CN113754845A - 一种温度/pH双重响应型三嵌段聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于聚合物技术领域，涉及一种温度/pH双重响应型三嵌段聚合物及其制备方法和应用。所述聚合物由水溶性PEG嵌段和温敏性的AAm嵌段，具有对pH响应的AAc嵌段和疏水性GMA嵌段组成。所述温度/pH双重响应型三嵌段聚合物是先制备得到含有羧基的三硫代酯，再将其与聚乙二醇单甲醚经过酯化反应制备了聚乙二醇大分子链转移剂，采用RAFT聚合法制备得到一种温度/pH双重响应型嵌段聚合物PEG‑b‑PAAm‑b‑P(GMA‑co‑AAc)。本发明目的在于提供一种通过将两种不同刺激响应单元整合在一条聚合物分子链上得到的双重刺激响应型聚合物，可对环境中两种刺激因素进行响应，性能上表现的更加“智能化”。
Description
技术领域
本发明属于聚合物技术领域，具体涉及一种温度/pH双重响应型三嵌段聚合物及其制备方法和应用。
背景技术
刺激响应型聚合物是一类可接受外界因素的刺激从而改变自身结构与性质(如分子链结构、溶解度、带电状态以及聚合物链相互作用等)的高分子材料。常见的刺激响应型聚合物主要包含温度响应型聚合物、pH响应型聚合物、光响应型聚合物、氧化还原响应型聚合物以及其他响应因素聚合物等。温度响应型聚合物在感受到外部温度刺激后，聚合物链会在水溶液相互聚集，宏观上表现为从水溶液以沉淀形式析出的高分子聚合物。由于温度变化易实现，温度响应型聚合物已被广泛应用于生物分离，催化材料，荧光探针，药物控制释放等领域。
然而，温度响应型聚合物只能对单一的温度响应，且存在功能单体有限、响应灵敏度低，响应效果差等缺点，将其用于酶的固定化，会导致固定化酶的固载率及循环利用率低的问题，难以满足实际应用需要。急需发展双重及多重响应型聚合物，通过响应性能的协同作用以提高响应灵敏度、响应效果。在诸多刺激响应型因素中，温度和pH变化易实现，可将温度、pH两种刺激响应单元整合在一条聚合物分子链上得到的温度/pH双重响应型聚合物。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种温度/pH双重响应型三嵌段聚合物及其制备方法和应用。在本发明中，所述温度/pH双重响应型三嵌段聚合物PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)通过将含有羧基的三硫代酯和聚乙二醇单甲醚经过酯化反应得到聚乙二醇大分子链转移剂，然后采用RAFT聚合法制备得到；所述温度/pH双重响应型三嵌段聚合物在作为固定化酶载体材料，制备固定化酶具有均相催化、异相回收的优势。
本发明中首先提供了一种温度/pH双重响应型三嵌段聚合物，所述聚合物由水溶性PEG(聚乙二醇)嵌段、温敏性的AAm(丙烯酰胺)嵌段、具有对pH响应的AAc(丙烯酸)嵌段和疏水性的GMA(甲基丙烯酸缩水甘油酯)嵌段组成，化学式为PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)，其中，b为嵌段，co为随机共聚；45，176,21，140表示该聚合物分别聚合了45个PEG嵌段，176个丙烯酰胺嵌段，21个甲基丙烯酸缩水甘油酯嵌段，140个丙烯酸嵌段。所述聚合物的结构式为：
本发明中还提供了上述温度/pH双重响应性三嵌段聚合物的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)RAFT试剂(CTA)的制备：
向氢氧化钾溶液中滴加3-巯基丙酸，然后在剧烈搅拌下滴加二硫化碳，室温下搅拌，然后加入溴化苄并油浴反应，反应结束后冷却至室温，将反应物加入到三氯甲烷中，滴加盐酸酸化，接着洗涤、干燥、浓缩，加入二氯甲烷析出结晶，并对结晶进行洗涤、减压浓缩、重结晶、干燥，得到黄色固体CTA。
其中，氢氧化钾、3-巯基丙酸、二硫化碳、溴化苄、三氯甲烷的用量比为3.25～3.55g：2.5～3.0mL：4～6mL：5～5.5g，所述溴化苄、三氯甲烷和盐酸的用量比为5～5.5g:70mL:8mL；所述油浴反应的条件为在82-85℃油浴锅中反应12-14h。
(2)基于PEG大分子的链转移剂PEG45-CTA的制备：
将干燥的聚乙二醇单甲醚(PEG45-OH)和步骤(1)制得的CTA溶于无水二氯甲烷中，冰水浴中搅拌均匀，然后加入含4-二甲氨基吡啶DMAP和N,N-二环己基碳二亚胺DCC的二氯甲烷溶液并搅拌反应，过滤，减压浓缩，并将浓缩后的滤液用过量的冰乙醚沉淀，得到沉淀物；将沉淀物溶于二氯甲烷中，减压浓缩，用过量的冰乙醚沉淀，重复数次，干燥得到淡黄色固体，即基于PEG大分子的链转移剂PEG45-CTA。
其中，聚乙二醇单甲醚PEG45-OH、CTA和无水二氯甲烷的用量比为：1.0mmol：2.0mmol：50mL；所述含4-二甲氨基吡啶DMAP和N,N-二环己基碳二亚胺DCC二氯甲烷溶液中，DMAP、DCC和二氯甲烷的用量比为50mg：1g：20mL；所述搅拌反应的条件为25℃选磁力搅拌反应48h。
