CN113736898A

CN113736898A - 水稻抽穗期调控基因OsGI的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN113736898A
Application number: CN202110911171.XA
Authority: CN
Inventors: 马孝松; 刘鸿艳; 罗利军; 李恩熙
Original assignee: SHANGHAI AGROBIOLOGICAL GENE CENTER
Current assignee: SHANGHAI AGROBIOLOGICAL GENE CENTER
Priority date: 2021-08-09
Filing date: 2021-08-09
Publication date: 2021-12-03

Abstract

本发明公开了一种水稻抽穗期调控基因OsGI的分子标记及其应用，通过设计OsGI基因的InDel分子标记，不存在遗传交换，准确性高；由于扩增片段酶切后存在较大的差异，可以直接用于琼脂糖电泳检测，更为方便；且属于共显性标记，可以鉴定纯合和杂合个体，缩短育种周期，提高育种效率。

Description

水稻抽穗期调控基因OsGI的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一个水稻抽穗期调控基因OsGI的分子标记及其应用的分子标记及其应用。

背景技术

水稻是全世界近一半人口的主粮，同时，也是我国最重要的粮食作物。水稻的生育期(或者抽穗期)是影响水稻产量的重要因素之一。所以在育种过程中我们需要根据目标种植环境选种不同生育期的品种进行种植才能保证水稻高产稳产。

水稻生育期(或者抽穗期)是典型的数量性状，受多基因控。分子标记辅助选择是一种利用与抽穗期基因紧密连锁标记或者基因内功能标记，在后代中结合基因型和表型鉴定对目标性状进行选择的现代育种技术。

为了大大缩短水稻抽穗期的育种年限、提高育种效率，节约大量的人力与物力成本，有必要找到一种水稻抽穗期调控基因的分子标记将其应用于水稻育种中。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种水稻抽穗期调控基因OsGI的分子标记、及其正反引物与应用。具体技术方案如下：

本发明提供了一种水稻抽穗期调控基因OsGI的分子标记，所述分子标记为OsGI_InDel_255，用于扩增所述分子标记的引物的核苷酸序列如下：

OsGI_InDel_255F：5’-GTATCATCGTACAAAAGGCAGGT-3’，SEQ ID NO.1；

OsGI_InDel_255R：5’-GACGACAAGCATACAGAGACTCC-3’SEQ ID NO.2。

进一步地，所述分子标记位于水稻基因组第1号染色体。

进一步地，所述水稻抽穗期调控基因OsGI的分子标记由核苷酸序列为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2的引物对在基因组位置上下游300bp内扩增得到。

本发明还提供了所述水稻抽穗期调控基因的应用。具体技术方案如下：

所述的分子标记在水稻抽穗期的检测和/或预测中的应用，和/或所述的分子标记在水稻育种中的应用。

在其中一些实施例中，所述水稻育种包括：调控水稻抽穗期育种：选择晚抽穗水稻或早抽穗水稻；和/或

在其中一些实施例中，所述水稻育种包括：鉴定水稻抽穗期调控基因OsGI的基因型，缩短水稻育种周期。

本发明还提供了一种使用水稻抽穗期调控基因OsGI的分子标记基因型鉴定及水稻育种的方法，包括以下步骤：

(1)提取供试水稻样品基因组DNA；

(2)利用核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对步骤1)中所提取基因组进行PCR扩增，获得扩增产物；

(3)琼脂糖检测扩增产物；

如果有328bp的单条带，则表示所述样品为早抽穗品种；如果有583bp的单条带，则表示所述样品为晚抽穗品种；如果有328bp和583bp两条带，则表示所述样品为OsGI杂合基因型。

在其中一些实施例中，所述PCR扩增的扩增体系包含：Taq酶，模板DNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的引物，PCR buffer。

在其中一些实施例中，所述PCR扩增的PCR反应程序为：95±1℃预变性4-6min，然后按98±1℃28-32s，52±1℃下28-32s，72±1℃下28-32s进行30-35个循环，最后72±1℃下延伸4-6min。

本发明还提供了一种水稻抽穗期调控基因OsGI的鉴定试剂盒，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，所述引物用于扩增水稻抽穗期调控基因OsGI的分子标记，所述分子标记为OsGI_InDel_255。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明通过设计OsGI基因的InDel分子标记，不存在遗传交换，准确性高；由于扩增片段酶切后存在较大的差异，可以直接用于琼脂糖电泳检测，更为方便；且属于共显性标记，可以鉴定纯合和杂合个体，缩短育种周期，提高育种效率。

OsGI属于生物钟基因，可以调控水稻的抽穗期，OsGI早抽穗等位基因型主要来源于籼型水稻品种，OsGI晚抽穗等位基因型主要来源于粳型水稻品种。可以通过分子标记辅助选择技术选择OsGI不同等位基型调控水稻抽穗期以适应不同纬度的种植，扩大优良品种的种植范围。

附图说明

图1是本发明中分子标记OsGI_InDel_255对9个水稻品种的电泳检测图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

