CN113740524A - 一种蛋白印记膜再生液的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子印迹技术领域，具体涉及一种蛋白印记膜再生液的制备方法，采用盐酸胍处理蛋白酶K溶液，得到处理后蛋白酶K溶液；将低活性蛋白酶K与复合盐溶液混合配置，调节pH值，得到蛋白印迹膜再生液，蛋白酶K能够将蛋白酶解成小片段多肽，从而使模板蛋白更容易从孔穴中洗脱出来，达到比较好的洗脱效果，通过盐酸胍处理蛋白酶K溶液能够使蛋白酶K进行一定程度上的去折叠，蛋白酶K的活力与构象具有较强的相关性，通过诱导蛋白酶K进行去折叠处理，能够降低蛋白酶K的活性，从而保障洗脱后留下较多的有效识别位点，从而能够直接进行其他蛋白的检测，本发明具有比较好的效果和洗脱效率。

Description

一种蛋白印记膜再生液的制备方法
技术领域
本发明涉及分子印迹技术领域，具体涉及一种蛋白印记膜再生液的制备方法。
背景技术
蛋白印迹是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种试验方法，其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。
具体试验方法为经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型，及其生物学活性不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
在蛋白印迹中完成了一抗二抗结合和后续的化学发光检测后，有时还需要检测其他蛋白进行比较，蛋白印迹膜再生液中的特殊成分可以解离膜上的抗原与抗体的结合，但是影响转移到膜上的蛋白，随后可以使用不同的抗体进行下一轮蛋白印迹实验，检测其他蛋白，当需要多次蛋白检测时，传统的洗脱强度过大，常常会导致固相载体上的蛋白信号减弱，并且含有刺激性强的化学物质巯基乙醇，操作不慎会对工作人员造成危害，且操作时间较长。
例如公布号CN101833008 A的发明专利中采用甘氨酸和十二烷基磺酸钠制备蛋白印记膜再生液，具有较好的洗脱效果，但洗脱强度过大，常常会导致固相载体上的蛋白信号减弱，容易破坏抗原。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种洗脱效果较好、刺激性较弱，不影响转移到膜上蛋白的蛋白印记膜再生液的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种蛋白印记膜再生液的制备方法，包括以下步骤：
1)采用盐酸胍处理蛋白酶K溶液，得到处理后蛋白酶K溶液；
2)将处理后蛋白酶K与复合盐溶液混合配置，调节pH值，得到蛋白印迹膜再生液。
蛋白酶K相对于角蛋白、血红蛋白、组蛋白等具有较好的酶解作用，能够将蛋白酶解成小片段多肽，从而使模板蛋白更容易从孔穴中洗脱出来，达到比较好的洗脱效果，通过盐酸胍处理蛋白酶K溶液能够使蛋白酶K进行一定程度上的去折叠，蛋白酶K的活力与构象具有较强的相关性，通过诱导蛋白酶K进行去折叠处理，能够降低蛋白酶K的活性，从而保障洗脱后留下较多的有效识别位点，从而能够直接进行其他蛋白的检测。
进一步的，步骤1)中，所述处理后蛋白酶K溶液内盐酸胍的浓度为2.5-4.5mol/L。
进一步的，步骤1)中，所述处理步骤为将盐酸胍加入蛋白酶K溶液中，于20-30℃保温10-15h，采用低温诱导的方法使蛋白酶K进行初步的去折叠处理，相较于高温，室温条件下的处理程度较轻，使蛋白酶K仍能保持一定的活性。
进一步的，步骤2)中，所述pH值为6-6.8，在微酸性条件下，蛋白印迹膜具有较好的渗透量，从而能够加快洗脱处理速率，也使再生液具有较好的洗脱效果。
进一步的，步骤1)中，所述蛋白酶K溶液中，蛋白酶K的浓度为0.1mg/ml。
进一步的，步骤2)中，所述复合盐溶液为氯化钠、氯化钙的混合溶液。
进一步的，所述氯化钠与氯化钙物质的量之比为1:1-1:2。
与现有技术相比，本发明具有的优点和积极效果是：