(3)聚乙二醇-b-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-丙烯酸)两嵌段聚合物PEG45-b-P(GMA21-co-AAc140)的制备：
将步骤(2)制得的PEG45-CTA、丙烯酸、甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA和引发剂偶氮二异丁腈AIBN溶于1,4-二氧六环中，混合均匀，除氧后油浴搅拌反应，反应结束后用冰水浴猝灭反应，然后加入1,4-二氧六环稀释，并将稀释后的反应液加入到过量无水乙醚中沉淀，将沉淀溶于1,4-二氧六环再用无水乙醚沉淀出产物，重复溶解-沉淀，干燥得到淡黄色固体，即聚乙二醇-b-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-丙烯酸)两嵌段聚合物PEG45-b-P(GMA21-co-AAc140)。
其中，油浴反应中，各物质的用量关系为PEG45-CTA、丙烯酸、GMA、AIBN和1,4-二氧六环的用量比为0.45～0.48g：1.38～1.44g：1mmol：0.0142-0.0148g：10～12mL，除氧的方式为通氮气15min；所述油浴搅拌反应的条件为，在75～78℃的油浴锅中搅拌反应22～24h。
(4)温度/pH双重响应型三嵌段聚合物PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)的制备：
将PEG45-b-P(GMA21-co-AAc140)，丙烯酰胺，引发剂偶氮二异丁腈和N,N-二甲基甲酰胺混合均匀，除氧后油浴搅拌反应，反应结束后用冰水浴猝灭反应，然后加入N,N-二甲基甲酰胺稀释，并加入到过量的无水乙醚中沉淀，将沉淀所得产物重新溶于N,N-二甲基甲酰胺中，用无水乙醚沉淀出产物，重复溶解-沉淀数次后，干燥得到米白色固体，即温度/pH双重响应型三嵌段聚合物，记为PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)。
其中，PEG45-b-P(GMA21-co-AAc140)，丙烯酰胺，偶氮二异丁腈和N,N-二甲基甲酰胺的用量比为0.571g:4～6mmol:0.019～0.025g:10～12mL；除氧的方式为：通氮气15min；
所述油浴搅拌反应的条件为70～72℃下搅拌反应12～14h。
本发明中还提供了上述温度/pH双重响应型三嵌段聚合物PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)作为固定化酶载体材料，应用于细胞色素C的固定化领域，展现固定化酶的均相催化、异相回收的优势。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明中先制备得到含有羧基的三硫代酯，再将其与聚乙二醇单甲醚经过酯化反应制备了聚乙二醇大分子链转移剂，最后通过RAFT聚合将丙烯酸，丙烯酰胺，甲基丙烯酸缩水甘油酯单体聚合到聚乙二醇大分子链转移剂，合成了一种温度/pH双重响应性三嵌段聚合物。本发明中制备的温度/pH双重响应型聚合物通过将两种不同刺激响应单元整合在一条聚合物分子链上得到的双重刺激响应型聚合物，可对环境中两种刺激因素进行响应，性能上表现的更加“智能化”，在生物分离，催化材料，荧光探针，药物控制释放等领域有着很好的应用。
采用技术方案中的反应物和反应参数能有效提高聚合物的聚合度，增强聚合物的温敏性能，与已有报道的单一响应或者双重响应的其他聚合物相比表现出高灵敏度，显著的响应效果和较高的回收率。
该聚合物选择亲水性好的温敏单体AAm，以及pH响应单体AAc，采用可逆加成-断裂链转移聚合法制备了一系列的温度/pH双重响应型嵌段聚合物，通过对这类聚合物结构、温度响应性、pH响应性能的研究，获得UCST为26.6℃和pH响应值3.0的PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)温度/pH双重响应型嵌段聚合物，PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)中PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)嵌段具有高温亲水、低温疏水的UCST特性，同时PAAc140嵌段具有高pH亲水、低pH疏水的pH响应特性为后续将其作为细胞色素C的固定化载体，通过温度、pH双重响应的协同作用实现固定化细胞色素C快速、高效回收和循化利用奠定良好的基础。与现有技术相比固定化细胞色素C材料PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)-Cytc具有温敏/pH双重响应,通过同时降低溶液温度和pH值，固定化细胞色素C可快速从溶液中沉淀析出,实现固定化细胞色素C的快速、简捷分离。
附图说明
图1为RAFT试剂(CTA)的合成过程示意图(a)，基于聚乙二醇单甲醚的大分子链转移剂的合成过程示意图(b)，聚乙二醇-b-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-丙烯酸)两嵌段聚合物PEG45-b-P(GMA21-co-AAc140)的合成过程示意图(c)，温度/pH双重响应型三嵌段聚合物PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)合成过程示意图(d)。
