CN113720842A - 一种生物样品成像辅助装置、生物样品成像系统及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物样品成像技术领域，公开了一种生物样品成像辅助装置、生物样品成像系统及方法。生物样品成像辅助装置包括飞秒激光单元和冷冻单元，飞秒激光单元包括飞秒激光器和调整光路。生物样品成像系统包括冷冻电子显微镜和生物样品成像辅助装置。通过飞秒激光器发射飞秒激光脉冲，通过调整光路将飞秒激光脉冲聚焦在玻璃态的生物样品的不同高度上；利用飞秒激光脉冲的冷加工作用，对生物样品进行逐层剥离；在每次剥离操作后，使用冷冻电子显微镜对生物样品进行成像；多次剥离操作和多次成像操作后，得到生物样品在不同高度区域不同角度下对应的多个二维图像。本发明可提高生物样品结构解析效率。

Description

一种生物样品成像辅助装置、生物样品成像系统及方法
技术领域
本发明属于生物样品成像技术领域，更具体地，涉及一种生物样品成像辅助装置、生物样品成像系统及方法。
背景技术
生物大分子具有复杂的三维结构，研究其精细结构，有助于理解其如何在细胞中发挥作用。例如，蛋白质复合物在细胞膜表面负责基本的生物过程(突触传递、凝血和凋亡)，在细胞膜表面解析这些蛋白质大分子结构将有助于理解其实现特定功能的结构基础和在相关生物过程中所发挥的作用，现代生物学的一个基本目标就是理解这些复杂结构是如何执行任务的，该过程涉及到了化学键的破裂和形成，因此原子尺度的结构表征被证明是一种有效的手段。
生物大分子非常小，可见光受衍射极限的限制，无法观测到生物大分子结构，X光晶体学在过去很长一段时间是结构生物学的重要工具，但是大部分蛋白质时难以结晶的，而另一种用于表征蛋白质结构的技术是核磁共振波谱，可以测量原子间相互作用，但只能用作推断相对较小的蛋白质结构。
电子波长较短，当被加速到几十万伏高压时，其波长较蛋白质等生物大分子中原子距离短得多，因此人们希望能够用电子显微镜来观察蛋白质结构。但是存在以下两个问题：(1)生物结构一般需要水作为基本环境，而电子显微镜由于电子束容易被空气分子散射，因此只能采用高真空环境；(2)生物结构易受到辐照损伤。
冷冻电子显微镜能够将样品保持在低温条件下，避免了辐照损伤，这项技术的发展为研究生物大分子的结构表征提供了前所未有的机会。
现有的冷冻电子显微镜的基本工作过程包括：(1)样品制备:将几微升蛋白质等生物样品溶液滴到含有微孔碳膜的网格(例如，微栅)上，插入液态乙烷进行快速冷冻，转移至电子显微镜装置；(2)数据收集：拍摄不同角度的生物样品二维图像；(3)数据处理：将多个生物样品二维图像进行三维重建，得到样品三维结构图。
然而，现有的冷冻电子显微镜获得生物样品三维结构图的过程存在一个明显缺陷：由于在生物样品的冷冻过程中，生物分子被冷冻在不同位置，容易产生彼此堆叠，影响电子显微成像，因此很难在一次样品制备实验过程中获得多个不同角度样品二维图像，如果想更快速地获得样品三维结构图，就需要提出新的技术手段，克服以上不足。
发明内容
本发明通过提供一种生物样品成像辅助装置、生物样品成像系统及方法，解决现有技术中难以在一次生物样品的制备实验过程中获得多个不同角度的二维图像的问题。
本发明提供一种生物样品成像辅助装置，包括：飞秒激光单元和冷冻单元；所述飞秒激光单元包括飞秒激光器和调整光路；所述冷冻单元用于使得位于微栅上的生物样品保持玻璃态；所述飞秒激光器用于发射飞秒激光脉冲；所述调整光路用于将所述飞秒激光脉冲聚焦到所述生物样品上，通过所述飞秒激光脉冲对所述生物样品进行逐层剥离。
