CN113749146A - 一种生物被膜抑制剂的配方、制备、用途和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物被膜抑制剂的配方、制备、用途和使用方法。抑制剂包括：银盐、还原剂、稳定剂和水；制备方法包括：将所述银盐、还原剂、稳定剂和水进行混合和超声处理，得到抑制剂；该抑制剂用于抑制生物被膜的形成。本发明的抑制剂能够有效地抑制细菌的生物被膜形成能力，降低接触表面上的细菌生物量及其胞外物质含量，尤其适用于沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌在不锈钢表面形成的生物被膜。

Description

一种生物被膜抑制剂的配方、制备、用途和使用方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种生物被膜抑制剂的配方、制备、用途和使用方法。

背景技术

细菌生物被膜的产生是食品加工业的一个亟待解决的难题。生物被膜可以聚集并传播腐败和致病细菌，在定期清洁和消毒后，这些细菌通常仍然会残留在加工表面上。根据世界卫生组织(WHO)的数据统计，25％的食源性疾病暴发与食品加工过程中的食源性致病菌交叉污染相关，食品加工接触表面上的生物被膜是致病菌潜在的持续性污染源。

细菌生物被膜是细菌粘附在生物或非生物表面的一种生长方式，由细菌菌体及其产生的多聚胞外物质共同组成，形成具有一定空间结构的细菌聚集体，广泛存在于食品、食品加工设备、自来水管道等表面。细菌的生物被膜状态具有与游离态截然不同的特性，生物被膜态细菌对多种杀菌剂具有天然的抵抗能力，很难被食品加工过程中常用的消毒剂或抗生素完全清除，从而成为持续性污染源。

鲜切菜又称最少加工蔬菜，它是指以新鲜蔬菜为原料，经分级、清洗、整修、去皮、切分、保鲜、包装等一系列处理后，再经过低温运输进入冷柜销售的即食或即用果蔬制品。鲜切菜可以直接被消费者鲜食而不需要额外加热步骤，加工过程中的食源性致病菌污染很容易导致食品污染而引起食物中毒。沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌是两种在新鲜农产品及其加工产品中最为常见的食源性致病菌，严重威胁人类健康。食源性致病菌易在食品、各种食品加工接触面及非食品加工接触面(如墙壁、下水道、墙角等)形成生物被膜，再经手、空气或直接污染食品而引起食物中毒，对于鲜切菜加工过程而言，沙门氏菌等食源性致病菌转移到食品中的最常见途径是通过食品加工表面的细菌生物被膜交叉污染。

因此，如何有效地抑制生物被膜的形成是食品加工过程中亟待解决的问题。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种生物被膜抑制剂的配方、制备、用途和使用方法，本发明的抑制剂能够有效抑制细菌的生物被膜形成能力，降低接触表面上的细菌生物量及其胞外物质含量，应用前景好。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种抑制剂。根据本发明的实施例，所述抑制剂的原料包括：银盐、还原剂、稳定剂和水。采用上述技术方案，该抑制剂中以纳米银为有效杀菌成分，呈胶体状，其中分布有均一、稳定的圆形颗粒，该抑制剂能够有效地抑制细菌的生物被膜形成能力，降低接触表面上的细菌生物量及其胞外物质含量，应用前景好。

根据本发明的实施例，上述抑制剂还可以具有下列附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述银盐选自硝酸银；所述还原剂选自没食子酸、抗坏血酸、葡萄糖；所述稳定剂选自海藻酸钠、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、PEG(聚乙二醇)。

根据本发明的实施例，所述抑制剂的原料包括：90-110体积份的浓度为1.3-1.7g/L海藻酸钠溶液、1.8-2.3体积份的浓度为18-22mM硝酸银溶液和1.8-2.3体积份的浓度为8-12mM没食子酸溶液。

根据本发明的实施例，所述抑制剂的pH值为7.5-8.0。

根据本发明的实施例，所述抑制剂是以胶体溶液的形式提供的，其中纳米银颗粒的粒径为15～20nm。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备上述抑制剂的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将所述银盐、还原剂、稳定剂和水进行混合和超声处理，以便得到所述抑制剂。根据本发明的实施例，该制备方法操作简单，且制备的抑制剂具有均一性和稳定性等优点，并且，制得的抑制剂能够有效抑制细菌的生物被膜形成能力，降低接触表面上的细菌生物量及其胞外物质含量。

根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：分别配制成海藻酸钠溶液、硝酸银溶液和没食子酸溶液；调节所述海藻酸钠溶液的pH值，向所得溶液中加入所述硝酸银溶液，再加入所述没食子酸溶液，然后进行混合和超声处理，以便得到所述抑制剂。