图2为RAFT试剂(CTA)的红外光谱图(a)，基于聚乙二醇单甲醚的大分子链转移剂PEG45-CTA的红外光谱图(b)。
图3为PEG45-b-P(GMA21-co-AAc140)的红外光谱图(a)，PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)的红外光谱图(b)。
图4为基于聚乙二醇单甲醚的大分子链转移剂(PEG45-CTA)的1H NMR图(a)，RAFT试剂(CTA)的1H NMR图(b)，其中溶剂为CDCl3。
图5为PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)水溶液的浊点与浓度关系曲线图。
图6为PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)温度依赖性透光率图。
图7为不同种类、浓度的盐溶液对PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)的UCST行为影响。
图8为PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)在不同温度和pH值下的透射电子显微镜(TEM)图；其中a为10℃，pH 3.25，b为30℃，pH 7.0，c为30℃，pH 2.5，d为10℃，pH 2.5。
图9为用FITC标记的PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)溶液在低于10℃，pH2.5时的激光共聚焦图片明场图(a)和荧光场图(b)。
图10为PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)水溶液在30℃，pH 3.25时的平均水合动力学半径分布图和10℃，pH 2.5时的平均水合半径分布图。
图11为PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)固定化细胞色素C条件优化。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1：
图1为本发明所述温度/pH双重响应型三嵌段聚合物PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)的合成示意图，其中a为RAFT试剂(CTA)的合成过程示意图，b为基于聚乙二醇单甲醚的大分子链转移剂的合成过程示意图，c为聚乙二醇-b-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-丙烯酸)两嵌段聚合物PEG45-b-P(GMA21-co-AAc140)的合成过程示意图，d为温度/pH双重响应型三嵌段聚合物PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)合成过程示意图，具体的制备方法如下所示。
(1)RAFT试剂(CTA)的制备：
将3.25g氢氧化钾KOH溶于32mL去离子水后，滴加2.5mL 3-巯基丙酸C3H6O2S，然后在剧烈搅拌下逐滴滴加4mL二硫化碳CS2得到橙黄色液体，然后将上述橙黄色液体在室温下搅拌5h，搅拌结束后加入5g溴化苄C7H7Br，并将混合物置于85℃油浴锅中反应12h。
反应结束后冷却至室温，将混合物溶液倒入70mL三氯甲烷中，滴加盐酸酸化至有机相转变为黄色，随后用过量的去离子水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥有机相，减压浓缩，得到浓缩液。接着向浓缩液中加入适量的二氯甲烷，冰箱中析出产物结晶，用去离子水洗涤产物结晶，将产物结晶溶于三氯甲烷中，减压浓缩、重结晶，重复上述操作三次，最后将所得产物置于真空干燥箱中干燥过夜，得到黄色固体。
(2)基于聚乙二醇单甲醚的大分子链转移剂(PEG45-CTA)的制备：
将2g干燥的聚乙二醇单甲醚PEG45-OH和0.55g CTA溶于50mL无水二氯甲烷中，待固体完全溶解后，放置于冰水浴中搅拌30min。随后，将溶有50mg 4-二甲氨基吡啶DMAP和1gN,N-二环己基碳二亚胺DCC的20mL二氯甲烷溶液逐滴滴加到上述溶液中混合均匀，将混合溶液置入25℃的磁力搅拌器中反应48h后，过滤除去不溶盐收集滤液，之后减压浓缩所得滤液，并用过量的冰乙醚沉淀。
将获得的沉淀物溶解在无水二氯甲烷中，减压浓缩，用过量的冰乙醚沉淀，重复上述步骤三次。将所得的淡黄色沉淀置于真空干燥箱中，室温干燥过夜得到淡黄色固体。
(3)聚乙二醇-b-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-丙烯酸)两嵌段聚合物PEG45-b-P(GMA21-co-AAc140)的制备：