本发明提供的蛋白印迹膜再生液与电泳、转膜相比，不仅节省样品、材料和时间，还可以消除重新上样带来的误差，增强试验的可比性，解决了完成一抗二抗结合和后续的化学发光检测后，还需检测其他蛋白的问题，本发明采用的低活性的蛋白酶K解离膜上的抗原与抗体的结合，且能够减少对转移到膜上的抗原蛋白产生影响，使同一张膜能够采用不同种类的抗体进行下一轮蛋白印记检测，且通过对再生液pH值的调节能够改善蛋白印迹膜在洗脱过程中的渗透压，从而具有比较好的效果和洗脱效率。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述。
实施例1：
(1)取浓度为0.1mg/ml蛋白酶K溶液1ml，置于试管内，将盐酸胍加入蛋白酶K溶液中，使得蛋白酶K溶液内盐酸胍的浓度为3.5mol/L，于25℃保温12h，得到处理后蛋白酶K溶液；
(2)用复合盐调节处理后蛋白酶K溶液的pH值至6.5，得到蛋白印迹膜再生液，复合盐为物质的量之比为1:1的氯化钠与氯化钙混合而成。
实施例2：
(1)取浓度为0.1mg/ml蛋白酶K溶液1ml，置于试管内，将盐酸胍加入蛋白酶K溶液中，使得蛋白酶K溶液内盐酸胍的浓度为2.5mol/L，于20℃保温10h，得到处理后蛋白酶K溶液；
(2)用复合盐调节处理后蛋白酶K溶液的pH值至6，得到蛋白印迹膜再生液，复合盐为物质的量之比为1:2的氯化钠与氯化钙混合而成。
实施例3：
(1)取浓度为0.1mg/ml蛋白酶K溶液1ml，置于试管内，将盐酸胍加入蛋白酶K溶液中，使得蛋白酶K溶液内盐酸胍的浓度为4.5mol/L，于30℃保温15h，得到处理后蛋白酶K溶液；
(2)用复合盐调节处理后蛋白酶K溶液的pH值至6.8，得到蛋白印迹膜再生液，复合盐为物质的量之比为1:1的氯化钠与氯化钙混合而成。
实施例4：
(1)取浓度为0.1mg/ml蛋白酶K溶液1ml，置于试管内，将盐酸胍加入蛋白酶K溶液中，使得蛋白酶K溶液内盐酸胍的浓度为3mol/L，于25℃保温12h，得到处理后蛋白酶K溶液；
(2)用复合盐调节处理后蛋白酶K溶液的pH值至6.3，得到蛋白印迹膜再生液，复合盐为物质的量之比为1:1的氯化钠与氯化钙混合而成。
对比例1：
采用0.1mg/ml的蛋白酶K溶液1ml，与复合盐溶液混合配置，复合盐溶液为氯化钠和氯化钙1:1配置的溶液，调节pH值为6.5，得到蛋白印迹膜再生液，作为对照组。
对比例2：
采用复合盐溶液混合配置，复合盐溶液为氯化钠和氯化钙1:1配置的溶液，调节pH值为6.5，得到蛋白印迹膜再生液，作为空白对照组A。
实验例1：
该实验例考察了处理后蛋白酶K溶液内盐酸胍的浓度对洗脱率和吸附容量的影响。
1、血红蛋白印迹膜的制备：配制pH值为8的磷酸盐缓冲液(PBS)，称取194mg的丙烯酰胺和6mg的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺并溶于PBS中，待充分溶解后，向内加入浓度为10- 4mol/L的血红蛋白溶液，混合均匀后，依次加入的过硫酸铵和催化剂TEMED，得到混合物，将混合物迅速均匀的灌注在电泳装置的两玻璃板1mm的间隙之间，静置60min，凝胶聚合完全后，得到血红蛋白印迹膜(MIP)。
2、洗脱和重吸附效果的测定：将做好的MIP从电泳装置上取出，采用PBS进行震荡清洗，随后打成相同大小的圆片，将其放入干净的六孔板中，再分别不同的蛋白印迹膜再生液；具体如下：
对照组：采用的是对比例1制得的蛋白印迹膜再生液；
空白对照组A：采用的是对比例2制得的蛋白印迹膜再生液；
实验组A、实验组B、实验组C、实验组D、实验组E、实验组F、实验组G、实验组H、实验组I：按照实施例1的方法制备蛋白印迹膜再生液，所不同的是处理后蛋白酶K溶液内盐酸胍的浓度分别为1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5mol/L。
将六孔板放入控温摇床中40℃，60r/min震荡12h后，取出六孔板用去离子水清洗5次，配置BCA工作液，将洗脱前和洗脱后的MIP放入二十四孔板中，加入BCA工作液，37℃下放置30min，取出印迹膜，分别取200μl于96孔板中，在酶标仪上测定540nm处的吸光度值，并用R％＝(C0-Ce)/C0(C0-洗脱前印迹膜上的蛋白浓度，Ce-洗脱后印迹膜上的蛋白浓度)计算洗脱率，将洗脱前的MIP作为空白对照组B；
吸附量的测定，将洗脱后的实验组A-L，对照组以及空白对照组A中加入1ml血红蛋白溶液，4℃静置吸附3h，进行重结合处理，冲结合完成后，取出孔中溶液在紫外分光光度计中测量其吸光度值，根据公式Q＝(C0-Ct)V/S(C0-初始蛋白浓度，Ct-不同时间的蛋白浓度，V-蛋白质溶液的体积，S-印迹膜的面积)计算不同洗脱条件下的吸附容量，结果见表1。
