CN113702470B - 一种基于电化学标准曲面定量检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于电化学标准曲面定量检测的方法，它先测定电极的电化学活性面积，对已知电化学活性面积的电极采用示差脉冲伏安法测量不同待测物浓度的电解液下的DPV曲线，获得待测物浓度与对应DPV曲线上的峰值电流之间的对应关系；以电极的活性面积作为变量，与待测物浓度和峰值电流一并组成三维坐标系，拟合得到峰值电流随待测物浓度和电极活性面积两个变量之间变化关系的平面方程，即得电化学标准曲面。对样品中待测物含量定量分析时，将测出的DPV曲线上的峰值电流及电极活性面积代入平面方程中，即能计算出样品中的待测物含量。本发明把电极面积作为新的变量引入，拟合得到三维标准曲面，有效校正电极间的信号差异，提高了定量检测的准确性。
Description
技术领域
本发明公开了一种基于电化学标准曲面定量检测的方法。
背景技术
电化学传感器是一种快速、高灵敏度、低成本的分析工具，但其准确性和重现性仍极具挑战。由于丝网印刷电极印刷及表面修饰工艺存在难以避免的误差，从而导致不同电极上的感应电流存在差异。因此，使用不同电极检测到的感应电流直接确定分析物浓度存在一定的误差。因此，解决电化学传感器的准确性和重现性的问题对于电化学定量检测技术的广泛应用是至关重要的。
为了克服这个问题，大多数研究通过保持稳定的电极界面控制和引入内部稳定信号来制造“比率型传感器”来解决上述问题，即可以提供内标物校正环境因素从而提高重现性。如Sessler等人(Y.Du,B.J.Lim,B.Li,Y.S.Jiang,J.L.Sessler andA.D.Ellington,Anal Chem 2014,86,8010-8016.)首次将比率分析技术应用于电化学传感领域，通过将亚甲基蓝作为报告分子，二茂铁作为内部参照，提高了传感器对人类T型嗜淋巴细胞病毒I型基因片段检测的稳定性和重现性，该方法获得的测量值之间的标准偏差比使用不同电极获得的标准偏差小一个数量级。Li等人(S.Li,H.Li,X.Li,M.Zhu,H.Li and F.Xia,Anal Chem2021,93,8354-8361)开发了一种“ON”方法，用于通过HCR放大的电化学DNA传感器对核酸进行免校准测量，这种方法依赖于将两种类型的氧化还原报告分子(MB和Fc)分别固定在捕获DNA和辅助DNA上，该方法在多个数量级的范围内实现了对目标DNA浓度的准确估计，误差在30％以内。
尽管这些方法提高了电化学传感器的重现性和准确性，但仍存在许多问题，如能用于比率电化学检测的内部参考探针非常有限，目前主要局限于二茂铁(Fc)、亚甲基蓝(MB)等几种经典的电化学探针，小分子(如MB)难以直接、稳定地固定在电极表面，对于DNA传感器，需要在DNA链上进行标记以开发DNA辅助的比率传感，这大大增加了操作的复杂性，并且难以保证每个电极上DNA探针数量相同，限制了该类电化学比率检测的广泛应用(X.Wang,G.Liu,Y.Qi,Y.Yuan,J.Gao,X.Luo and T.Yang,Anal Chem 2019,91,12006-12013)。因此，开发有效和新颖的电化学定量方法来是一项很有意义的任务。
但是在电极的实际使用中，由于电极打磨或者丝网印刷电极印刷时存在一定的误差，导致电极信号间存在一定的差异，使得利用电极进行可靠定量分析仍然是一个巨大的挑战。
发明内容
针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种基于电化学标准曲面定量检测的方法。本发明开发了一种在丝网印刷裸电极上进行电化学定量的新方法，该方法不需要使用工艺上完全一致的电极或要求很高的电极修饰技艺，也无需使用内标来进行校正。该方法基于电流响应强度与所使用电极的表面积呈线性相关的基本原理，通过把电极面积作为新的变量引入标准曲线中，得到三维标准曲面，有效校正电极间的信号差异，从而提高了定量检测的准确性。将其应用于食用油抗氧化剂叔丁基对苯二酚(TBHQ)的定量检测中。结果表明，标准曲面较之标准曲线在裸电极的检测中，相对误差从1.72％～7.27％降低至0.09％～4.30％，实现了TBHQ的准确检测，并可用于其它电活性物质的检测，这在电化学传感器的定量检测中具有较大的应用前景。
所述的一种基于电化学标准曲面定量检测的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)准备一系列N个不同电极，对于每一个电极分别测定其电化学活性面积；
2)对于步骤1)测出的N个电极的活性面积，每一个活性面积的电极均按照以下过程进行电化学测试：将电极与电化学工作站连接，以pH缓冲溶液与待测物的混合液作为电解液，所述待测物为电活性物质，采用示差脉冲伏安法在不同待测物浓度下分别进行电化学反应，获得电极在不同待测物浓度的电解液中检测的DPV曲线，由此获得电解液中的待测物浓度与对应DPV曲线上的峰值电流之间的对应关系；
