CN113727724A - 用于治疗和/或预防口咽念珠菌病的酿酒酵母菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗和/或预防口咽念珠菌感染的保藏号I‑3856的酵母菌株酿酒酵母。表明该菌株具有降低口腔中活真菌以及预防念珠菌感染传播至食道、胃和小肠的强大能力。

Description

用于治疗和/或预防口咽念珠菌病的酿酒酵母菌株
母申请
本专利申请要求于2018年12月17日提交的申请号FR 18 73107的法国专利申请的优先权。该法国专利申请的内容通过引用以其整体并入。
技术领域
本发明涉及念珠菌引起的口咽感染领域。更特别地，本发明涉及用于治疗和/或预防口腔和口咽念珠菌病的酿酒酵母的特定菌株。
背景技术
口咽念珠菌病是一种非常常见的粘膜感染，在大多数情况下由真菌白色念珠菌引起，尽管其他物种，例如光滑念珠菌、假热带念珠菌、克柔念珠菌、帕拉克柔念珠菌和吉利蒙念珠菌也可能是这种霉菌病的原因。白色念珠菌以次要方式定植于健康受试者的口腔菌群，而不会引起感染。但是，当这种真菌增殖时，它会引起念珠菌病，其表现为口腔粘膜刺激，伴有发红甚至溃疡。有时，发白、或多或少的糊状斑点可能会出现在舌头、上颚以及有时口咽上。口腔或口咽念珠菌病可能妨碍说话、进食和生活质量。
在由于免疫系统不成熟的18个月以下的儿童和唾液流量减少导致口干的个体(如老年人)和唾液出现之前的出生至2个月的婴儿中观察到口咽念珠菌病的流行。也存在许多促进口咽念珠菌病发生的因素，如局部因素(如长期佩戴矫正或修复装置)；全身因素，例如免疫功能低下状态(例如与干燥综合征、HIV感染、不受控制的糖尿病、某些内分泌失调、营养不良或吸收不良(如维生素B缺乏症)相关)；以及与药物相关的副作用(例如用广谱抗生素治疗、全身或局部使用皮质类固醇、施用安定药、免疫抑制剂治疗、化疗或放疗、用质子泵抑制剂(PPI)或H2抗组胺药治疗)。
可用于口咽念珠菌病患者的治疗主要限于使用抗真菌药。大多数患者优选以锭剂、口服混悬液或口服凝胶形式的局部治疗(在口腔水平)。但是，在某些情况下，特别是对于免疫抑制的人或在局部治疗失败、复发或旧感染的情况下，通过口服途径或通过注射施用的全身治疗可能是必要的。
迄今为止，主要用于治疗口咽念珠菌病的抗真菌药是多烯大环内酯类(制霉菌素、两性霉素B)和/或唑类(咪康唑、氟康唑)。尽管这些药物通常耐受性良好，但它们与重要的缺点相关。因此，对大多数念珠菌分离株有效的多烯(如两性霉素B)，趋于具有高水平的肾毒性，并且必须避免将它们与其他药物(如降血钾药物或肾毒性药物)组合。此外，唑类抗真菌药具有常见的副作用，例如肝毒性(细胞溶解、胆汁郁积)和消化系统疾病(恶心、呕吐、腹泻)。三唑类抗真菌药(如氟康唑)在怀孕期间禁用，因为它们具有致畸作用。此外，由于唑类在不同程度上都是CYP450同工酶的酶抑制剂，它们会引起许多药物相互作用。此外，它们本身经受代谢现象，因此也是药物相互作用的靶标。
最后，与使用这些抗真菌剂有关的一个主要问题是越来越多的白色念珠菌耐药菌株的出现(Kelly et al.,Lancet,1996,348:1523-1524)。此外，由于可用的抗真菌剂针对真菌膜的“麦角甾醇”部分(在多烯的情况下)或针对参与该麦角甾醇生物合成的酶(在唑类的情况下)，还存在交叉耐药风险(Kelly et al.,FEBS Lett.,1997,400:80-82；White etal.,Clin.Microbiol.Rev.,1998,11:382-402)。
因此，仍然需要用于治疗和/或预防口腔或口咽念珠菌病的新策略。
发明简述
本发明人惊奇地发现，于2007年10月17日以保藏号I-3856保藏于CNCM(国家微生物培养物保藏中心，25rue du Docteur Roux，75724Paris Cedex 15，France)的酿酒酵母菌株能够有效减少口咽念珠菌病小鼠动物模型口腔中白色念珠菌的载量，从而防止感染扩散到食道、胃和小肠。当用于处理小鼠的酿酒酵母I-3856为活酵母形式或灭活酵母形式时，观察到口腔中白色念珠菌的真菌生长的抑制。当酿酒酵母I-3856的细胞壁用于处理小鼠时，也观察到口腔中白色念珠菌的生长的抑制。活形式的酿酒酵母I-3856的有益作用结合了通过白色念珠菌的强聚集的机械作用和通过调节白色念珠菌毒力因子的生物作用，例如抑制粘附素或抑制菌丝转变，这防止真菌细胞粘附到口腔上皮细胞，而灭活酵母和细胞壁形式的酿酒酵母I-3856的作用主要是由于通过白色念珠菌的强聚集的机械作用，这防止真菌细胞粘附到口腔上皮细胞。所有这些作用导致加速清除白色念珠菌，导致炎症反应较弱，或甚至不存在炎症反应。
因此，本发明涉及于2007年10月17日以保藏号I-3856保藏于CNCM的酿酒酵母菌株，其用于预防和/或治疗口咽念珠菌病。
在某些实施方案中，预防和/或治疗口咽念珠菌病的方法中使用的保藏号I-3856的酿酒酵母菌株为活形式或灭活形式。
在某些实施方案中，预防和/或治疗口咽念珠菌病的方法中使用的保藏号I-3856的酿酒酵母菌株是干酵母，特别是活性干酵母形式。
在某些实施方案中，预防和/或治疗口咽念珠菌病的方法中使用的保藏号I-3856的酿酒酵母菌株为分级形式。分级形式可以选自所述酵母的细胞壁、所述酵母的壁β-葡聚糖、所述酵母的壁甘露糖蛋白、所述酵母的提取物、以及它们的任何组合。
本发明还涉及用于预防和/或治疗口咽念珠菌病的药物组合物，所述药物组合物包含有效量的保藏号I-3856的酿酒酵母菌株和至少一种生理学上可接受的赋形剂。存在于药物组合物中的保藏号I-3856的酿酒酵母菌株可以是以上定义的任何形式。
在某些实施方案中，药物组合物旨在用于局部施用或通过口服途径施用。
在某些实施方案中，药物组合物进一步包含至少一种具有舒缓、抗刺激、镇痛、抗炎、愈合、抗生素、解热或抗真菌活性的额外活性药物成分。
在某些实施方案中，药物组合物的形式是牙膏、漱口水、口腔喷雾、口腔乳膏或凝胶、口腔分散条、锭剂、可直接撒在口腔中的粉末、装有按钮塞的小瓶、口腔分散棒或待在水中稀释的棒。
在某些实施方案中，旨在用上文定义的任何形式的保藏号I-3856的酿酒酵母菌株或上文定义的药物组合物预防或治疗的口咽念珠菌病是医学治疗，特别是用广谱抗生素治疗、全身或局部使用皮质类固醇、施用安定药、免疫抑制剂治疗、化疗或放疗、用质子泵抑制剂(PPI)或用H2抗组胺药治疗的副作用。
