CN113755378B - 一株赖氨酸芽孢杆菌及其在降解塑化剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株保藏编号为CGMCC NO:21835的赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)及其在降解土壤‑蔬菜体系中邻苯二甲酸酯(PAEs)中的应用；该菌制备成菌剂后可用于定殖在蔬菜中减少塑化剂富集，降低土壤中塑化剂向蔬菜可食部分的吸收转运。该赖氨酸芽孢杆菌属于土壤常见益生菌,能定植于蔬菜体内，在不影响蔬菜品质的前提下，降低塑化剂残留，实现绿色安全生产。

Description

一株赖氨酸芽孢杆菌及其在降解塑化剂中的应用
技术领域
本发明涉及一株赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)及其在降解邻苯二甲酸酯类塑化剂中的应用，即针对叶菜及其种植土壤中塑化剂残留污染，利用该赖氨酸芽孢杆菌制备菌剂并加以应用方法，属于微生物学与食品安全领域。
技术背景
邻苯二甲酸酯(PAEs)是一类重要的合成有机物，常广泛用作增塑剂，以增强塑料的柔韧性和机械强度，还用于玩具、粘合剂、化妆品、医疗器材、建筑材料、农药载体等。PAEs在塑料制品中含量可达到10％-60％。PAEs的广泛使用导致其在各种环境介质中都有残留，如水、空气、土壤、植物、食品等。一些PAEs是内分泌干扰物(EDC)，对动物和人类具有潜在的致癌、致畸和致突变作用。其中邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二乙酯(di-ethyl phthalate，DEP)、邻苯二甲酸二丁基苄基酯(BBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)和邻苯二甲酸二辛酯(DOP)被美国国家环保局列为优先控制污染物。
据报道，DBP和DEHP是中国农业土壤中主要的PAEs，浓度比英国和丹麦的同类型土壤中高。土壤中的DBP和DEHP容易被蔬菜吸收和富集，进而可以通过食物链对人类健康构成潜在风险。目前，针对土壤中塑化剂修复的方法主要有化学氧化、微生物植物联合修复、微生物修复。化学氧化修复对土壤具有破坏性，不适用于农田土壤；微生物植物联合修复能高效的修复塑化剂，但是会影响正常的农业生产；而微生物降解的环境适应性仍是需要解决的关键问题。目前赖氨酸芽孢杆菌在降解塑化剂中的应用尚未见报道。
发明内容
针对上述问题，本申请提供一株赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)，该菌株可促进PAEs降解，对土壤-蔬菜体系中PAEs进行修复，减少塑化剂从土壤向蔬菜中的迁移和富集，同时清除土壤和蔬菜体内塑化剂，具有方便、高效和不影响农业生产，同时不引入其他污染，保证蔬菜的安全生产。
具体而言，本申请是通过如下技术方案实现的：
一株保藏号为CGMCC NO:21835的赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)，申请人将其自命名为Y4，该菌株分离自构树树叶，菌株呈棒杆状，能产芽孢，芽孢杆菌属，对动植物无害。申请人于2021年2月25日将该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
其次，本申请还提供了上述保藏号为CGMCC NO:21835的赖氨酸芽孢杆菌在降解环境中邻苯二甲酸酯(PAEs)的应用；上述环境包括土壤、水体、空气等空间；上述邻苯二甲酸酯优选DBP、DEHP、DMP、DEP、DIBP、DNOP中的至少一种。
第三，本申请提供了上述保藏号为CGMCC NO:21835的赖氨酸芽孢杆菌在降解植物体内邻苯二甲酸酯的应用；所述植物包括叶菜类等蔬菜(如上海青等)；所述邻苯二甲酸酯优选DBP、DEHP、DMP、DEP、DIBP、DNOP中的至少一种。具体而言，其具体应用方式如下：将OD600＝0.3(菌浓度约为108cfu/mL)赖氨酸芽孢杆菌菌剂对上海青进行浸根12h处理，用以降解上海青植株中残留的邻苯二甲酸酯。