根据本发明的实施例，所述硝酸银溶液的添加方式为逐滴添加。

根据本发明的实施例，所述超声处理是在200-400W、20-40℃条件下处理20-40min

在本发明的又一方面，本发明提出了一种所述抑制剂在抑制生物被膜形成中的用途。由此，本发明的抑制剂能够有效地抑制细菌的生物被膜形成能力，降低食品接触表面上的细菌生物量及其胞外物质含量。

根据本发明的实施例，所述生物被膜是由沙门氏菌和/或单核细胞增生李斯特氏菌形成的。

根据本发明的实施例，所述生物被膜形成于鲜切菜加工过程中的不锈钢接触面。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种抑制生物被膜形成的方法。根据本发明的实施例，包括：在适于生物被膜形成的表面上施加上述的抑制剂。由此，该抑制方法操作简单，且能够有效地抑制生物被膜的形成。

根据本发明的实施例，所述施加包括浸没或喷淋方式。

根据本发明的实施例，在所述施加之前，预先将所述抑制剂进行稀释。

根据本发明的实施例，所述稀释的倍数为5～15倍，所述抑制剂与所述表面的作用时间为20～40min。

根据本发明的实施例，所述生物被膜是由沙门氏菌和/或单核细胞增生李斯特氏菌形成的。

根据本发明的实施例，所述表面为鲜切菜加工过程中的不锈钢接触面。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为实施例1中抑制剂的红外扫描表征图；

图2为实施例1中抑制剂的透射电镜形貌表征图；

图3为实施例1中抑制剂的能谱分析图；

图4为实施例1中抑制剂的热重分析图；

图5为应用例1中抑制剂不同处理时间对沙门氏菌生物被膜的抑制效率图(百分数为抑制率)；

图6为应用例1中抑制剂不同处理时间对对肠炎沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌生物被膜的抑制效率图；

图7为抑制剂的施加方式。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

本发明提出了一种生物被膜抑制剂的配方、制备、用途和使用方法，下面将分别对其进行详细描述。

抑制剂

在本发明的一个方面，本发明提出了一种抑制剂。根据本发明的实施例，该抑制剂的原料包括：银盐、还原剂、稳定剂和水。

根据本发明实施例的抑制剂原料中含有银盐和还原剂，在还原剂的作用下可以将银盐还原为银，银可以起到抑制生物被膜形成的作用。由于银离子被还原为银后会沉淀，导致体系不均一。为此，通过添加稳定剂以使体系呈胶体状，银以颗粒的形式均匀、稳定地悬浮于体系中，从而获得均一、稳定的纳米银胶体。

根据本发明的实施例，银盐选自硝酸银。硝酸银易溶于水，以便提供银离子，在还原剂的作用下还原为纳米银，从而起到杀菌作用。并且，形成的纳米银不会与人体内多种生物活性物质结合而沉积，在毛孔中吸附并杀灭细菌，并会从体内完全排出，不会产生毒副作用。

根据本发明的实施例，还原剂选自没食子酸、抗坏血酸、葡萄糖。由此，可以有效地将银盐还原为银离子。

根据本发明的实施例，稳定剂选自海藻酸钠、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、PEG(聚乙二醇)。由此，可以使纳米银稳定存在胶体内，防止纳米银产生沉淀，从而得到均一稳定的纳米银胶体溶液。因此，本发明的抑制剂具有安全、无毒、绿色环保等优点，可作为传统化学合成杀菌剂的替代品。

根据本发明的实施例，上述抑制剂的原料包括：90-110体积份的浓度为1.3-1.7g/L海藻酸钠溶液、1.8-2.3体积份的浓度为18-22mM硝酸银溶液和1.8-2.3体积份的浓度为8-12mM没食子酸溶液。发明人通过大量试验发现，上述配比条件下制得的抑制剂对细菌的生物被膜形成的抑制效果较佳，尤其适用于沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌在不锈钢表面形成的生物被膜。

根据本发明的实施例，抑制剂的pH值为7.5-8.0。在上述pH值范围内的抑制剂的稳定性较好，其抑制生物被膜形成的效果较佳。

根据本发明的实施例，抑制剂是以胶体溶液的形式提供的，其中纳米银颗粒的粒径为15～20nm。由此，能够使抑制剂中的纳米银稳定存在胶体内，防止纳米银沉淀，从而得到均一稳定的纳米银胶体溶液；并且，发明人通过大量试验发现，抑制剂中的固体颗粒的粒径在15～20nm范围内时，其抑制生物被膜形成的效果较好。