在其他实施方案中，口咽念珠菌病在免疫功能低下状态的患者中存在或易于发展，特别是与诸如干燥综合征、HIV感染、不受控制的糖尿病、某些内分泌失调、营养不良或吸收不良(如维生素B缺乏症)的疾病相关的免疫功能低下状态。
在某些实施方案中，口咽念珠菌病存在于婴儿或老年人中。
本发明还涉及上文定义的任何形式的株保藏号I-3856的酿酒酵母菌，或上文定义的药物组合物，其用于预防或抑制念珠菌感染扩散至口咽念珠菌病患者的食道、胃或小肠。
下文给出本发明某些优选实施方案的更详细描述。
发明详述
如上所述，本发明涉及一种能够减少口腔中白色念珠菌的载量并防止感染扩散到消化系统的其他器官(如食道、胃和小肠)的酿酒酵母菌株。因此，该菌株可用于治疗和/或预防口咽念珠菌病。
I-酿酒酵母菌株I-3856
表述“酵母菌株”表示相对同质的酵母细胞群体。从克隆获得酵母菌株，克隆是从单个酵母细胞获得的细胞群体。
可用于本发明上下文中的酿酒酵母菌株是本申请人于2007年10月17日以保藏号I-3856保藏于CNCM(National Collection of Cultures of Microorganisms,25rue duDocteur Roux,75724Paris Cedex 15,France)的菌株。
这种酿酒酵母菌株先前已由本申请人自己在WO 2009/103884中描述，其中提出它可用于预防和/或治疗肠道的病理、病症或疾病，包括由白色念珠菌的肠道定植引起的炎症；以及在文件WO 2014/009656和Cayzeele-Decherf等人的文章(Med.J.Obst.Gynec.,2017,5(4):1112)中描述，其中它被描述为有效控制念珠菌的阴道增殖和预防阴道或外阴阴道念珠菌病的复发。但是，应该指出的是，致病真菌和益生菌针对口咽粘膜的行为与针对阴道粘膜或肠粘膜采用的行为不可互换，特别是这些粘膜的环境不同。
在本发明的上下文中，保藏号I-3856的酿酒酵母菌株是通过培养(或增殖)起始菌株获得的酵母细胞形式。可以通过任何合适的方法进行酿酒酵母菌株培养。用于培养酿酒酵母菌株的方法是本领域已知的，本领域技术人员知晓如何根据其性质优化每个菌株的培养条件。酵母细胞可以如参考书“Yeast Technology”,2nd Edition,1991,Reed andNagodawithana,published by Van Nostrand Reinhold(ISBN 0-442-31892-8)”所述，例如通过在培养基中增殖保藏号I-3856的酿酒酵母菌株获得。
因此，例如，在工业规模上，可用于本发明上下文中的酿酒酵母细胞可通过包括以下步骤的方法获得：
-在培养基中分几个阶段培养保藏号I-3856的酿酒酵母菌株，首先在半厌氧条件下，然后在有氧条件下(富氧培养基/大气)，以获得起始酵母细胞的增殖；和
-通过离心分离由此产生的酵母细胞以获得含有12％-25％酵母干物质的液体酵母膏。
如此获得的酵母是活酵母。因此，在某些实施方案中，本发明上下文中使用的保藏号I-3856的酿酒酵母菌株是活酵母的形式。术语“活酵母”与“活性酵母”同义，表示具有代谢活性的酵母细胞群体。
本发明上下文中使用的活酵母菌株I-3856是干酵母的形式。干酵母的特征在于低含水量，并且通常包含大于90％的酵母干物质比例，优选包含93％-96％的干物质比例。干酵母的优点之一是其储存期长。
因此，用于制备保藏号I-3856的酿酒酵母的细胞的方法还可以包括随后干燥细胞的步骤，以获得干燥形式的酵母。所述干燥步骤可以是例如冷冻干燥(冻干)、流化床干燥或喷雾干燥。
在某些实施方案中，干活酵母菌株I-3856是活性干酵母或速溶干酵母的形式。
活性干酵母可以通过热(低温)和机械活动的联合作用通过使压缩或液体酵母脱水而获得，这使得可以将糊状产品(压缩或液体酵母)转化为球体形式的干产品。例如，活性干酵母通过挤压和流化床干燥压缩酵母或液体酵母而获得。
速溶干酵母可以通过在热空气梯度作用下使压缩或液体酵母脱水而获得，这使得可以将糊状产品(压缩或液体酵母)转化为细干条。然后，为了保持稳定，速溶干酵母必须在不存在氧气的情况下包装。
在其他实施方案中，本发明上下文中使用的保藏号I-3856的酿酒酵母菌株是灭活酵母(与活酵母相反)的形式。本文中不加区别地使用的术语“灭活酵母”和“失活酵母”表示不再存活的酵母(因此是死酵母)，即其代谢已不可逆转地停止的酵母。
根据本发明的灭活酵母可以通过任何合适的方法获得。本领域技术人员熟悉的合适技术包括酵母的热处理、由使酵母经历若干个连续的冷冻和解冻循环组成的处理、辐射处理、喷雾处理或这些处理的任何组合。灭活酵母通常呈干燥形式。
在另一个实施方案中，在本发明的上下文中使用的是保藏号I-3856的酿酒酵母的细胞的衍生物或级分，所述衍生物或所述级分选自下组：所述酵母细胞壁、所述酵母细胞的壁葡聚糖、所述酵母细胞的壁甘露糖蛋白、所述酵母细胞的滤液或提取物以及它们的任意组合。
术语“酵母细胞壁”和“酵母壳”在本文可互换使用，表示酵母细胞的不溶性级分，即酵母壁和质膜。
术语“酵母滤液”和“酵母提取物”在本文可互换使用，表示酵母细胞的可溶性级分，即除酵母壁和质膜之外的所有物质。
通常，酵母壳或酵母提取物通过包括以下的方法获得：主要通过蛋白酶的自溶或酶水解步骤，然后是将可溶性级分与不溶性级分分离的步骤，分离的不溶性级分对应于酵母壳并且可溶性级分对应于酵母提取物。然后，可以干燥不溶性级分和/或可溶性级分。获得酵母壳的方法是保留细胞壁的结构多糖，即β-葡聚糖和甘露聚糖，这些甘露聚糖以甘露糖蛋白的形式存在。获得酵母壳和酵母提取物的方法是本领域已知的(例如，参见工具书"Yeast Technology",2nd edition,1991,G.Reed and T.W.Nogodawithana,published byVan Nostrand Reinhold,New York,ISBN 0-442-31892-8)。
酵母壳可以是液体形式、干燥形式或粘性形式。当它们的干物质含量为至少85％时，它们被认为是干燥形式。相反，如果它们的干物质含量小于20wt％，则它们被认为是液体形式。从20wt％至低于85wt％干物质开始，酵母外壳被认为是粘性形式。酵母壳优选以干燥形式使用。