将0.45g PEG45-CTA、丙烯酸(AAc，1.44g，20mmol)，1mmol甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和0.0142g引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)溶于12mL的1,4-二氧六环中，转移至带有磁子的单口圆底烧瓶中，氮气鼓泡30min除去反应溶液中的氧气，在氮气气氛下密封。然后，将烧瓶置于75℃的油浴锅中搅拌反应24h。待冰水浴淬灭反应后，用1,4-二氧六环稀释，并加入到过量的无水乙醚中沉淀。将所得的产物重新溶于反应溶剂(1,4-二氧六环)中，再用无水乙醚沉淀出产物，重复溶解-沉淀三次后，将所得产物置于真空干燥箱中60℃干燥过夜，得到淡黄色固体。
(4)温度/pH双重响应型三嵌段聚合物PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)的制备：
向装有磁子的单口烧瓶中加入0.571g PEG45-b-P(GMA21-co-AAc140)、4mmol丙烯酰胺AAm、0.019g引发剂偶氮二异丁腈AIBN和12mL N,N-二甲基甲酰胺DMF混合均匀，将混合溶液氮气鼓泡30min，在氮气气氛下密封。然后将烧瓶置于70℃的油浴锅中搅拌反应14h，反应结束后用冰水浴淬灭反应，接着用N,N-二甲基甲酰胺稀释，并加入到过量的无水乙醚中沉淀。将所得的产物重新溶于N,N-二甲基甲酰胺中，再用无水乙醚沉淀出产物，重复溶解-沉淀三次后，将所得产物置于真空干燥箱中干燥过夜，得到米白色固体，即温度/pH双重响应型三嵌段聚合物PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)。
实施例2：
步骤(1)～(2)中制备过程与实施例1中相同。
(3)聚乙二醇-b-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-丙烯酸)两嵌段聚合物PEG45-b-P(GMA21-co-AAc140)的制备：
将0.47g PEG45-CTA、丙烯酸(AAc，1.38g，20mmol)，1mmol甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和0.0146g引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)溶于10mL的1,4-二氧六环中，转移至带有磁子的单口圆底烧瓶中，氮气鼓泡30min除去反应溶液中的氧气，在氮气气氛下密封。然后将烧瓶置于75℃的油浴锅中搅拌反应24h，反应结束后用冰水浴淬灭反应，用1,4-二氧六环稀释并加入到过量的无水乙醚中沉淀，将所得的产物重新溶于1,4-二氧六环中，再用无水乙醚沉淀出产物，重复溶解-沉淀三次后，将所得产物置于真空干燥箱中60℃干燥过夜，得到淡黄色固体。
(4)温度/pH双重响应型三嵌段聚合物PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21–co-AAc140)的制备：
向装有磁子的单口烧瓶中加入0.571g PEG45-b-P(GMA21-co-AAc140)、6mmol丙烯酰胺AAm、0.023g引发剂偶氮二异丁腈AIBN和10mL N,N-二甲基甲酰胺DMF混合均匀，将混合溶液氮气鼓泡30min，在氮气气氛下密封。然后将烧瓶置于71℃的油浴锅中搅拌反应13h，反应结束后用冰水浴淬灭反应，接着用N,N-二甲基甲酰胺稀释，并加入到过量的无水乙醚中沉淀。将所得的产物重新溶于N,N-二甲基甲酰胺中，再用无水乙醚沉淀出产物，重复溶解-沉淀三次后，将所得产物置于真空干燥箱中干燥过夜，得到米白色固体，即温度/pH双重响应型三嵌段聚合物PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)。
如图2(a)所示是RAFT试剂(CTA)的红外光谱图，FTIR(KBr,cm-1):3029,2915,1701,1598,1494,1453,1250,1072,815,798,777,710cm-1；图2(b)是所制备的基于聚乙二醇单甲醚的大分子链转移剂的红外光谱图，FTIR(KBr,cm-1):2888,1469,1345,1281,1242,1113,962,843cm-1。如图(a)所示3029cm-1、1701cm-1处分别为CTA上羧基的O-H和C＝O的伸缩振动吸收峰，2915cm-1、1494cm-1分别是CTA上苯环的亚甲基、次甲基C-H伸缩振动吸收峰和骨架振动吸收峰，1072cm-1是三硫代碳酸酯中C＝S的吸收峰。如图(b)所示2888cm-1和1469cm-1处新出现的吸收峰分别是C-H的伸缩振动和弯曲振动吸收峰，说明CTA的端基-COOH已经发生酯化反应。综上所述结果，RAFT链转移剂(CTA)、PE基大分子链转移剂(PEG45-CAT)已经成功制备。