制备抑制剂的方法

在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备上述抑制剂的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将银盐、还原剂、稳定剂和水进行混合和超声处理，以便得到抑制剂。根据本发明的实施例，该制备方法操作简单，制得的抑制剂的粒径大小控制在15-20nm范围内，制备的抑制剂具有均一性和稳定性的优点，并且，该抑制剂能够有效地抑制细菌的生物被膜形成能力，降低接触表面上的细菌生物量及其胞外物质含量。

根据本发明的实施例，该方法进一步包括：分别配制成海藻酸钠溶液、硝酸银溶液和没食子酸溶液；调节海藻酸钠溶液的pH值，向所得溶液中加入硝酸银溶液，再加入没食子酸溶液，然后进行混合和超声处理，以便得到抑制剂。发明人通过大量试验发现，通过调整海藻酸钠溶液的pH值以及原料的添加顺序，能够使溶液中的银离子和还原剂完全反应，提高产率。并且，该方法制得的抑制剂的稳定性较好，能够有效的抑制生物被膜的形成。

根据本发明的实施例，硝酸银溶液的添加方式为逐滴添加。由此，能够使银离子均匀地分布于海藻酸钠溶液中，能够使后期银离子和还原剂充分反应。

根据本发明的实施例，超声处理是在200-400W、20-40℃条件下处理20-40min。发明人通过大量试验发现，在上述条件下进行超声处理，能够提高反应速率，大大缩短反应时间，并且能够提高产率。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对抑制剂所描述的特征和优点，同样适用于该制备抑制剂的方法，在此不再赘述。

抑制剂在抑制生物被膜形成中的用途

在本发明的又一方面，本发明提出了一种抑制剂在抑制生物被膜形成中的用途。由此，本发明的抑制剂能够有效抑制细菌的生物被膜形成能力，降低接触表面上的细菌生物量及其胞外物质含量。

根据本发明的实施例，生物被膜是由沙门氏菌和/或单核细胞增生李斯特氏菌形成的。由此，该抑制剂能够有效的抑制由沙门氏菌和/或单核细胞增生李斯特氏菌形成的生物被膜。

根据本发明的实施例，生物被膜形成于鲜切菜加工过程中的不锈钢接触面上。由此，该抑制剂具有安全、无毒、绿色环保等优点，能够用于鲜切菜加工过程中的接触面上，并有效地抑制接触面上生物被膜的形成。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对抑制剂所描述的特征和优点，同样适用于该抑制剂的用途，在此不再赘述。

抑制生物被膜形成的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种抑制生物被膜形成的方法。根据本发明的实施例，包括：在适于生物被膜形成的表面上施加上述的抑制剂。由此，该抑制方法操作简单，且能够有效地抑制生物被膜的形成。

根据本发明的实施例，施加包括浸没或喷淋方式。由此，该施加方式操作简单，且能够有效地抑制物体表面的生物被膜。

根据本发明的实施例，在施加之前，预先将抑制剂进行稀释。由此，能够节省抑制剂的用量。

根据本发明的实施例，稀释的倍数为5～15倍，抑制剂与表面的作用时间为20～40min。发明人通过大量试验发现，当抑制剂和表面的作用时间为20～40min时，抑制剂有效抑制沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌在表面上的黏附和生物被膜形成，抑制率达到65-95％。

根据本发明的实施例，生物被膜是由沙门氏菌和/或单核细胞增生李斯特氏菌形成的。由此，该抑制剂能够有效的抑制由沙门氏菌和/或单核细胞增生李斯特氏菌形成的生物被膜。

根据本发明的实施例，表面为鲜切菜加工过程中的不锈钢接触面。由此，该抑制剂具有安全、无毒、绿色环保等优点，能够用于鲜切菜加工过程中的接触面上，并有效地抑制接触面上生物被膜的形成。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对抑制剂和抑制剂在抑制生物被膜形成中的用途所描述的特征和优点，同样适用于该抑制生物被膜形成的方法，在此不再赘述。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

制备抑制剂的方法的实施例

实施例1：包含如下步骤：

S1、分别配制浓度为1.5g/L的海藻酸钠溶液、浓度为20mmol/L的硝酸银溶液和浓度为10mmol/L的没食子酸溶液；

S2、取100mL的海藻酸钠溶液，将其pH值调节至12.0，逐滴添加的方式加入2.0mL硝酸银溶液，然后加入2.0mL的没食子酸溶液，混匀后，于300W、30℃的条件下超声30min，得到抑制剂。然后对抑制剂进行红外扫描检测、透射电镜形貌检测、能谱分析和热重分析，见图1-4。