酵母提取物可为干燥形式，优选为水溶性细粉形式、液体形式或糊状形式。当其干物质含量为至少85％时，酵母提取物被认为是干燥形式。如果其干物质含量低于70wt％，则它被认为是液体形式。从70wt％至低于85wt％干物质开始，酵母提取物被认为是糊状形式。所用酵母提取物优选为干燥形式，更优选为水溶性细粉形式。酵母提取物主要包含蛋白质材料，优选至少55％的蛋白质材料。
术语“壁β-葡聚糖”表示酵母细胞壁的β-葡聚糖，其本质上是葡萄糖聚合物，其主链的葡萄糖单元通过β-1,3键连接在一起，并且其支链通过β-1,6键连接在一起。酵母的β-葡聚糖不溶并且具有低粘度。本领域技术人员知晓如何从酵母细胞壁提取β-葡聚糖。一种常见的方法包括用碱和酸(例如乙酸)连续热提取，然后进行水洗涤操作以去除酵母壳的任何可溶性化合物，并回收由壁β-葡聚糖组成的不溶性物质。
术语“壁甘露糖蛋白”表示酵母多糖，更准确地是中性或酸性单糖(具有5或6个碳原子)的共聚物，其通过糖苷键连接在一起并与蛋白质结合。在酵母壁中，葡聚糖构成了其他葡聚糖、甲壳素和甘露糖蛋白共价结合在其上的网络。甘露糖蛋白通过含有5个甘露糖残基链的糖基磷酸与葡聚糖结合。本领域技术人员知晓如何从酵母细胞壁提取甘露糖蛋白。一种常见的方法包括用β-葡聚糖酶制剂(例如工业产品GLUCANEXTM)对酵母壁进行酶消化，然后通过离心分离水解产物，并通过超滤纯化。另一种方法是基于热化学提取。
II-酿酒酵母菌株I-3856在治疗和/或预防口咽念珠菌病中的用途
因此，本发明涉及用于治疗和/或预防口咽念珠菌病的保藏号I-3856的酿酒酵母菌株(以上述任一种形式)。本发明还涉及治疗和/或预防受试者口咽念珠菌病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的保藏号I-3856的酿酒酵母菌株的步骤。本发明还涉及保藏号I-3856的酿酒酵母菌株在制备用于治疗和/或预防口咽念珠菌病的药物中的用途。
在本发明的上下文中，“治疗”是指一种方法，其目的是：(1)延迟或预防疾病或临床病症的发作；(2)减缓或者停止疾病症状的发展、加重或者恶化；(3)改进疾病症状；和/或(4)治愈疾病。治疗可以在疾病开始之前进行，以起到预防作用(然后，将其称为“预防”)，或者可以在疾病发作之后进行治疗，以起到治疗作用。
本文中，术语“受试者”表示哺乳动物，更特别是指人，其有可能成为口腔念珠菌感染的受害者，但不必定具有口咽念珠菌病。术语“受试者”并不表示特定年龄，因此包括新生儿、儿童、青少年、成人和老年人。当受试者患有(即已被诊断为患有)口咽念珠菌病时，本文有时使用术语“患者”而不是“受试者”。
术语“口咽念珠菌病”表示由能够在易受感染的宿主中发展的由念珠菌属真菌，特别是白色念珠菌引起的口腔和/或口咽病变。
有若干种临床形式的口咽念珠菌病。一些患者只会患一种临床形式，而另一些患者则会患一种以上形式的口腔黏膜念珠菌病。这些形式包括：
-假膜性口腔念珠菌病，更广为人知称为鹅口疮，其特征在于口腔黏膜上存在类似白软干酪的粘性白色物质，斑块特征性地分布在口腔黏膜、上颚和舌背面。可以通过用刮舌器或干纱布摩擦来去除斑块。然后，基础粘膜正常或出现红斑。
-口腔红斑念珠菌病，其特征在于广泛的、界限清楚的萎缩性红斑斑块或斑点。这种念珠菌病比假膜性念珠菌病更常见；
-增生性口腔念珠菌病或角化念珠菌病，其特征在于刮擦时不会消失的白色斑块；
-口角炎或传染性口角炎(perlèche)，其特征在于嘴角有裂纹、脱屑和红斑；和
-正中菱形舌炎，其特征在于在轮廓乳头前的舌背面中线上的红色斑块或红白斑块。
通常非常令人回味的临床表现是足以诊断口咽念珠菌病。在临床表现不典型的情况下或在适当治疗后病变持续存在的情况下，有时需要通过真菌学检查进行生物学确认。它是通过在病变(白色病变、红斑斑块、传染性口角炎的沟)水平上用拭子取样来进行的。直接检查样品寻找出芽病原体和假丝(病原体形式)的存在。白色念珠菌在特定培养基上在24-48小时内生长，允许通过菌落数量的定量来鉴定病原体。
根据本发明的治疗和/或预防口咽念珠菌病的方法包括向受试者施用有效量的(上述形式之一)的保藏号I-3856的酿酒酵母菌株。可以以一剂或多剂施用的有效量可由医生确定。确切的施用量可以因患者而异，取决于患者的年龄、体重和一般状况、口咽念珠菌病的严重情况和/或程度等。施用的有效量也可根据所需的治疗效果(即预防口咽念珠菌病或治疗口咽念珠菌病)而变化。施用的有效量也可以根据所选择的施用途径(例如局部或全身)而变化。
例如，活干酵母形式的酵母I-3856的日剂量可以为1.107-1.1011CFU，优选1.109-5.1010CFU。术语CFU表示菌落形成单位。
例如，灭活形式的酵母I-3856的日剂量可以为1mg-10g，优选100mg-5g。
例如，酵母I-3856细胞壁的日剂量可以为0.5mg-5g，优选50mg-2.5g。
根据本发明的治疗方法可用于治疗口咽念珠菌病的首次发作或复发。在任何一种情况下，患者之前可能已用常用的抗真菌药或抗霉菌药治疗。或者，酵母I-3856可以是针对患者的首次治疗。
根据本发明的治疗方法可用于避免、减少、抑制或防止念珠菌引起的口腔或口咽感染扩散到消化系统的另一部分，例如食道、胃和小肠。
根据本发明的治疗方法还可用于预防患者的口咽念珠菌病，无论念珠菌病是首次发作还是复发。对于接受已知可促进念珠菌在口腔黏膜定植的药物治疗的患者，情况可能如此，例如使用广谱抗生素治疗、全身或局部使用皮质类固醇、施用安定药、免疫抑制剂治疗、化疗或放疗、用质子泵抑制剂(PPI)或用H2抗组胺药治疗。对于处于免疫功能低下状态的患者，例如与诸如干燥综合征、HIV感染、不受控制的糖尿病、某些内分泌失调、营养不良或吸收不良(例如维生素B缺乏症)相关的患者，情况也可能如此。某些老年患者也可能如此。
在某些实施方案中，根据本发明的治疗是单独施用的。换句话说，酵母I-3856是唯一待施用的试剂，可能的消毒漱口水除外。
在其他实施方案中，根据本发明的治疗与另一种疗法组合施用，例如施用常用抗真菌剂(如局部抗真菌剂)(例如制霉菌素作为待吮吸片剂或在口服溶液中，或口腔凝胶中的两性霉素B或咪康唑)或全身性抗真菌剂(例如片剂形式的氟康唑或酮康唑或伊曲康唑)。
III-药物组合物
如上所述，保藏号I-3856的酿酒酵母菌株可以原样(以上述各种形式之一)或以药物制剂或组合物的形式与至少一种生理学上可接受的赋形剂组合施用。因此，更具体地，根据本发明的药物组合物包含有效量的保藏号I-3856的酿酒酵母菌株和至少一种生理学可接受的赋形剂。根据本发明的药物组合物可分类为可通过处方或非处方获得的药物制剂。