图3(a)为PEG45-b-P(GMA21-co-AAc140)的红外光谱图，FTIR(KBr,cm-1):3354,3211,1771,1664,911,843cm-1；图3(b)为PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21–co-AAc140)的红外光谱图,FTIR(KBr,cm-1):3443,3354,3211,1711,1664cm-1。如图(a)所示3354cm-1、3211cm-1是N-H伸缩振动吸收峰，1664cm-1是C＝O伸缩振动吸收峰。911cm-1和843cm-1处的特征吸收峰增强，是由于聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)上环氧基的伸缩振动吸收峰导致。如图(b)所示3443cm-1为羧基官能团的O-H伸缩振动吸收峰，1711cm-1，1664cm-1是C＝O伸缩振动吸收峰。
如图4实施例1所制备的基于聚乙二醇单甲醚的大分子链转移剂的1H NMR图(a)，1HNMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.31(5H,ArH),4.59(2H,ArCH2-),4.25(2H,-CH2OCO-),3.63(452H,-CH2CH2O-),3.37(3H,CH3O-),2.80(2H,-CH2SC-(＝S)-)；实施例1所制备RAFT试剂(CTA)的1H NMR图(b)，1H NMR(CDCl3)δ(ppm)2.88(2H,CH2-C＝O),3.65(2H,CH2-S),4.64(2H,CH2-Ar),7.33(5H,ArH)；化学位移7.31ppm，4.64ppm，3.65ppm，2.85ppm分别归属于苯环(Ph-H)，与苯环相连的亚甲基(Ph-CH2)，与硫原子相连的亚甲基(-CH2-S)，与羰基相连的亚甲基(-CH2–C＝O)上的质子峰。化学位移3.83-3.56ppm归属于PEG上亚甲基(-CH2CH2O-)的质子峰，表明CTA上的羧基成功地与PEG45-OH上羟基发生酯化反应生成PEG45-CTA。
实施例3：
步骤(1)～(2)中制备过程与实施例1中相同。
(3)聚乙二醇-b-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-丙烯酸)两嵌段聚合物PEG45-b-P(GMA21-co-AAc140)的制备：
将0.48g PEG45-CTA、丙烯酸(AAc，1.41g，20mmol)，1mmol甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和0.0148g引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)溶于11mL的1,4-二氧六环中，转移至带有磁子的单口圆底烧瓶中，氮气鼓泡30min除去反应溶液中的氧气，在氮气气氛下密封。然后将烧瓶置于78℃的油浴锅中搅拌反应24h，反应结束后用冰水浴淬灭反应，用1,4-二氧六环稀释并加入到过量的无水乙醚中沉淀，将所得的产物重新溶于1,4-二氧六环中，再用无水乙醚沉淀出产物，重复溶解-沉淀三次后，将所得产物置于真空干燥箱中60℃干燥过夜，得到淡黄色固体。
(4)温度/pH双重响应型三嵌段聚合物PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)的制备：
向装有磁子的单口烧瓶中加入0.571g PEG45-b-P(GMA21-co-AAc140)、5mmol丙烯酰胺AAm、0.025g引发剂偶氮二异丁腈AIBN和11mL N,N-二甲基甲酰胺DMF混合均匀，将混合溶液氮气鼓泡30min，在氮气气氛下密封。然后将烧瓶置于72℃油浴锅中搅拌反应12h，反应结束后用冰水浴淬灭反应，接着用N,N-二甲基甲酰胺稀释，并加入到过量的无水乙醚中沉淀。将所得的产物重新溶于N,N-二甲基甲酰胺中，再用无水乙醚沉淀出产物，重复溶解-沉淀三次后，将所得产物置于真空干燥箱中干燥过夜，得到米白色固体，即温度/pH双重响应型三嵌段聚合物PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)。
实施例4：
本实施例中测定了通过测定不同浓度PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)三嵌段聚合物的浊点对PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)三嵌段聚合物浊点进行了分析研究，具体实验过程如下所示。
分别制备了10-100mg/mL浓度的PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)三嵌段聚合物的水溶液，将不同浓度的聚合物水溶液放在水浴锅中，使用温度计测试10,20,30,40,50,60,70,80,90,100mg/mL浓度下三嵌段聚合物浊点。
如图5所示。从图中可以得出，浊点会随着PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)三嵌段聚合物浓度的增加而增加，增加到0.07g/mL时，浊点不再增加。因此，三嵌段聚合物的最高临界点(UCST)为26.6℃。当三嵌段聚合物浓度继续增加，其浊点会降低。与现有技术相比该临界点显著降低，具有较好的应用价值。