第四，本申请还提供了利用保藏号为CGMCC NO:21835的赖氨酸芽孢杆菌降解土壤中邻苯二甲酸酯的方法，将OD600＝0.3(菌浓度约为108cfu/mL)赖氨酸芽孢杆菌菌剂喷洒受邻苯二甲酸酯污染的土壤，用以促进土壤中邻苯二甲酸酯(优选DBP和DEHP)的降解，菌剂喷施量约为土壤重量的1％。
第五，本申请提供了含有保藏号为CGMCC NO:21835的赖氨酸芽孢杆菌的菌剂。
本申请首次发现保藏号为CGMCC NO:21835的赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussp.)对邻苯二甲酸酯的降解特性，并进一步利用该菌株制备为菌剂，用以降解土壤及蔬菜中邻苯二甲酸酯(如DBP/DEHP)的降解，利用生物方法减少塑化剂从土壤向蔬菜中的迁移和富集，保证蔬菜的安全生产，不引入其他污染源，绿色环保。
附图说明
图1为赖氨酸芽孢杆菌Y4电镜照片。
图2为赖氨酸芽孢杆菌Y4对邻苯二甲酸酯的降解功能验证结果示意图。
图3为微生物菌剂Y4对土壤中残留DBP修复结果示意图。
图4为微生物菌剂Y4对土壤中残留DEHP修复结果示意图。
图5为该微生物菌剂对减少叶菜体内塑化剂污染实验结果示意图。
具体实施方式
实施例所涉及的培养基：
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母膏，10g/L氯化钠，pH 7.0；
无机盐液体培养基MSM：MgSO4·7H2O(0.4g)，FeSO4·7H2O(0.2g)，K2HPO4(0.2g)，(NH4)2SO4(0.2g)和CaSO4(0.08g)去离子水1L，pH 7.0～7.2；
种子培养基：K2HPO4(4.8g)，KH2PO4(3.5g)，(NH4)2SO4(2g)，MgCl2(0.16g)，CaCl2(0.02g)，NaMoO4.2H2O(0.0024g)，FeCl3(0.0018g)，MnCl2.2H2O(0.0015g)，PH＝7.0，加水至1L。
无机盐固体培养基：无机盐液体培养基中添加20g/L琼脂；
以下实施例所涉及的试剂，除非特别说明，均为商业渠道购买。
实施例1赖氨酸芽孢杆菌Y4的分离鉴定与降解功能验证
1、菌株Lysinibacillussp.sp.Y4分离鉴定
申请人于2016年7月采集来自江苏省农业科学院实验大田(E118°86′,N32°03′)中的构树树叶，然后对树叶进行表面消毒，研磨成汁液，涂布在含有DBP/DEHP为唯一碳氮源的无机盐固体培养基上，筛选获得一株具备DBP与DEHP降解特性的植物内生菌Lysinibacillus sp.Y4。
申请人将该菌自命名为Y4，其电镜图片如图1所示，该菌株呈直杆状，具圆端或方端。
通过生理生化特性和16SrDNA保守序列比对Y4菌株鉴定为赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)，于2021年2月25日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。保藏编号为CGMCC NO:21835,分类命名为赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussp.)。
2、Lysinibacillus sp.Y4菌株降解DBP功能验证
先用LB培养基过夜培养步骤1筛选获得的纯Y4菌株，菌体经过离心(5000rpm，5min)并用灭菌MSM洗涤三遍，然后用MSM重悬成Y4菌悬液(OD600＝1.0)。将Y4菌悬液分别加入20μg/mL、10μg/mL以DBP和DEHP(混合)为碳氮源的无机盐液体培养基中培养0.5、1、2、4、5、7天；最后用气相色谱串联质谱法(GC-MS)检测无机盐液体培养基中的DBP/DEHP残留含量，对比不接菌的对照，计算Y4菌株的降解率：