优选的，所述冷冻单元包括液氮罐和液氮通道；所述液氮罐用于存储液氮；所述液氮通道与所述液氮罐连通，所述液氮在所述液氮通道中循环，使得位于微栅上的生物样品保持玻璃态；所述微栅、所述液氮通道的至少部分通道和所述调制光路的至少部分光路插入至冷冻电子显微镜的内部。
优选的，所述飞秒激光脉冲的波长为1040nm，单脉冲能量为5nJ～10nJ，重复频率为50～100MHz；所述飞秒激光脉冲对所述生物样品进行逐层剥离时的剥离深度在纳米级别。
优选的，所述调整光路包括：至少一个凹透镜、至少一个凸透镜和多个反射镜；所述飞秒激光脉冲经所述调整光路进行扩束和反射调节后聚焦到所述生物样品上。
本发明提供一种生物样品成像系统，包括：冷冻电子显微镜和上述的生物样品成像辅助装置；所述生物样品成像辅助装置用于通过飞秒激光脉冲对保持在玻璃态的生物样品进行逐层剥离；所述冷冻电子显微镜用于在每次剥离操作后，对所述生物样品进行成像；多次剥离操作和多次成像操作后，得到所述生物样品在不同高度区域不同角度下对应的多个二维图像。
优选的，所述生物样品成像系统的空间分辨能力为埃数量级。
优选的，所述冷冻电子显微镜包括从上到下依次设置的电子枪、聚光镜、物镜、中间镜、投影镜和CCD；所述生物样品成像辅助装置作为样品杆，位于所述聚光镜和所述物镜之间；
玻璃态的生物样品放置在所述样品杆上，所述电子枪用于发射电子束，所述电子束在经过所述聚光镜后穿过所述生物样品形成散射电子束，所述散射电子束在所述物镜、所述中间镜和所述投影镜的作用下于所述CCD上成像。
本发明提供一种生物样品成像方法，通过飞秒激光器发射飞秒激光脉冲，通过调整光路将所述飞秒激光脉冲聚焦在玻璃态的生物样品的不同高度上；利用飞秒激光脉冲的冷加工作用，对所述生物样品进行逐层剥离；在每次剥离操作后，使用冷冻电子显微镜对所述生物样品进行成像；多次剥离操作和多次成像操作后，得到所述生物样品在不同高度区域不同角度下对应的多个二维图像。
优选的，得到多个二维图像后，还包括：基于所述多个二维图像，利用三维重构算法得到所述生物样品对应的三维结构图。
优选的，所述飞秒激光脉冲的波长为1040nm，单脉冲能量为5nJ～10nJ，重复频率为50～100MHz；所述飞秒激光脉冲对所述生物样品进行逐层剥离时的剥离深度在纳米级别。
本发明中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
在发明中，通过飞秒激光器发射飞秒激光脉冲，通过调整光路将所述飞秒激光脉冲聚焦在玻璃态的生物样品的不同高度上；利用飞秒激光脉冲的冷加工作用，对所述生物样品进行逐层剥离；在每次剥离操作后，使用冷冻电子显微镜对所述生物样品进行成像；多次剥离操作和多次成像操作后，得到所述生物样品在不同高度区域不同角度下对应的多个二维图像。即本发明通过飞秒激光的烧蚀作用，将飞秒激光聚焦在所观测的生物样品上，剥离上层处于冷冻状态的生物样品，再通过冷冻电子显微镜对下层样品进行成像，重复上述过程，从而得到蛋白质样品多组二维图像，最终能够进行三维重构获得蛋白质样品三维结构图。本发明通过飞秒激光逐层剥离生物样品，能够在一次生物样品的制备实验过程中获得多个不同角度的二维图像，可提高生物样品结构解析效率。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的一种生物样品成像辅助装置的剖面图；
图2为本发明实施例1中生物样品成像辅助装置的部分结构插入至冷冻电子显微镜的内部的示意图；
图3为本发明实施例2提供的一种生物样品成像系统的结构示意图；
图4为本发明实施例3提供的一种生物样品成像方法的过程示意图。