下面通过实施例对本发明进行水稻抽穗期调控基因OsGI的分子标记及其应用做进一步说明及详细介绍：

实施例1水稻抽穗期调控基因OsGI分子标记的开发

(1)供试材料：早抽穗品种：珍汕97B；晚抽穗品种：IRAT109。

(2)水稻基因组DNA提取方法：在研钵中，取15mg水稻叶片，加入适量的液氮，将水稻叶片研磨成粉末，加入400μL 1.5×CTAB(1.5％CTAB,75mmol/L Tris-HCl,15mmol/LEDTA,1.05mol/L NaCl,pH＝8.0)研磨成匀浆，再加入400μL1.5×CTAB，吸取研磨液至1.5ml离心管中，加入560μL氯仿，混匀，12000r/min离心15min，取上清至另一离心管，加入预冷的等体积异丙醇，12000r/min离心5min，去上清，干燥沉淀物，最后加入100μL ddH₂O溶解即可。

(3)基因分子标记OsGI的开发：OsGI位于第1号染色体，在日本晴参考基因组收录号为AK072166。

(4)设计引物OsGI_InDel_255，其正反引物序列为：

OsGI_InDel_255F：5’-GTATCATCGTACAAAAGGCAGGT-3’(SEQ ID NO.1)；

OsGI_InDel_255R：5’-GACGACAAGCATACAGAGACTCC-3’(SEQ ID NO.2)。

(5)利用功能标记OsGI_InDel_255对供试水稻品种IRAT109与珍汕97B进行PCR扩增，PCR扩增体系为：20ng/μL水稻基因组DNA模板1μL，10uL2×Taq Master mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，10uM的前后引物各0.5uL，补充dd H₂O至20uL。PCR反应程序为：95℃预变性5min，然后按98℃30s，52.5℃下30s，72℃下30s进行32个循环，最后72℃下延伸5min。

(6)取PCR产物6uL上样于1％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示，第1泳道为籼型水稻品种珍汕97B，条带大小分328bp；第2泳道为粳型水稻品种IRAT109的PCR产物，条带大小为583bp；第3泳道为珍汕97B/IRAT109杂种F1的PCR产物，两条带大小分别为328bp和583bp。从图1可以看出电泳条带清晰，差异明显。

(7)电泳切胶带回收/测序。胶回收使用北京全式金生物技术有限公司的胶回收试剂盒(离心柱型，产品目录号：EG101-02)，测序由上海博尚生物技术有限公司完成。测序结果见表1。

IRAT109：(SEQ ID NO.3)

珍汕97B(SEQ ID NO.4)

GTATCATCGTACAAAAGGCAGGTATGCAGTGTTTCCTGCACCTACTTGCTACCTATTCTGTATTTGATGTATTCAATTTCCTTTTTATCAGTTTTCTCGAAATATATGCTAATAGGCTTGTCACTAAACGGCTACATTATCCAGACTCTGTTCTGAATTTTTTTTTCATTAAGTACTGTTAGCTGCCAGATTACATCATCATGACTAAAGTAGTTTAGCTACAATATTGCAAAGCTAGATTTGTCTAGCCTCTATTGTTTTGAATAGAAAATTAAATCTTTTGGTCATTTTTTTGTAACCTTTTAGGAGTCTCTGTATGCTTGTCGTC

实施例2：OsGI_InDel_255分子标记的亲本多态性检测

(1)提取供试水稻品种基因组，提取方法同实施例1。供试水稻品种分别为：秀水115、湘晴、特青、II-32B、绿旱1号、秀水123。

(2)PCR扩增，同实施例1。

(3)电泳检测，同实施例1。结果如图1所示，秀水115(第4泳道)、湘晴(第5泳道)、特青(第6泳道)、II-32B(第7泳道)、绿旱1号(第8泳道)、秀水123(第9泳道)；M表示D2000Marker。

其中，水稻品种珍汕97B(籼稻，抽穗期＝59天)、IRAT109(粳稻，抽穗期＝75天)、珍汕97B/IRAT109杂种F1抽穗期＝70天)、秀水115(粳稻，抽穗期＝105天)、湘晴(粳稻，抽穗期＝98天)、特青(籼稻，抽穗期＝77天)、II-32B(籼稻，抽穗期＝78天)、绿旱1号(籼稻，抽穗期＝68天)、秀水123(粳稻，抽穗期＝108天)。

实施例3：OsGI_InDel_255分子标记的验证与应用

(1)利用OsGI基因分子标记OsGI_InDel_255对水稻早抽穗品种珍汕97B与晚抽穗品种IRAT109的杂种F1代单株基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物在1％的琼脂糖凝胶进行电泳分型，在杂种F₁单株中检测到有328bp和583bp两条带，说明该检测样品为OsGI杂合基因型，表明OsGI_InDel_255可以用于杂种F1的鉴定，检测样品为OsGI基因杂合基因型。