Figure BDA0003290628000000051
Figure BDA0003290628000000061
通过洗脱效果的测定，能够看出实验组A-I中采用的盐酸胍的浓度是依次升高的，在结果中也能够看出，随着盐酸胍的浓度升高，洗脱效率也在逐渐降低，直到盐酸胍的浓度达到4.5mol/L时，洗脱率处于较低的状态，当盐酸胍的浓度达到5mol/L时，洗脱率直接降低至接近空白对照组B的状态，这是由于高浓度的盐酸胍能够迅速破坏蛋白酶K的酶活性中心空间构象，使蛋白酶K迅速失活，从而降低其洗脱率；
而实验组A的洗脱率与对照组较为接近，而实验组B的洗脱率略高于实验组A，这是由于低浓度的盐酸胍对蛋白酶K的活性具有一定的促进作用，当2.5mol/L时；
实验组J-L当中，实验组K和实验组E较为接近，而实验组J和实验组L的洗脱率略低一点，这是由于微酸环境下蛋白印迹膜的具有较好的渗透量，从而能够加快洗脱处理速率，也使再生液具有较好的洗脱效果。
通过吸附容量的测定，能够看出实验组A-I中采用的盐酸胍的浓度是依次升高的，在结果中也能够看出，随着盐酸胍的浓度升高，吸附容量呈先升高后降低的趋势，直到盐酸胍的浓度达到2.5mol/L时，洗脱率开始升高，至3mol/L时升至最高，这是由于在洗脱过程中蛋白酶K的活性降低，使MIP内留下较多的识别位点，从而能够达到较好的重吸附量，而实验组A和实验组B中由于洗脱后，残留了部分小片段多肽，影响了印记空穴对模板蛋白的重结合作用，当盐酸胍的浓度达到5mol/L时，洗脱率直接降低至接近空白对照组B的状态，从而使空余的结合位点较少，结合率较低；
实验组J-L当中，洗脱液的微酸性环境仅仅能够在洗脱的过程中影响MIP的渗透率，当MIP脱离洗脱液的环境后则失去对MIP的影响，从而不影响其吸附容量。
本发明提供的蛋白印迹膜再生液与重新电泳，转膜相比，不仅节省样品、材料和时间还可以消除重新上样带来的误差，增强试验的可比性，解决了完成一抗二抗结合和后续的化学发光检测后，还需检测其他蛋白的问题，本发明采用的低活性的蛋白酶K解离膜上的抗原与抗体的结合，且能够减少对转移到膜上的抗原蛋白产生影响，使同一张膜能够采用不同种类的抗体进行下一轮蛋白印记检测，且通过对再生液pH值的调节能够改善蛋白印迹膜在洗脱过程中的渗透压，从而具有比较好的效果和洗脱效率。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本专利涵盖范围之内。

Claims (7)

1.一种蛋白印记膜再生液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)采用盐酸胍处理蛋白酶K溶液，得到处理后蛋白酶K溶液；
2)将处理后蛋白酶K与复合盐溶液混合配置，调节pH值，得到蛋白印迹膜再生液。
2.根据权利要求1所述的一种蛋白印记膜再生液的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述处理后蛋白酶K溶液内盐酸胍的浓度为2.5-4.5mol/L。
3.根据权利要求2所述的一种蛋白印记膜再生液的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述处理步骤为将盐酸胍加入蛋白酶K溶液中，于20-30℃保温10-15h。
4.根据权利要求1所述的一种蛋白印记膜再生液的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述pH值为6-6.8。
5.根据权利要求1所述的一种蛋白印记膜再生液的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述蛋白酶K溶液中，蛋白酶K的浓度为0.1mg/ml。
6.根据权利要求1所述的一种蛋白印记膜再生液的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述复合盐溶液为氯化钠、氯化钙的混合溶液。
7.根据权利要求6所述的一种蛋白印记膜再生液的制备方法，其特征在于：所述氯化钠与氯化钙物质的量之比为1:1-1:2。
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