其中，1a-飞秒激光器，1b-飞秒激光脉冲，2a-液氮罐，2b-液氮通道，3a-凹透镜，3b-第一凸透镜，3d-第二凸透镜，3c-第一反射镜，3e-第二反射镜，3f-第三反射镜，3g-第四反射镜，3h-第五反射镜，3i-第六反射镜，3j-第七反射镜，4-微栅，5-电子束，6-生物样品，7a-生物样品在第一角度下的二维图像，7b-生物样品在第二角度下的二维图像，8-生物样品对应的三维结构图。
具体实施方式
为了更好的理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。
实施例1：
实施例1提供了一种生物样品成像辅助装置，参见图1，包括：飞秒激光单元和冷冻单元；所述飞秒激光单元包括飞秒激光器和调整光路；所述冷冻单元用于使得位于微栅上的生物样品保持玻璃态；所述飞秒激光器用于发射飞秒激光脉冲；所述调整光路用于将所述飞秒激光脉冲聚焦到所述生物样品上，通过所述飞秒激光脉冲对所述生物样品进行逐层剥离。
其中，所述冷冻单元包括液氮罐和液氮通道；所述液氮罐用于存储液氮；所述液氮通道与所述液氮罐连通，所述液氮在所述液氮通道中循环，使得位于微栅上的生物样品保持玻璃态。
所述调整光路包括：至少一个凹透镜、至少一个凸透镜和多个反射镜；所述飞秒激光脉冲经所述调整光路进行扩束和反射调节后聚焦到所述生物样品上。
所述微栅、所述液氮通道的至少部分通道和所述调制光路的至少部分光路插入至冷冻电子显微镜的内部，例如，图2中虚线的左侧部分结构插入至冷冻电子显微镜的内部，虚线的右侧部分结构保留在冷冻电子显微镜的外部。
所述飞秒激光脉冲的波长为1040nm，单脉冲能量为5nJ～10nJ，重复频率为50～100MHz；所述飞秒激光脉冲对所述生物样品进行逐层剥离时的剥离深度在纳米级别。
实施例2：
实施例2提供了一种生物样品成像系统，参见图3(样品杆相对于冷冻电子显微镜来说是很小的，图3不表现实际比例，仅作为位置关系的示意图)，包括：冷冻电子显微镜和如实施例1所述的生物样品成像辅助装置；所述生物样品成像辅助装置用于通过飞秒激光脉冲对保持在玻璃态的生物样品进行逐层剥离；所述冷冻电子显微镜用于在每次剥离操作后，对所述生物样品进行成像；多次剥离操作和多次成像操作后，得到所述生物样品在不同高度区域不同角度下对应的多个二维图像。
所述生物样品成像系统的空间分辨能力为埃数量级。
其中，所述冷冻电子显微镜包括从上到下依次设置的电子枪、聚光镜、物镜、中间镜、投影镜和CCD；所述生物样品成像辅助装置作为样品杆，位于所述聚光镜和所述物镜之间；玻璃态的生物样品放置在所述样品杆上，所述电子枪用于发射电子束，所述电子束在经过所述聚光镜后穿过所述生物样品形成散射电子束，所述散射电子束在所述物镜、所述中间镜和所述投影镜的作用下于所述CCD上成像。
实施例3：
实施例3提供了一种生物样品成像方法，通过飞秒激光器发射飞秒激光脉冲，通过调整光路将所述飞秒激光脉冲聚焦在玻璃态的生物样品的不同高度上；利用飞秒激光脉冲的冷加工作用，对所述生物样品进行逐层剥离；在每次剥离操作后，使用冷冻电子显微镜对所述生物样品进行成像；多次剥离操作和多次成像操作后，得到所述生物样品在不同高度区域不同角度下对应的多个二维图像。
此外，得到多个二维图像后还可包括：基于所述多个二维图像，利用三维重构算法得到所述生物样品对应的三维结构图。
所述飞秒激光脉冲的波长为1040nm，单脉冲能量为5nJ～10nJ，重复频率为50～100MHz；所述飞秒激光脉冲对所述生物样品进行逐层剥离时的剥离深度在纳米级别。
下面对本发明做进一步的说明。