实施例5：
本实施例中考察了PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)三嵌段聚合物溶液温度依赖性透光率，具体通过如下步骤考察：首先制备0.03g/mL PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)水溶液，使用紫外分光光度计分别测定14～28℃下溶液温度依赖性透光率。
图6为PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)温度依赖性透光率图，从图中可以看出，降温和升温两条透光率随温度变化的曲线没有重合，出现较明显的滞后现象。该现象可归结于聚合物溶液在降温过程中，聚合物嵌段中GMA上甲基引起的聚合物分子链的低迁移速率导致聚合物分子链之间形成氢键的能力降低，需要更多的通过降低温度而获得能量来形成分子间氢键。
实施例6：
本实施例中通过紫外分光光度计检测透过率来考察10mM NaCl,100mM NaCl,10mMNaSCN,100mM NaSCN,10mM MgCl2,100mM MgCl2,10mM AlCl3,100mM AlCl3对PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)三嵌段聚合物的温度响应性影响。
图7为不同种类、浓度的盐溶液对PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)的UCST行为影响。如图7(a)所示，阴离子提高PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)溶液浊点的能力大小排序为：Cl-＞SCN-，此顺序与Hofmeister序列是一致的。Cl-与SCN-按照水化能力都属于结构破坏型离子(chaotropes)，倾向于富集在聚合物链的水化层中，提高聚合物疏水部分水化层中水的表面张力，破坏水化层，因而提高了聚合物水溶液的浊点。如图7(b)所示，阳离子对PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)水溶液的浊点影响的排序为：Al3+＞Mg2+＞Na+。阳离子能与聚合物链中酰胺基团和羧基的结合水形成氢键，从而减弱聚合物链中酰胺基和羧基与结合水之间的氢键作用，增加聚合物链内、链间氢键作用，导致浊点升高。可用通过阳离子水化吉布斯自由能(△*HydG)来说明，阳离子的△*HydG排序为：△*HydG(Na+)＝-365kJ/mol＞△*HydG(Mg2+)＝-1830kJ/mol＞△*HydG(Al3+)＝-4525kJ/mol，阳离子的△*HydG值越小，其水合能力越强。由此可知阳离子的水合能力强弱排序为：Al3+＞Mg2+＞Na+，与实验中阳离子对聚合物水溶点浊点升高顺序一致。
综上，盐均使得PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)聚合物溶液的浊点升高，并且盐浓度与PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)溶液的浊点呈正比例关系，盐的浓度越大，溶液中离子浓度越大，对聚合物链与水分子之间氢键作用破坏越大，从而聚合物水溶液的浊点升高越明显。
实施例7：
本实施例中通过调整PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)三嵌段聚合物的温度和pH，并在透射电子显微镜(TEM)下考察PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)三嵌段聚合物的温度和pH双重响应微观自组装行为。
图8为PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)在不同温度和pH值下的透射电子显微镜(TEM)图；其中a为10℃，pH3.25，b为30℃，pH7.0，c为30℃，pH2.5，d为10℃，pH2.5。如图8(a)所示在30℃、pH为3.25的水溶液中，此时pH小于聚丙烯酸嵌段的pKa(4.28)，PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)中PAAc质子化，该聚合物链通过羧酸、酰胺基团与水分子之间形成氢键作用，聚合物分子链表现为亲水性并且以无规则的线团结构伸展在水溶液中；随着溶液温度的下降，聚合物链上羧酸、酰胺基团与水分子间的氢键作用减弱，聚合物链中羧酸与酰胺之间氢键作用加强，聚合物链聚集。如图8(b)所示当温度低于10℃时，形成球形胶束。
如图8(c)所示降低聚合物溶液的pH值至2.5时，聚丙烯酸嵌段发生质子化，聚合物链以疏水性为主，聚合物分子链间相互作用形成尺寸为111nm的球形胶束。由于pH响应嵌段PAAc的存在，以PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)为核，PEG45为壳的胶束内部也会随着pH变化发生自组装结构变化。如图8(d)所示，在10℃、pH 2.5的强酸性水溶液中，质子化AAc嵌段中羧酸基团全部与PAAm嵌段中酰胺形成氢键作用，导致聚合物链聚集形成胶束，此胶束的结构十分紧密，胶束粒径仅为7nm。