DBP/DEHP降解率＝(对照组含量-实验组含量)/对照组含量*100％；最终确定Lysinibacillus sp.Y4的DBP降解性能。气相色谱串联质谱(GC-MS)参见国标《GB31604.30-2016》。
结果如图2，OD＝1.0的Y4菌液对20μg/mLDBP与DEHP降解率分别为18.7％，26.5％；对10μg/mLDBP与DEHP降解率分别为16.7％，31.4％。Lysinibacillus sp.Y4对邻苯二甲酸酯具有降解能力。
实施例2 DBP菌剂的制备
所述Y4菌剂是这样获得的：
A)将实施例1或的赖氨酸芽孢菌Y4接种至LB培养基，30℃划线、挑单菌落培养两次后，挑取单菌落于LB培养基中，30℃，180rpm摇床震荡培养24h，获得活化菌种；
B)取活菌体培养物50ml于4℃、5000rpm下离心5min,取沉淀菌体用无菌生理盐水冲洗3次，再用无菌生理盐水调节至菌浓度为108cfu/mL,即获得Y4菌剂。
实施例3 Y4菌剂修复土壤PAEs污染实验
土壤为风干南京水稻土壤，土壤pH 6.67。玻璃盆中加入1kg过筛细土，玻璃烧杯中加入100ml丙酮溶解DBP/DEHP原药(20mg/kg)，倒入土中用玻璃棒搅拌均匀，置于通风橱待丙酮挥发12h。再按质量比5％的添加量向实验土壤中加入实施例2获得的Y4菌剂稀释液(菌浓度约为108cfu/mL)，调节土壤含水量为30％(在实际土壤PAEs污染修复中，维持土壤正常含水率即可)。实验设置葡萄糖组，对照组，Y4组，葡萄糖+Y4，豆粕+Y4组。额外碳源添加按土重1％添加。将玻璃容器置于暗室，老化5天后使用。定期取样用GC-MS法测定土壤PAEs含量，确定该土壤修复剂的修复效果。
实验结果如图3和图4所示，相比空白组污染土壤，加入Y4后DEHP的降解效率在10天后提升了32％。通过添加外加碳源，如Y4+葡萄糖组，相比仅加入葡萄糖组，DBP与DEHP降解率分别提升57％和27％，而在添加有机质豆粕后获得显著更高的降解效果。
实施例4 Y4菌剂定殖上海青修复PAEs污染实验
将三叶一心的上海青根全部浸泡在实施例2获得的Y4菌剂稀释液OD600＝0.3(菌浓度约为108cfu/mL)中12h，对照组浸泡在生理盐水中。然后移栽至添加了DBP和DEHP的土壤中(南京水稻土，浓度20mg/kg)。
栽培一周后取叶菜可食用部分冻干，用气相色谱质谱联用(GC-MS)检测叶菜的DBP/DEHP含量。该实验结果如图5所示，相比CK，DBP降低40％，DEHP降低39％，说明该菌剂能够显著降低叶菜可食用部分DBP/DEHP含量。

Claims (7)

1. 一株赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp. Y4，其保藏编号为CGMCC NO:21835。
2.一种含有如权利要求1所述赖氨酸芽孢杆菌的菌剂。
3.如权利要求1所述赖氨酸芽孢杆菌在降解环境中邻苯二甲酸酯中的应用，所述邻苯二甲酸酯为DBP、DEHP中的至少一种。
4.如权利要求1所述赖氨酸芽孢杆菌在降低植物体内邻苯二甲酸酯含量中的应用，所述邻苯二甲酸酯为DBP、DEHP中的至少一种，所述植物为叶菜类蔬菜。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述环境包括土壤。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用是指，利用菌浓度为108cfu/ mL的赖氨酸芽孢杆菌菌剂对叶菜类蔬菜进行浸根12 h处理，用以降解蔬菜中残留的邻苯二甲酸酯。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用是指，利用菌浓度为108cfu/ mL的赖氨酸芽孢杆菌菌剂喷洒受邻苯二甲酸酯污染的土壤，用以促进土壤中邻苯二甲酸酯的降解。
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