在本发明的上下文中，“生理学上可接受的赋形剂”是指不干扰活性药物成分(本文中指，酿酒酵母菌株)的生物活性功效，并且在施用浓度下不会对患者或受试者产生过度毒性的任何介质或添加剂。生理学上可接受的赋形剂可以是适合施用于哺乳动物，特别是人的赋形剂。
根据本发明的药物组合物可以使用剂量和施用途径的任意组合施用，以有效获得所需的治疗/预防效果。已如上所述，待施用的确切量可能因患者而异，具体取决于年龄、体重、患者的一般情况、念珠菌感染的严重情况和程度。施用途径(局部或全身)可以根据念珠菌感染的严重性和程度和/或根据患者的年龄和/或健康状况来选择。
例如，本发明涉及如上定义的用于每日使用活干酵母形式的酵母I-3856的药物组合物，其量为1.107CFU-1.1011CFU，优选其量为1.109CFU-5.1010CFU，并且有效日剂量可以一剂、二剂或三剂施用。
作为实例，本发明涉及如上定义的用于每日使用灭活形式的酵母I-3856的药物组合物，其量为1mg-10g，优选100mg-5g，并且有效日剂量可以一剂、二剂或三剂施用。
作为实例，本发明涉及如上定义的用于每日使用的酵母I-3856的细胞壁的药物组合物，其量为0.5mg-5g，优选50mg-2.5g，并且有效日剂量可以一剂、二剂或三剂施用。
根据本发明的药物组合物的制剂可以根据组合物意欲使用的施用途径和剂量而变化。在用至少一种生理上可接受的赋形剂配制后，本发明的药物组合物可以为任何适合施用于哺乳动物，特别是人的形式，例如为锭剂、片剂、糖包衣丸剂、胶囊剂、糖浆珍珠、乳剂、软膏剂、糊剂、凝胶剂、粉剂、小袋剂、可注射溶液剂等的形式。本领域能够选择最合适的载体和赋形剂，从而制备给定类型的制剂。根据本发明的组合物可以进一步包含添加剂，诸如防腐剂、甜味剂、调味剂、增稠剂、着色剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、润滑剂等。
在某些实施方案中，根据本发明的药物组合物仅包含单一活性剂：酵母I-3856(或细胞壁)。特别地，所述药物组合物不包含另一种益生菌或益生菌的组合。
在其他实施方案中，根据本发明的药物组合物还包含至少一种额外的活性药物成分(即，除了酵母I-3856或细胞壁之外)。“活性药物成分”应理解为是指任何化合物或物质，其施用具有治疗效果，或者其施用对施用其的患者或受试者的健康或一般状况具有有益效果。
因此，活性药物成分可以对我们希望通过施用药物组合物预防或治疗的念珠菌引起的口腔粘膜感染具有活性；或者可以对与口咽念珠菌病相关的病症或症状(例如疼痛或发烧)具有活性；或可以增加药物组合物的活性成分的可用性和/或活性。
可存在于本发明组合物中的活性药物成分的实例包括但不限于具有舒缓、抗刺激、镇痛、抗炎、伤口愈合、抗生素、解热或抗真菌活性等(对酵母I-3856没有影响)的活性成分。
除非另有定义，本说明书中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。此外，本文提及的所有出版物、专利申请、专利和所有其他参考文献均通过引用并入。
具体实施方式
以下实施例描述了本发明的某些实施方案。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明性目的而呈现，而不以任何方式限制本发明的范围。
附图说明
图1：在感染后第+1、+3和+6天测量被BLI白色念珠菌感染并用不同化合物处理的小鼠口腔的总光子通量发射的量化。结果给出了3个不同实验中每组5只小鼠的平均值±SEM。≠,p<0.05(用FLU、GI或IY处理的感染小鼠对比用盐水溶液处理的感染小鼠)。
图2：在感染后第+6天对被BLI白色念珠菌感染并用不同化合物处理的小鼠进行体内成像。
图3：在感染后第+3天和第+6天进行的被白色念珠菌感染并用不同化合物处理的小鼠舌上的CFU计数。结果给出了3个不同实验中每组3只小鼠的平均值±SEM。≠,p<0.05(用FLU、GI或IY处理的感染小鼠对比用盐水溶液处理的感染小鼠)。
图4：在第+8天对(A)用不同化合物处理的未感染小鼠上进行的和(B)被BLI白色念珠菌感染并用不同化合物处理的小鼠上进行的组织学检查。
图5：在感染后第+6天进行的被BLI白色念珠菌感染并用不同化合物处理的小鼠的(A)食道中、(B)胃中和(C)十二指肠中的CFU计数。结果给出了3个不同实验中每组3只小鼠的平均值±SEM。≠,p<0.05(用FLU、GI或IY处理的感染小鼠对比用盐水溶液处理的感染小鼠)。
图6：在感染后第+6天进行(A)和在第+8天进行(B)的被BLI白色念珠菌感染并用不同化合物处理的小鼠食道和胃的离体成像。结果给出了3个不同实验中每组5只小鼠的平均值±SEM。≠,p<0.05(用FLU、GI或IY处理的感染小鼠对比用盐水溶液处理的感染小鼠)。
图7：舌上CFU计数。在舌感染后第+1、+3和+6天通过CFU测定评估感染后第+1、+2和+3天用10μl盐水溶液或氟康唑(FLZ–4mg/ml)或IY、GI或WG(均为100mg/ml)处理的感染小鼠舌的真菌载量。结果给出了2个不同实验中4-6只小鼠的平均值±SEM。≠,p<0.05(用FLZ、IY、GI或WG处理的感染小鼠对比用盐水溶液处理的感染小鼠)。
图8：IY、GI和WG对口咽念珠菌病期间SAP2、SAP6、ALS3和HWP1表达的影响。在感染后第+1、+2和+3天在用10μl盐水溶液或氟康唑(FLZ–4mg/ml)或IY、GI或WG(均为100mg/ml)处理的感染小鼠舌匀浆的细胞级分中分析基因(A)SAP2、(B)SAP6、(C)ALS3和(D)HWP1的表达。在感染后第3+天和第+6天，将舌匀浆离心，然后裂解细胞级分，提取总RNA并反转录为cDNA。通过实时PCR检测白色念珠菌的基因SAP2、SAP6、ALS3和HWP1，并在2-ΔΔCT中报告了相对于白色念珠菌接种物的转录物的cDNA量。结果给出了2个不同实验中4-6只小鼠的平均值±SEM。≠,p<0.05(用FLZ、IY、GI或WG处理的感染小鼠对比用盐水溶液处理的感染小鼠)。