本发明提供一种生物样品成像辅助装置，该装置可以理解为用于冷冻电子显微镜的飞秒激光逐层剥离装置，该装置利用飞秒激光脉冲的烧蚀作用，在冷冻电子显微镜中逐层剥离生物样品，为获得生物样品在不同高度区域不同角度下对应的多个二维图像提供实现基础。
飞秒激光是一种脉冲宽度达几飞秒到几百飞秒的激光，具有以下几个优点：(1)飞秒激光脉冲峰值功率很高，与物质作用的过程属于多光子作用，其作用范围小，切割的精度非常高，与生物组织作用过程热损伤小；(2)飞秒激光的热传导作用极小，基本可以忽略，适用于各种微加工领域。基于上述考虑，本发明采用飞秒激光器作为生物样品成像辅助装置的主要器件。
本发明技术解决方案如下：
一种生物样品成像辅助装置，包括飞秒激光系统和冷冻系统，飞秒激光光路系统包括飞秒激光器、调整光路(例如包括凹透镜、凸透镜、反射镜)，飞秒激光脉冲聚焦在微栅的网孔内不同高度上，通过飞秒激光的烧蚀作用，逐层剥离不同高度的生物样品；冷冻系统包括集成在装置中的液氮罐和液氮通道，通过液氮将样品保持在冷冻状态(即玻璃态)。
本发明装置工作过程如下：
参见图1至图4，将生物样品6冷冻至玻璃态，滴到微栅4后转移至本发明提供的生物样品成像辅助装置，通过向液氮罐2a加入液氮，液氮在预留的液氮通道2b中循环，确保微栅4上的生物样品6保持在冷冻状态；将生物样品成像辅助装置作为样品杆插入冷冻电子显微镜，通过电子束5的散射作用，获得生物样品在第一角度下对应的二维图像7a，飞秒激光器1a发射飞秒激光脉冲1b，经过凹透镜3a和第一凸透镜3b组成的扩束系统，飞秒激光变为光斑直径为5mm的平行束，依次经过第一反射镜3c、第二凸透镜3d、第二反射镜3e、第三反射镜3f、第四反射镜3g、第五反射镜3h、第六反射镜3i、第七反射镜3j后聚焦在生物样品上，将上层样品剥离，之后再次使用电子束5照射样品，获得生物样品第二角度下对应的二维图像7b，进行多次剥离操作和成像操作后，将多个二维图像通过三维重构方法，得到该生物样品对应的三维结构图8。
本发明是利用飞秒激光剥离处于冷冻状态的蛋白质分子或病毒等生物样品，利用了飞秒激光冷加工的特点，不会对生物样品产生破坏，剥离深度在纳米级别。本装置结合冷冻电子显微镜空间分辨能力为埃。
本发明提供的一种生物样品成像方法包含以下步骤：
A、使用飞秒激光脉冲，通过样品杆内置的激光光路聚焦在生物样品不同高度上。
其中，飞秒激光脉冲的波长为1040nm，单脉冲能量为5nJ～10nJ，重复频率为50～100MHz。
B、利用飞秒激光脉冲的冷加工作用，对处于冷冻状态的生物样品进行逐层剥离。
根据生物样品大分子尺寸确定飞秒激光脉冲剥离深度，确定使用的飞秒激光脉冲的能量。一般生物大分子尺寸在几纳米到上百个纳米之间，基本是纳米级别的，例如一种生物分子是50nm，那么剥离深度稍大于50nm即可满足测试要求。
C、使用冷冻电子显微镜拍摄不同高度区域内不同角度样品的二维图像。
使用冷冻电子显微镜获得不同角度样品二维图像后，利用三维重构算法得到样品三维结构图。
下面给出一个具体的应用实例。
将要观察的蛋白质样品放入液态乙烷中，瞬间冷冻，滴到微栅后转移至本发明提供的生物样品成像辅助装置上，然后插入冷冻电子显微镜中，通过电子束散射作用获得上层样品(即冷冻在网格上层的蛋白质样品)不同角度的二维图像，使用飞秒激光系统，通过飞秒激光脉冲的烧蚀作用逐层剥离上层生物样品，再使用电子束对下层样品(即冷冻在网格下层的蛋白质样品)成像，获得样品不同角度二维图像，重复上述过程，从而得到蛋白质样品多组二维图像，进行三维重构获得蛋白质样品三维结构图。
本发明实施例提供的一种生物样品成像辅助装置、生物样品成像系统及方法至少包括如下技术效果：