实施例2-5：与实施例1的区别在于，步骤S2中的海藻酸钠溶液、硝酸银溶液和/或没食子酸溶液的添加量不同，具体添加量如表1所示。

结果表明，实施例2～5制备的生物被膜形成抑制剂的结构特性与实施例1制备的生物被膜形成抑制剂基本一致。

表1

对比例1-2：与实施例1的区别在于，步骤S2中的海藻酸钠溶液、硝酸银溶液和/或没食子酸溶液的添加量不同，具体添加量如表1所示。结果表明，海藻酸钠的添加量过多会造成反应速率减慢，抑制剂的抗菌效果减弱，而没食子酸溶液的添加量不足则导致硝酸银还原不完全。

对比例3：与实施例1的区别在于，步骤S2中硝酸银溶液的添加方式为一次性完全加入。结果表明，未逐滴加入硝酸银溶液导致纳米银颗粒之间聚集沉淀，形成团聚。

对比例4：与实施例1的区别在于，步骤S2中超声处理条件为150W、30℃的条件下超声30min。结果表明，超声处理条件不当，会导致纳米银颗粒大小偏大，且不均一。

对比例5-6：与实施例1的区别在于，步骤S2中的稳定剂为PVP(聚乙烯吡咯烷酮)和PEG(聚乙二醇)。结果表明，采用这两种稳定剂可以如海藻酸钠一样能够得到均一的纳米颗粒，但海藻酸钠具有稳定和还原的双重作用，无毒无害，而PVP和PEG为化学合成，具有一定的生物安全风险。

对比例7-8：与实施例1的区别在于，步骤S2中的还原剂为抗坏血酸和葡萄糖。结果表明，采用抗坏血酸和葡萄糖作为还原剂会导致硝酸银还原效率低，反应时间延长。

抑制剂的应用例

应用例1：分别将实施例1、对比例1～5制得的抑制剂喷洒于食品接触表面，分别检测食品接触表面未喷洒抑制剂和分别喷洒5、10、15、20、25、30、40、50、60min时对肠炎沙门氏菌的抑制率，以及检测喷洒4、12、24、36、48h后食品接触表面的肠炎沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌生物被膜生物量。

结果表明，如图5和图6所示，采用实施例1制得的抑制剂可以有效地抑制生物被膜的形成。另外，本发明的抑制剂的施加方法还可以为将食品接触表面浸泡于抑制剂中，具体见图7所示。对比例1～5制备的抑制剂作用于生物被膜后，生物被膜生物量均高于实施例1，由此，表明其抑制作用显著低于实施例1。

其中，细菌生物被膜抑制率的计算如下：

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种抑制剂，其特征在于，所述抑制剂的原料包括：银盐、还原剂、稳定剂和水。

2.根据权利要求1所述的抑制剂，其特征在于，所述银盐选自硝酸银；

任选地，所述还原剂选自没食子酸、抗坏血酸、葡萄糖；

任选地，所述稳定剂选自海藻酸钠、PVP、PEG。

3.根据权利要求2所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂的原料包括：

90-110体积份的浓度为1.3-1.7g/L海藻酸钠溶液、1.8-2.3体积份的浓度为18-22mM硝酸银溶液和1.8-2.3体积份的浓度为8-12mM没食子酸溶液。

4.根据权利要求1或2所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂的pH值为7.5-8.0；

任选地，所述抑制剂是以胶体溶液的形式提供的，其中纳米银颗粒的粒径为15～20nm。

5.一种制备权利要求1～4任一项所述抑制剂的方法，其特征在于，包括：

将所述银盐、还原剂、稳定剂和水进行混合和超声处理，以便得到所述抑制剂。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，进一步包括：

分别配制成海藻酸钠溶液、硝酸银溶液和没食子酸溶液；

调节所述海藻酸钠溶液的pH值，向所得溶液中加入所述硝酸银溶液，再加入所述没食子酸溶液，然后进行混合和超声处理，以便得到所述抑制剂；

任选地，所述硝酸银溶液的添加方式为逐滴添加；

任选地，所述超声处理是在200-400W、20-40℃条件下处理20-40min。

7.权利要求1～4任一项所述抑制剂在抑制生物被膜形成中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述生物被膜是由沙门氏菌和/或单核细胞增生李斯特氏菌形成的。

任选地，所述生物被膜形成于鲜切菜加工过程中的不锈钢接触面。

9.一种抑制生物被膜形成的方法，其特征在于，包括：

在适于生物被膜形成的表面上施加权利要求1～4任一项所述的抑制剂。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述施加包括浸没或喷淋方式；

任选地，在所述施加之前，预先将所述抑制剂进行稀释；

任选地，所述稀释的倍数为5～15倍，所述抑制剂与所述表面的作用时间为20～40min；

任选地，所述生物被膜是由沙门氏菌和/或单核细胞增生李斯特氏菌形成的；

任选地，所述表面为鲜切菜加工过程中的不锈钢接触面。

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