本实施例中还采用激光共聚焦显微镜(CLSM)研究该球形胶束的结构，首先将异硫氰酸荧光素(FITC)标记到PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)聚合物中PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)温度响应嵌段上，在10℃的温度刺激下获得该FITC标记的聚合物自组装体，用488nm激发波长照射该自组装体的激光共聚焦照片。图9为用FITC标记的PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AA c140)溶液在低于10℃，pH 2.5时的激光共聚焦图片明场图(a)和荧光场图(b)，从图中可以看出，该自组装体为内部绿色荧光均匀的球形胶束，该结果表明该聚合物自组装是以PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)为核，PEG45为壳的胶束。
本实施例中还采用动态激光散射(DLS)研究微观自组装行为，图10为PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)水溶液在30℃，pH 3.25时的平均水合动力学半径分布图和10℃，pH 2.5时的平均水合半径分布图，从图中可以看出，聚合物溶液在30℃，pH 2.5条件下，PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)以溶解的单链状态存在，其平均水合动力学直径为8.3nm；而在10℃，pH 2.5条件下发生温度和pH双重响应，聚合物链与水之间的氢键断裂，聚合物链间和链内氢键作用增强，自组装成球形胶束，其平均水合动力学直径为260.3nm。
实施例8：
本实施例考察了在细胞色素C的固定化过程中，固定化条件对固载率具有显著的影响，为获得最优固定化细胞色素C的条件，考察不同固定化时间、温度、pH以及细胞色素C的初始浓度对细胞色素C固载率的影响。
首先配置不同pH值的0.2M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，具体配置过程为：配制0.2M的磷酸氢二钠溶液，在精密pH剂监控下用柠檬酸溶液调节缓冲液的pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。其次，称取50mg温度/pH双重响应性嵌段聚合物，溶解在2mL不同pH的缓冲溶液(0.2M)中，室温下磁力搅拌30min后，加入1、2、3、4、5、6mg的细胞色素C充分溶解后，在25、30、35、40、45、50℃下继续搅拌2、4、6、8、10、12h。
如图11(a)所示，当细胞色素C的浓度增加到2mg/mL时，固载率达到最大值97.1％。继续增大细胞色素C的浓度，细胞色素C的固载率反而降低，可能是由于一定浓度的聚合物载体上环氧基团数量有限，细胞色素C浓度过高时，聚合物载体上环氧基团不足以共价固定化细胞色素C，导致细胞色素C固载率的降低。在细胞色素C的固定化过程中，固定化时间也对细胞色素C固载率有影响。
如图11(b)，随着反应时间的增加，细胞色素C固载率逐渐增加，6h后细胞色素C固载率变化趋势趋于稳定值(97.1％)，说明6h足以完成细胞色素C的固定化。如图11(c)所示，当溶液的pH为5.0时，细胞色素C固载率达到最大值(95.4％)，pH下降到3时，因聚合物的PAAc嵌段具有pH响应性，聚合物链自组装形成胶束，环氧基团被包裹在内部，导致细胞色素C固载效率显著下降；当pH上升到7.0时，固载率也出现降低的现象，这可能归因于在该pH条件下固定化细胞色素C的温度响应不明显，固定化细胞色素C回收不完全所致。最后，还考察了固定化温度对细胞色素C固载率的影响，如图11(d)所示。从图中可以看出在25-50℃温度范围内，细胞色素C固载率变化甚微。考虑到实际应用需要保留高酶活性，选定固定化温度定为25℃，细胞色素C浓度为2mg/mL，pH 5.0，固定化时间为6h作为细胞色素C最适固定化条件。
所述实施例为本发明优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种温度/pH双重响应型三嵌段聚合物，其特征在于，所述聚合物由水溶性聚乙二醇PEG嵌段、温敏性的丙烯酰胺AAm嵌段、具有对pH响应的丙烯酸AAc嵌段和疏水性的甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA嵌段组成，化学式为PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)，其中，b为嵌段，co为随机共聚；45、176、21、140表示该聚合物分别聚合了45个PEG嵌段，176个丙烯酰胺嵌段，21个甲基丙烯酸缩水甘油酯嵌段，140个丙烯酸嵌段；所述聚合物的结构式为：