图9：腹膜中性粒细胞的破坏活性。在感染后第3+天和第+6天评估感染后第+1、+2和+3天用10μl盐水溶液或氟康唑(FLZ–4mg/ml)或IY、GI或WG(均为100mg/ml)处理的未感染小鼠或感染小鼠的腹膜中性粒细胞的破坏活性。在白色念珠菌(CA-6)(1x105/ml)存在下将腹膜中性粒细胞(1x106/ml)孵育2小时。结果给出了2个不同实验中每组4-6只小鼠的平均值±SEM。≠,p<0.05(用FLZ、IY、GI或WG处理的感染小鼠对比用盐水溶液处理的感染小鼠)。
图10：IL-1β、TNF-α和IL-6的产生。在感染后第+1、+3和+6天通过ELISA针对(A)IL-1β、(B)TNF-α和(C)IL-6的存在测试在感染后第+1、+2和+3天用10μl盐水溶液或氟康唑(FLZ–4mg/ml)或IY、GI或WG(均为100mg/ml)处理的未感染小鼠或感染小鼠的舌匀浆上清液。结果给出了2个不同实验中每组4-6只小鼠的平均值±SEM。*，p<0.05(用盐水溶液处理的感染小鼠对比未感染小鼠)。≠,p<0.05(用FLZ、IY、GI或WG处理的感染小鼠对比用盐水溶液处理的感染小鼠)。
图11：IL-17A/F、IL-22和IL-23的产生。在感染后第+1、+3和+6天通过ELISA针对(A)IL-17A/F、(B)IL-22和(C)IL-23的存在测试在感染后第+1、+2和+3天用10μl盐水溶液或氟康唑(FLZ–4mg/ml)或IY、GI或WG(均为100mg/ml)处理的未感染小鼠或感染小鼠的舌匀浆上清液。结果给出了2个不同实验中每组4-6只小鼠的平均值±SEM。*，p<0.05(用盐水溶液处理的感染小鼠对比未感染小鼠)。≠,p<0.05(用FLZ、IY、GI或WG处理的感染小鼠对比用盐水溶液处理的感染小鼠)。
图12：IFN-α的产生。在感染后第+1、+3和+6天通过ELISA针对IFN-α的存在测试在感染后第+1、+2和+3天用10μl盐水溶液或氟康唑(FLZ–4mg/ml)或IY、GI或WG(均为100mg/ml)处理的未感染小鼠或感染小鼠的舌匀浆上清液。结果给出了2个不同实验中每组4-6只小鼠的平均值±SEM。*，p<0.05(用盐水溶液处理的感染小鼠对比未感染小鼠)。≠,p<0.05(用FLZ、IY、GI或WG处理的感染小鼠对比用盐水溶液处理的感染小鼠)。
实施例1：评估不同酵母产品在口咽念珠菌病动物模型中的活性
A.材料和方法
口咽念珠菌病动物模型。由于白色念珠菌不是实验室小鼠的共生物种，因此将由Solis和Filler(Nature Protoc.,2012,7(4):637-642)开发的用于获得模拟人假膜性口咽念珠菌病的可重复感染的程序用于野生型C57BL/6小鼠上。该程序包括注射醋酸可的松，这使小鼠容易受到念珠菌的口腔感染和白色念珠菌的感染。
更具体地，将6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(Charles River,Calco,Italy)保持在Perugia University(Italy)的动物屋中。从感染前一天开始，每隔一天用225mg/kg醋酸可的松(Sigma-Aldrich)处理小鼠，然后在皮下注射乙胺噻吩环己酮/唑拉西泮-甲苯噻嗪(50mg/kg/5mg/kg)混合物麻醉下(Mosci et al.,Virulence,2013,4:250-254)如前所述用1x106/ml BLI白色念珠菌悬液感染小鼠(Solis and Filler,Nature Protoc.,20125,7:637-642)。在感染前立即测试口腔，以确认之前不存在念珠菌物种(通过取口腔样品，将其涂在含有氯霉素(50μg/ml)(均来自Sigma-Aldrich)的YPD琼脂上)。
在没有特定病原体的条件(用敏感性测试被检测为不良感染的条件)下使用小鼠。根据欧洲实验动物科学协会联合会的标准，没有检测到感染。涉及动物及其护理的程序根据国家和国际法律和标准进行。所有动物实验均符合欧洲指令2010/63、用于实验目的或其他科学目的和国家法律116/92的脊椎动物公约的欧洲保护。该协议经Perugia大学伦理委员会批准用于动物护理和使用。所有动物均保持在Perugia大学的动物屋。小鼠在开始实验前适应环境1周。每笼最多包含5只小鼠，它们随意接受食物和水。
测试的产品。在本实施例中测试了活形式(GI)和灭活形式(IY)的酿酒酵母菌株I-3856。在感染后第+1、+2、+3和+6天小鼠接受经口注射(10μl)盐水溶液(0.9％NaCl，阴性对照)、氟康唑(FLZ–用作阳性对照的参考抗真菌剂)(4mg/ml)或GI和IY酵母产品(均为100mg/ml)。
念珠菌。使用带有融合产物ACT1p-gLUC59(gLUC59)的白色念珠菌CA1398菌株。白色念珠菌培养物通过在YPD琼脂(Y：酵母提取物，P：蛋白胨和D：无水葡萄糖-均来自Sigma-Aldrich)上的连续传代保持。通过将白色念珠菌的单菌落悬浮于盐水溶液中来收集真菌细胞，洗涤两次，使用血细胞计数器计数，并调节至所需浓度。
口腔中白色念珠菌感染的评估。
a.CFU测定。在感染白色念珠菌后第+3天和第+6天，通过在CHROMAgarTM平板(对念珠菌具有特异性和选择性的生长培养基)上涂抹稀释的舌匀浆来评估粘附在口腔上的白色念珠菌菌落数。然后，在30℃培养两天后计数白色念珠菌的活菌落。结果以Log CFU/g组织(或法语Log UFC/g)表示。
b.口腔中BLI念珠菌的成像。在感染后第+1、+3和+6天，小鼠接受10μl(0.5mg/ml，在1/10甲醇/H2O混合物中)的腔肠素(Synchem，OHM)，然后用2.5％异氟醚麻醉下使用IVIS-200TM系统(Xenogen Inc.)成像。在图像上，使用Living ImageR软件量化每只小鼠口腔(目标区域，ROI)的总光子通量发射。对于接受10μl腔肠素的未感染小鼠，未观察到发光(数据未显示)。
c.组织学检查。小鼠舌的组织学检查是感染后第+8天根据由Mosci et al.,Virulence,2013,4(3):250-254描述的方案进行。
感染扩散到食道、胃和肠道。
a.CFU测定。在感染白色念珠菌后第+6天，通过在CHROMAgarTM平板板上涂抹组织/器官匀浆稀释液来评估在感染扩散后在食道、胃和十二指肠中形成的白色念珠菌菌落数。结果以Log CFU/g组织(或法语Log UFC/g)表示。