本发明相较于传统的冷冻电子显微镜拍摄过程，利用飞秒激光逐层剥离生物样品技术，克服了电子显微成像过程中，多个样品上下堆叠产生的干扰，避免了需要重复制作电镜样品，可明显提高冷冻电子显微镜进行生物结构解析的效率，因此可以应用在冷冻电子显微镜拍摄生物样品过程中。
最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种生物样品成像辅助装置，其特征在于，包括：飞秒激光单元和冷冻单元；所述飞秒激光单元包括飞秒激光器和调整光路；所述冷冻单元用于使得位于微栅上的生物样品保持玻璃态；所述飞秒激光器用于发射飞秒激光脉冲；所述调整光路用于将所述飞秒激光脉冲聚焦到所述生物样品上，通过所述飞秒激光脉冲对所述生物样品进行逐层剥离。
2.根据权利要求1所述的生物样品成像辅助装置，其特征在于，所述冷冻单元包括液氮罐和液氮通道；所述液氮罐用于存储液氮；所述液氮通道与所述液氮罐连通，所述液氮在所述液氮通道中循环，使得位于微栅上的生物样品保持玻璃态；所述微栅、所述液氮通道的至少部分通道和所述调制光路的至少部分光路插入至冷冻电子显微镜的内部。
3.根据权利要求1所述的生物样品成像辅助装置，其特征在于，所述飞秒激光脉冲的波长为1040nm，单脉冲能量为5nJ～10nJ，重复频率为50～100MHz；所述飞秒激光脉冲对所述生物样品进行逐层剥离时的剥离深度在纳米级别。
4.根据权利要求1所述的生物样品成像辅助装置，其特征在于，所述调整光路包括：至少一个凹透镜、至少一个凸透镜和多个反射镜；所述飞秒激光脉冲经所述调整光路进行扩束和反射调节后聚焦到所述生物样品上。
5.一种生物样品成像系统，其特征在于，包括：冷冻电子显微镜和如权利要求1-4中任一项所述的生物样品成像辅助装置；
所述生物样品成像辅助装置用于通过飞秒激光脉冲对保持在玻璃态的生物样品进行逐层剥离；
所述冷冻电子显微镜用于在每次剥离操作后，对所述生物样品进行成像；
多次剥离操作和多次成像操作后，得到所述生物样品在不同高度区域不同角度下对应的多个二维图像。
6.根据权利要求5所述的生物样品成像系统，其特征在于，所述生物样品成像系统的空间分辨能力为埃数量级。
7.根据权利要求5所述的生物样品成像系统，其特征在于，所述冷冻电子显微镜包括从上到下依次设置的电子枪、聚光镜、物镜、中间镜、投影镜和CCD；所述生物样品成像辅助装置作为样品杆，位于所述聚光镜和所述物镜之间；
玻璃态的生物样品放置在所述样品杆上，所述电子枪用于发射电子束，所述电子束在经过所述聚光镜后穿过所述生物样品形成散射电子束，所述散射电子束在所述物镜、所述中间镜和所述投影镜的作用下于所述CCD上成像。
8.一种生物样品成像方法，其特征在于，通过飞秒激光器发射飞秒激光脉冲，通过调整光路将所述飞秒激光脉冲聚焦在玻璃态的生物样品的不同高度上；利用飞秒激光脉冲的冷加工作用，对所述生物样品进行逐层剥离；在每次剥离操作后，使用冷冻电子显微镜对所述生物样品进行成像；多次剥离操作和多次成像操作后，得到所述生物样品在不同高度区域不同角度下对应的多个二维图像。
9.根据权利要求8所述的生物样品成像方法，其特征在于，得到多个二维图像后，还包括：基于所述多个二维图像，利用三维重构算法得到所述生物样品对应的三维结构图。
10.根据权利要求8所述的生物样品成像方法，其特征在于，所述飞秒激光脉冲的波长为1040nm，单脉冲能量为5nJ～10nJ，重复频率为50～100MHz；所述飞秒激光脉冲对所述生物样品进行逐层剥离时的剥离深度在纳米级别。
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