2.一种温度/pH双重响应型三嵌段聚合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)RAFT试剂(CTA)的制备：
向氢氧化钾溶液中滴加3-巯基丙酸，然后在剧烈搅拌下滴加二硫化碳，室温下搅拌；然后加入溴化苄并油浴反应，反应结束后冷却至室温，将反应物加入到三氯甲烷中，滴加盐酸酸化；接着洗涤、干燥、浓缩，加入二氯甲烷析出结晶，并对结晶进行洗涤、减压浓缩、重结晶、干燥，得到黄色固体CTA；
(2)基于PEG大分子的链转移剂PEG45-CTA的制备：
将干燥的聚乙二醇单甲醚PEG45-OH和步骤(1)制得的CTA溶于无水二氯甲烷中，冰水浴中搅拌均匀，然后加入含4-二甲氨基吡啶DMAP和N,N-二环己基碳二亚胺DCC的二氯甲烷溶液并搅拌反应，过滤，减压浓缩，并将浓缩后的滤液用过量的冰乙醚沉淀，得到沉淀物；将沉淀物溶于二氯甲烷中，减压浓缩，用过量的冰乙醚沉淀，重复数次，干燥得到淡黄色固体，即基于PEG大分子的链转移剂PEG45-CTA；
(3)聚乙二醇-b-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-丙烯酸)两嵌段聚合物PEG45-b-P(GMA21-co-AAc140)的制备：
将步骤(2)制得的PEG45-CTA、丙烯酸、甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA和引发剂偶氮二异丁腈AIBN溶于1,4-二氧六环中，混合均匀，除氧后油浴搅拌反应，反应结束后用冰水浴猝灭反应；然后加入1,4-二氧六环稀释，并将稀释后的反应液加入到过量无水乙醚中沉淀，将沉淀溶于1,4-二氧六环再用无水乙醚沉淀出产物，重复溶解-沉淀，干燥得到淡黄色固体，即聚乙二醇-b-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-丙烯酸)两嵌段聚合物PEG45-b-P(GMA21-co-AAc140)；
(4)温度/pH双重响应型三嵌段聚合物PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)的制备：
将PEG45-b-P(GMA21-co-AAc140)、丙烯酰胺、引发剂偶氮二异丁腈和N,N-二甲基甲酰胺混合均匀，除氧后油浴搅拌反应，反应结束后用冰水浴猝灭反应，然后加入N,N-二甲基甲酰胺稀释，并加入到过量的无水乙醚中沉淀，将沉淀所得的产物重新溶于N,N-二甲基甲酰胺中，用无水乙醚沉淀出产物，重复溶解-沉淀数次后，干燥得到米白色固体，即温度/pH双重响应型三嵌段聚合物，记为PEG45-b-PAAm176-b-P(GMA21-co-AAc140)。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，氢氧化钾、3-巯基丙酸、二硫化碳、溴化苄、三氯甲烷的用量比为3.25～3.55g：2.5～3.0mL：4～6mL：5～5.5g，所述溴化苄、三氯甲烷和盐酸的用量比为5～5.5g：70mL：8mL；所述油浴反应的条件为在82～85℃油浴锅中反应12-14h。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，聚乙二醇单甲醚PEG45-OH、CTA和无水二氯甲烷的用量比为：1.0mmol：2.0mmol：50mL；所述含4-二甲氨基吡啶DMAP和N,N-二环己基碳二亚胺DCC二氯甲烷溶液中，DMAP、DCC和二氯甲烷的用量比为50mg：1g：20mL；所述搅拌反应的条件为25℃，选磁力搅拌反应48h。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，油浴反应中，各物质的用量关系为PEG45-CTA、丙烯酸、GMA、AIBN和1,4-二氧六环的用量比为0.45-0.48g：1.38～1.44g：1mmol：0.0142～0.0148g：10～12mL。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，除氧的方式为通氮气15min；所述油浴搅拌反应的条件为，在75～78℃的油浴锅中搅拌反应22～24h。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，PEG45-b-P(GMA21-co-AAc140)，丙烯酰胺，偶氮二异丁腈和N,N-二甲基甲酰胺的用量比为0.571g：4～6mmol：0.019～0.025g：10～12mL。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，除氧的方式为：通氮气15min；所述油浴搅拌反应的条件为70～72℃下搅拌反应12～14h。
9.将权利要求1所述的温度/pH双重响应型三嵌段聚合物作为固定化酶载体材料，应用于细胞色素C的固定化领域。
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