b.BLI念珠菌的成像。在感染后第+6天和第+8天，切除胃管，并通过咽部将10μl(0.5mg/ml，在1/10甲醇/H2O混合物中)的腔肠素(Synchem，OHM)注射到食道腔内。然后，使用IVIS-200TM系统(Xenogen Inc.)对小鼠的食道和胃进行离体成像。在图像上，使用Living ImageR软件对每只小鼠的每个食道/胃系统(目标区域，ROI)的总光子通量发射进行量化。
统计分析。用Mann-Whitney U检验评估用FLU、GI或IY处理的感染小鼠与用盐水溶液处理的感染小鼠之间的差异。p<0.05的值被认为是显著的。
B.结果
口腔中白色念珠菌感染的评估。图1和图2显示了用各种化合物处理的感染小鼠的体内成像结果。这些结果表明，以其活形式(GI)和死形式(IY)的酿酒酵母菌株CNCM I-3856均能够显著减少真菌载量。有益效果类似于使用氟康唑(FLU–阳性对照)获得的效果。
在感染白色念珠菌后第+3天和第+6天评估的粘附在小鼠舌上的白色念珠菌菌落数证实了以其活形式(GI)和死形式(IY)的酿酒酵母菌株CNCM I-3856均能够显著减少真菌载量。有益效果类似于使用氟康唑(FLU–阳性对照)获得的效果(图3)。
对用两种酵母产品处理的未感染小鼠进行的组织学检查(图4(A))表明，用GI和IY处理的未感染小鼠的舌没有任何病变，并且没有观察到中性粒细胞的募集。对用各种化合物处理的感染小鼠进行的组织学检查(图4(B))表明，以其活形式(GI)和死形式(IY)的酿酒酵母菌株CNCM I-3856处理的感染小鼠的舌不具有任何由白色念珠菌引起的病变。有益效果类似于使用氟康唑(FLU–阳性对照)获得的效果。
感染扩散到食道、胃和十二指肠。在感染扩散后，在感染白色念珠菌后第+6天评估食道(图5(A))、胃(图5(B))和十二指肠(图5(C))中形成的白色念珠菌菌落数量。获得的结果表明，以其活形式(GI)的酿酒酵母菌株CNCM I-3856能够显著抑制真菌载量，而其死形式(IY)显示出减少食道和胃中真菌载量的趋势。GI的有益效果类似于使用氟康唑(FLU–阳性对照)获得的效果。感染后第+6天(图6(A))和第+8天(图6(B))食道和胃的离体成像证实以其活形式(GI)和死形式(IY)(较小程度)的酿酒酵母菌株CNCM I-3856防止感染在消化道中扩散。
C.结论
综合考虑，实施例1中获得的结果表明，无论是以其活形式(GI)和死形式(IY)的酿酒酵母菌株CNCM I-3856都能够显著降低真菌载量，从而防止其扩散到食道和胃。有益效果类似于使用氟康唑(阳性对照)获得的效果。
实施例2：酿酒酵母I-3856菌株对对白色念珠菌引起的口咽感染的免疫反应的影响
唾液是对抗念珠菌口腔感染的先天防御机制之一。唾液在牙齿和口腔上皮上形成薄膜。这种薄膜的主要成分是粘蛋白和免疫球蛋白A(IgA)，其可能聚集白色念珠菌，通过吞咽作用去除。此外，唾液含有生物活性剂，如具有杀真菌特性的组蛋白5、溶菌酶、乳铁蛋白和钙卫蛋白。尽管这些药剂以低浓度存在于唾液中，但它们的组合作用是加成或协同的。此外，唾液防御剂和唾液流动的动态效应的结合限制了白色念珠菌对口腔上皮的定植、增殖和侵袭，从而导致对白色念珠菌的固有口腔抵抗(Feller et al.,J.Oral.Pathol.Med.,2014,43:563-569)。
中性粒细胞和T细胞在抗念珠菌黏膜免疫中起重要作用。中性粒细胞通过氧化机制吞噬并杀死念珠菌细胞(Moyes et al.,Clin.Dev.Immunol.,2011,346307)。主要参与对念珠菌的口腔反应的T细胞是辅助T淋巴细胞(辅助T细胞，Th)Th1和Th17。Th1细胞产生IFN-γ，它是中性粒细胞的有效激活剂(Gattoni et al.,Clin.Ter.,2006,157:457-468)。在存在IL-6、IL-1β和TGF-β的情况下，T细胞分化为Th17，并在IL-23的刺激下成熟。Th17细胞产生IL-17A、IL-17F和IL-22。IL-17A和IL-17F刺激上皮细胞以产生抗菌肽并促进中性粒细胞的募集和激活，因此允许消除真菌。IL-22对上皮细胞具有与IL-17相似的作用并限制真菌生长(Hebecker et al.,Expert.Rev.Anti Infect.Ther.,2014,12:867-879；Moyes etal.,Clin.Dev.Immunol.,2011,346307)。
在实施例1中证明，酿酒酵母菌株保藏号I-3856，无论是活形式(GI)还是灭活形式(IY)，都能够减少口腔真菌载量，防止念珠菌感染扩散到食道和胃。在本实施例中，首先评估了WG(酿酒酵母菌株CNCM I-3856的细胞壁)减少口腔真菌载量的能力，然后测定口服IY、GI和WG是否能够影响口咽念珠菌病的真菌毒力因子和炎症反应。
A.材料和方法
白色念珠菌菌株和培养条件。使用了高毒力的白色念珠菌菌株(CA-6)(Bistoniet al.,Infect.Immun.,1986,51:6668-674)。白色念珠菌培养物通过在YPD琼脂(Y：酵母提取物，P：蛋白胨和D：无水葡萄糖-均来自Sigma-Aldrich)上的连续传代保持。通过将白色念珠菌的单菌落悬浮于盐水溶液中来收集真菌细胞，洗涤两次，使用血细胞计数器计数，并调节至所需浓度。
口咽念珠菌病动物模型。将6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(Charles River,Calco,Italy)保持在Perugia University(Italy)的动物屋中。从感染前一天开始，每隔一天用225mg/kg醋酸可的松(Sigma-Aldrich)处理小鼠，然后在皮下注射乙胺噻吩环己酮/唑拉西泮-甲苯噻嗪(50mg/kg/5mg/kg)混合物麻醉下(Mosci et al.,Virulence,2013,4:250-254)如前所述用1x106/ml白色念珠菌(CA-6)悬液感染小鼠(Solis and Filler,NatureProtoc.,20125,7:637-642)。在感染前立即测试口腔，以确认之前不存在念珠菌物种(通过取口腔样品，将其涂在含有氯霉素(50μg/ml)(均来自Sigma-Aldrich)的YPD琼脂上)。参见实施例1的伦理声明。