(2)利用OsGI基因分子标记OsGI_InDel_255对176个IRAT109/珍汕97B的F₁₂代重组自交系的基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物在1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，分别有75个株系含有珍汕97B的等位基因型(328bp条带)、101个株系含有与IRAT109一致的等位基因型(583bp条带)，抽穗期鉴定结果表明，含有珍汕97B等位基因型的株系平均抽穗期为76.1天，含有IRAT109等位基因型的株系平均抽穗期为80.5天。含有珍汕97B等位基因型的株系抽穗期显著早于IRAT109等位基因型的株系抽穗期(P＜0.05)。

(3)利用OsGI基因分子标记OsGI_InDel_255对223份水稻种质资源的基因组DNA进行OsGI基因型鉴定，产物在1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，发现在147份种质资源中为328bp带型，76份种质资源为两条带,条带大小分别为583bp，含328bp的水稻种质资源抽穗期平均值为79.8天，含有583bp的水稻种质资源抽穗期平均值为83.8天。含有583bp的水稻种质资源的抽穗期显著晚于含有328bp的水稻种质资源(P＜0.05)。

(4)因此表明可以利用分子标记OsGI_InDel_255进行水稻抽穗期基因OsGI的鉴定和/或水稻抽穗期的分子标记辅助选择育种。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 上海市农业生物基因中心

<120> 水稻抽穗期调控基因OsGI的分子标记及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtatcatcgt acaaaaggca ggt 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacgacaagc atacagagac tcc 23

<210> 3

<211> 583

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

gtatcatcgt acaaaaggca ggtatgcagt gtttcctgca cctacttgct acctattctg 60

tatttgatgt attcaatttc ctttttatca gttttctcga aatatatgct aataggcttg 120

tcactaaacg gctacattat ccagactctg ttctgaattt ttttttcatt aagtactgtt 180

agctgccaga ttacatcatc atgactaaag tagtttagct acaatattgc aaagctagat 240

ttgtctagcc tctattgttt tgaatagaaa aggcaggtat gcagtgtttc ctgcacctac 300

ttgctaccta ttctgtattt gatgtattca atttcctttt tatcagtttt ctcgaaatat 360

atgctaatag gcttgtcact aaacggctac attatccaga ctctgttctg aatttttttt 420

tcattaagta ctgttagctg ccagattaca tcatcatgac taaagtagtt tagctacaat 480

attgcaaagc tagatttgtc tagcctctat tgttttgaat agaaaattaa atcttttggt 540

catttttttg taacctttta ggagtctctg tatgcttgtc gtc 583

<210> 4

<211> 328

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

gtatcatcgt acaaaaggca ggtatgcagt gtttcctgca cctacttgct acctattctg 60

tatttgatgt attcaatttc ctttttatca gttttctcga aatatatgct aataggcttg 120

tcactaaacg gctacattat ccagactctg ttctgaattt ttttttcatt aagtactgtt 180

agctgccaga ttacatcatc atgactaaag tagtttagct acaatattgc aaagctagat 240

ttgtctagcc tctattgttt tgaatagaaa attaaatctt ttggtcattt ttttgtaacc 300

ttttaggagt ctctgtatgc ttgtcgtc 328

Claims

1.水稻抽穗期调控基因OsGI的分子标记，其特征在于，所述分子标记为OsGI_InDel_255，用于扩增所述分子标记的引物的核苷酸序列如下：

OsGI_InDel_255F：5’-GTATCATCGTACAAAAGGCAGGT-3’，SEQ ID NO.1；

OsGI_InDel_255R：5’-GACGACAAGCATACAGAGACTCC-3’SEQ ID NO.2。

2.根据权利要求1所述的水稻抽穗期调控基因OsGI的分子标记，其特征在于，所述分子标记位于水稻基因组第1号染色体。

3.根据权利要求1或2所述的水稻抽穗期调控基因OsGI的分子标记，其特征在于，所述水稻抽穗期调控基因OsGI的分子标记由核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物对在基因组位置上下游300bp内扩增得到。

4.权利要求1-3任一项所述的分子标记在水稻抽穗期的检测和/或预测中的应用。

5.权利要求1-3任一项所述的分子标记在水稻育种中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述水稻育种包括：

(1)调控水稻抽穗期育种：选择晚抽穗水稻或早抽穗水稻；和/或

(2)鉴定水稻抽穗期调控基因OsGI的基因型，缩短水稻育种周期。

7.一种使用水稻抽穗期调控基因OsGI的分子标记基因型鉴定及水稻育种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取供试水稻样品基因组DNA；

2)利用核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对步骤1)中所提取基因组进行PCR扩增，获得扩增产物；

3)琼脂糖检测扩增产物；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的扩增体系包含：Taq酶，模板DNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，PCR buffer。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的PCR反应程序为：95±1℃预变性4-6min，然后按98±1℃28-32s，52±1℃下28-32s，72±1℃下28-32s进行30-35个循环，最后72±1℃下延伸4-6min。

10.一种水稻抽穗期调控基因OsGI的鉴定试剂盒，其特征在于，包括：核苷酸序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，所述引物用于扩增水稻抽穗期调控基因OsGI的分子标记，所述分子标记为OsGI_InDel_255。