtaccaagtg 780

caccctgatg gcccagacac tatagatcag aaagtcctgt ctgtccttgc ctcaaagact 840

cgcagaagga gaacccgact ggaggctctc tcagacttgg accccctggt ccctcatagg 900

ctcctcgtat cagagtcaga cgttagcaag attagagcag ctaggcaggc tcacttgaag 960

tctttaggtt tggaac 976

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctactgactt gggattgcca cc 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acacaacgag gaatgaggac ttc 23

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggcaatccca agtcagtaga gatt 24

<210> 9

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctccccacat gcctg 15

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aaccccactt acacaacgag g 21

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

attgaaagct aattacagtc ttccct 26

<210> 12

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctccccacat gcctg 15

Claims (8)

1.一种检测罗湖病毒的荧光定量RT-PCR引物对和探针，其特征在于，所述引物对序列如SEQ ID NO:1和2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种检测罗湖病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对和探针。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括SEQ ID NO:4所示的DNA作为阳性对照。

4.一种检测罗湖病毒的荧光定量RT-PCR方法，其特征在于，含有如下步骤，对待测样本的DNA作为模板，进行荧光定量RT-PCR，根据结果来判断即可。

5.如权利要求4所述方法，其特征在于，所述RT-PCR的反应体系以20μL为例，含有10μL的2×Probe RT-PCR Master Mix；0.2μL的QN Probe RT-Mix；1μL 5μM权利要求1中的引物对中的每条引物；1μL 5μM权利要求1中的探针，1μL模板，余量为水。

6.如权利要求4所述方法，其特征在于，所述RT-PCR的反应条件为，反转录45℃20min；预变性95℃5min；扩增95℃15s，60℃1min，40个循环；荧光收集设置在60℃退火延伸时进行。

7.如权利要求4所述方法，其特征在于，还设置了阳性对照，阳性对照为权利要求3试剂盒中SEQ ID NO:4所示的DNA。

8.如权利要求4所述方法，其特征在于，根据结果来判断为，

阳性对照出现标准的S型扩增曲线，阴性对照无扩增曲线，试验结果成立；

样品出现典型的S型扩增曲线且Ct值≤35，判定为TiLV RT-qPCR结果阳性；

检测无扩增曲线即Ct值≥40，判定为TiLV RT-qPCR结果阴性；对于35＜Ct值＜40的样品，应进行重复检测。

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