测试的产品。在该实施例中，测试了活形式(GI)和灭活形式(IY)以及细胞壁形式(WG)的酿酒酵母菌株I-3856。在感染后第+1、+2和+3天小鼠接受经口注射(10μl)盐水溶液(0.9％NaCl，阴性对照)、氟康唑(FLZ，4mg/ml，阳性对照)和IY、GI或WG(均为100mg/ml)。
CFU测定。有关操作条件，参见实施例1。在感染后第+1、+3和+6天测定真菌载量。
SAP2、SAP6、ALS3和HWP1基因表达的定量分析。在感染后第+1、+3和+6天获得来自患有白色念珠菌口腔感染并如上所述用盐水溶液、或氟康唑或用IY、GI或WG处理的小鼠的舌匀浆。将小鼠舌匀浆以3000转/分钟离心5分钟，然后用Trizol(Life Technology)裂解细胞级分。
根据制造商的说明，使用莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV RT)的逆转录酶反应提取和逆转录总RNA。用分光光度计测定互补DNA(cDNA)的浓度。使用已知引物检测白色念珠菌的SAP2、SAP6、ALS3和HWP1基因(Naglik et al.,J.Med.Microbiol.,2006,55:1323-1327；Naglik et al.,Microbiology,2008,154:3266-3280；Roudbarmohammadi et al.,Adv.Biomed.Res.,2016,5:105)。实时PCR反应在带有SYBR green(BioRad)的96孔PCR板中进行。对于实时PCR反应，使用200ng cDNA。所有样品一式三份测量。在2-ΔΔCT中报告感染后不同时间念珠菌基因相对于白色念珠菌接种物的转录物的相对表达水平，(Pericolini etal.,Virulence,2017,8:74-90))。SAP2、SAP6、ALS3和HWP1使用的扩增条件相同：95℃ 3分钟、40个循环的95℃ 10秒和引物特异性杂交温度30秒。实验使用Eppendorf Mastercycler进行。
杀白念珠菌能力测试。在感染后第+3天和第+6天，在腹膜内注射0.5ml不含内毒素的10％巯基乙酸盐(Difco)溶液18小时后，收集未感染小鼠和如上所述的感染并处理的小鼠的腹膜中性粒细胞。
中性粒细胞破坏活性通过CFU抑制试验测定。简言之，在5％CO2存在下，在37℃下将每孔0.1ml悬液中的中性粒细胞(105个细胞)在平底96孔组织培养板中与在0.1ml含有5％FBS的RPMI中的104个白色念珠菌(CA-6)细胞一起孵育2小时。孵育后，剧烈摇动平板，加入Triton X-100(蒸馏水中0.1％，每孔中终浓度为0.01％)裂解细胞。用蒸馏水从每个孔中制备系列稀释液。将样品一式三份铺板在含有氯霉素(50mg/ml)的Sabouraud葡萄糖琼脂上，并在37℃下孵育24小时后评估CFU值。所谓的对照培养物由与含有5％FCS且不含效应细胞的RPMI-1640一起孵育的白色念珠菌(CA-6)组成。
细胞因子的生产。在感染后+1、+3和+6天获得来自未感染小鼠或来自如上所述经口感染和处理的小鼠的舌匀浆。将舌匀浆以3000转/分钟离心5分钟，收集上清液并通过ELISA测定法(eBioscience)测量IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17A/F、IL-22、IL-23和IFN-γ的水平。
统计分析。结果是两个不同实验中每组4-6只小鼠的一式两份或一式三份样品的平均值±SEM。用Mann-Whitney U检验评估用盐水溶液处理的感染小鼠与用FLU、GI、IY或WG处理的未感染小鼠或感染小鼠与用盐水溶液处理的感染小鼠之间的差异。p<0.05的值被认为是显著的。
B.结果和讨论
首先评估WG(酿酒酵母菌株CNCM I-3856的细胞壁)针对口腔中白色念珠菌载量的影响的能力。为此目的，在用白色念珠菌(106/ml)感染后第+1、+2和+3天用IY、GI或WG(均为100mg/ml)处理小鼠。在感染后第+1、+3和+6天评估如此处理的小鼠舌的CFU值。获得的结果显示于图7中，表明所有测试的化合物，包括WG，都能够显著抑制白色念珠菌载量，并且有益效果类似于使用氟康唑(FLZ)获得的效果。
接下来，本发明人确定真菌载量的抑制是否与白色念珠菌的某些毒力因子的抑制有关。因此，他们测定了与念珠菌入侵组织有关的天冬氨酸蛋白酶(Sap)的表达。SAP2和SAP6基因的测定在感染后+1、+3和+6天进行。结果显示于图8(A)和(B)中，表明在用GI处理后SAP2和SAP6的表达存在显著抑制，但用IY或WG处理则没有–这种效果在感染后6天观察到。
白色念珠菌表达侵袭素Als3，它与上皮细胞结合，通过上皮细胞的侵袭和主动渗透导致真菌的内吞作用，产生细胞损伤和促炎细胞因子的释放(Naglik et al.,MicrobesInfect.,2011,13:963-976)。白色念珠菌的HWP1(菌丝壁蛋白1)基因编码菌丝生长和真菌粘附到上皮细胞所必需的真菌细胞壁蛋白(Orsi et al.,Microb.Pathog.,2014,69-70:20-27)。发现两种基因ASL3和HWP1的表达在用GI处理后显著降低，但用IY或WG处理后则没有(参见图8(C)和(D))。这些结果表明GI对CFU的抑制可能是由于抑制了念珠菌对上皮细胞的粘附以及抑制了酵母菌丝转化，从而减少了随后的细胞损伤。由于IY和WG不影响念珠菌中的基因表达，因此使用这两种化合物观察到的CFU降低还存在其他作用机制。
中性粒细胞是真菌破坏的主要效应免疫细胞(Gazendam et al.,Immunol.Rev.,2016,273:299-311)。因此，检查了中性粒细胞的破坏活性。获得的结果显示于图9中。它们表明，与未感染的小鼠相比，在感染白色念珠菌期间减弱的嗜中性粒细胞的破坏活性通过用测试的酵母产品处理而恢复。特别地，在感染后6天，与未处理的感染小鼠相比，在用GI、IY和WG处理的感染小鼠中观察到中性粒细胞的破坏活性大幅增加。
在口腔念珠菌病病程中，通过释放促炎细胞因子，上皮细胞诱导中性粒细胞的募集，从而通过加速消除念珠菌来限制对上皮细胞的损伤程度(Trautwein-Weidner et al.,Mucosal.Immunol.,2015,8:221-231)。在本文使用的实验系统中测试了促炎细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的产生。获得的结果如图10所示。这些结果表明，与未感染的小鼠相比，在感染后一天，在感染小鼠中观察到促炎细胞因子(如IL-1β、TNF-α和IL-6)的产生没有变化，无论是否用各种化合物处理。但是，感染后3天，感染小鼠的IL-1β和TNF-α产生显著增加，并且用酵母产品或FLZ处理导致这些细胞因子的明显抑制。此时，除FLZ外，与未处理小鼠相比，IL-6的产生保持不变。在感染后6天进行促炎细胞因子分析时，与未感染小鼠的舌的上清液相比，感染小鼠的舌的上清液中观察到大量增加，并且用GI、WG和FLZ处理导致所有细胞因子的产生显著减少，而IY只能显著抑制TNF-α的产生(图10)。
已知IL-17、IL-22和IL-23在口腔念珠菌病过程中起到消除真菌的作用(Hebeckeret al.,Expert.Rev.Anti Infect.Ther.,2014,12:867-879；Moyes et al.,Clin.Dev.Immunol.,2011,346307)。因此，在本系统中还确定了T细胞的细胞因子IL-17、IL-22和IL-23的存在。获得的结果(图11)表明，感染后6天，所有这些细胞因子在感染小鼠舌的上清液中的含量高于未感染小鼠舌的上清液中的含量。用GI和WG处理导致对所有测试的细胞因子的显著抑制，而IY仅在产生IL-23的情况下诱导显著减少。
在感染后3天和6天，在感染小鼠的舌的上清液中也观察到IFN-γ(一种T细胞典型的细胞因子)增加，并且用测试化合物处理导致IFN-γ的产生大幅减少(参见图12)。
综合考虑，这些结果表明在用测试化合物处理后观察到的促炎细胞因子的抑制可归因于真菌载量的减少。可以预期，通过抑制若干种毒力因子(如天冬氨酸蛋白酶和念珠菌的粘附素)，GI成功抑制了念珠菌载量和炎症反应。在本文呈现的实验中，IY和WG显然对念珠菌的毒力因子没有影响，但它们导致真菌载量大幅减少。先前已经表明，IY能够与念珠菌产生强聚集(Pericolini et al.,Virulence,2017,8:74-90)。可以预期，WG通过类似的机制发挥作用。此外，用所有测试的化合物处理后观察到的中性粒细胞破坏活性的增加也可以解释真菌载量的大幅减少。
C.结论
获得的结果表明，所有测试的酵母产品(GI、IY和WG)都能够抑制口腔中念珠菌的真菌生长。GI的有益作用至少部分是由于通过抑制念珠菌的粘附素和抑制菌丝转变来抑制念珠菌与上皮细胞的粘附。结果表明，WG和IY的作用特别是由于通过产生念珠菌的强聚集产生的机械效应，这阻止了念珠菌粘附到上皮细胞。所有这些作用都会导致念珠菌消除的明显加速，从而导致炎症反应低甚至不存在。有趣的是，在进行的所有测定中，用测试的酵母产品(GI、IY和WG)处理后获得的真菌载量与使用氟康唑(用于治疗口咽念珠菌病的标准抗真菌剂)获得的相当。
Figure GDA0003320989590000251

Claims (13)

1.于2007年10月17日以保藏号I-3856保藏于CNCM的酿酒酵母菌株，其用于预防和/或治疗口咽念珠菌病。
2.根据权利要求1所述的用于其用途的保藏号I-3856的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述菌株是活形式或灭活形式。
3.根据权利要求1或2所述的用于其用途的保藏号I-3856的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌株是干酵母形式。
4.根据权利要求3所述的用于其用途的保藏号I-3856的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述干酵母形式的酵母是活性干酵母形式。
5.根据权利要求1所述的用于其用途的保藏号I-3856的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述菌株是分级形式。
6.根据权利要求5所述的用于其用途的保藏号I-3856的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述分级形式选自所述酵母的细胞壁、所述酵母的壁的β-葡聚糖、所述酵母的壁甘露糖蛋白、所述酵母的提取物、以及它们的任何组合。
7.药物组合物，用于预防和/或治疗口咽念珠菌病，所述药物组合物包含有效量的权利要求1-6任一项所定义的保藏号I-3856的酿酒酵母菌株和至少一种生理学上可接受的赋形剂。
8.根据权利要求7所述的用于其用途的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物旨在用于局部施用或通过口服途径施用。
9.根据权利要求7或8所述的用于其用途的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物进一步包含至少一种具有舒缓、抗刺激、镇痛、抗炎、伤口愈合、抗生素、解热或抗真菌活性的额外活性药物成分。
10.根据权利要求7-9任一项所述的用于其用途的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的形式是牙膏、漱口水、口腔喷雾、乳膏或口腔凝胶、口腔分散条、锭剂、可直接撒在口腔中的粉末、口腔分散棒、待在水中稀释的棒或装有按钮塞的小瓶。
11.根据权利要求1-6任一项所述的用于其用途的保藏号I-3856的酿酒酵母菌株或所述酵母的细胞壁或根据权利要求7-10任一项所述的用于其用途的药物组合物，其特征在于，所述口咽念珠菌病是药物治疗的副作用，或其特征在于，所述口咽念珠菌病在免疫功能低下状态的患者中存在或易于发展。
12.根据权利要求1-6任一项所述的用于其用途的保藏号I-3856的酿酒酵母菌株或所述酵母的细胞壁或根据权利要求7-10任一项所述的用于其用途的药物组合物，其特征在于，所述口咽念珠菌病存在于婴儿或老年人中。
13.根据权利要求1-6任一项所定义的保藏号I-3856的酿酒酵母菌株或所述酵母的细胞壁，或根据权利要求7-10任一项所定义的药物组合物，其用于预防或抑制念珠菌感染扩散至口咽念珠菌病患者的食道、胃或小肠的方法中。
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