按照上述过程，对于N个不同活性面积的电极分别测试待测物浓度与对应DPV曲线上的峰值电流之间的对应关系，然后以不同电极的活性面积作为变量，与待测物浓度和峰值电流一并组成三维坐标系，然后针对该三维坐标系进行平面拟合，得到峰值电流随待测物浓度和电极活性面积两个变量之间变化关系的平面方程，即得电化学标准曲面；
3)进行样品中待测物含量定量分析时，将样品溶于pH缓冲溶液中备用；对电极测定电化学活性面积后与电化学工作站连接，以所述溶解样品的pH缓冲溶液作为电解液采用示差脉冲伏安法进行电化学测试，获得检测样品的DPV曲线；
4)将步骤3)测出的DPV曲线上的峰值电流及电极活性面积代入步骤2)的电化学标准曲面的平面方程中，即能计算出样品中的待测物含量。
所述的一种基于电化学标准曲面定量检测的方法，其特征在于步骤1)中测定电化学活性面积的步骤如下：
首先将待测真实面积的电极与电化学工作站连接，以含有1～3mmol/L过渡金属铁氰化物和0.5～2.0mol/L钾离子或钠离子的水溶液作为电解液，采用循环伏安法在不同扫描速率υ下分别进行电化学反应，获得不同扫描速率υ下的CV曲线以及对应CV曲线下的峰值电流i；然后以扫描速率υ平方根为横坐标，以扫描速率υ下测得的CV曲线的峰值电流i为纵坐标作图，线性回归得到线性方程，获得线性方程斜率k；
上述进行电化学反应中，电极真实面积按照如下计算公式确定：
式(1)中，i是电化学反应时测得的CV曲线上的峰值电流，υ是扫描速率，F是法拉第常数，A是电极真实面积，C是电解液中过渡金属铁氰化物的浓度，D是电解液中过渡金属铁离子的扩散系数，R是通用气体常数，T是测试温度；
将上述获得的线性方程斜率k代入式(1)所示的方程，即能计算出电极真实面积的数值。
所述的一种基于电化学标准曲面定量检测的方法，其特征在于所述过渡金属铁氰化物为K3[Fe(CN)6]，K3[Fe(CN)6]在电解液中的浓度为2mmol/L，电解液中含有1mol/L浓度的KCl。
所述的一种基于电化学标准曲面定量检测的方法，其特征在于所述电极为丝网印刷电极。
所述的一种基于电化学标准曲面定量检测的方法，其特征在于扫描速率υ在0.05～0.4V/s范围内，测试CV曲线在-0.3至0.6V之间进行扫描。
所述的一种基于电化学标准曲面定量检测的方法，其特征在于步骤2)或步骤3)中，所述pH缓冲溶液磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，其pH＝2。
所述的一种基于电化学标准曲面定量检测的方法，其特征在于步骤2)中，所述待测物为食用油抗氧化剂叔丁基对苯二酚TBHQ，TBHQ的测试浓度在1.0×10-4～1.4×10- 3mol/L。
所述的一种基于电化学标准曲面定量检测的方法，其特征在于步骤2)或步骤3)中，采用示差脉冲伏安法检测的参数为：检测DPV曲线在-0.2至0.5V的范围内进行，振幅为0.05V，增量为0.004V。
所述的一种基于电化学标准曲面定量检测的方法，其特征在于所述N为3～20之间的整数，优选为6～12之间的整数。
相对于现有技术，本发明取得的有益效果是：
1)电化学传感器的工作原理基于电化学系统中特定电活性物质引发的氧化还原反应。在反应中电活性物质的浓度可以通过感应电流来确定，如Randles-Sevcik方程所述：
ip＝2.69×105n3/2υ1/2D1/2AC (2)
式(2)中，ip是峰值电流，n是转移电子数，υ是扫描速率，D是电解液中过渡金属铁离子的扩散系数，A是工作电极面积，C代表电解液中过渡金属铁氰化物的浓度。从方程(2)中我们可以得知，电流的响应强度与工作电极面积相关，不同电极由于面积不同，产生的感应电流具有差异，从而进一步导致制备的传感器准确性和重现性低。在本发明中，我们使用电极的真实电活性面积来校正定量结果。在检测之前，需要测量和计算每根电极的真实面积，将电极面积信息作为变量引入到“测试待测物浓度与对应DPV曲线上的峰值电流之间的对应关系的标准曲线中”，形成三维的标准曲面。与常规的标准曲线定量方法相比，这种数据处理方法校正了电极之间的差异，具有更高的准确性。
2)本申请提出了一种通过电极面积校正电极间差异提高电化学传感器检测准确性的新方法。这种方法既不需要完全一致的电极，也不需要内标物来实现定量分析。此外，该方法操作简单，重现性好，准确性高。应用本发明的方法对TBHQ样品进行了定量分析，裸电极获得预测值的相对误差在0.09％～4.30％之间。
附图说明
图1为实施例1中裸电极SPE在含有2mmol/L K3[Fe(CN)6]的电解液中不同扫描速率下测得的CV曲线，以及扫描速率υ平方根与CV曲线上的峰值电流i之间对应关系曲线的对比图；
图2为实施例1中裸电极SPE在不同浓度TBHQ溶液中检测的DPV曲线，以及DPV曲线的峰值电流与TBHQ浓度之间对应关系曲线的对比图；
图3为实施例1中裸电极SPE的电活性面积与裸电极SPE在不同浓度TBHQ溶液中检测的DPV曲线上的峰值电流、TBHQ浓度之间的校正曲面图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1：
1、试剂与仪器
铁氰化钾(纯度>99.5％)、亚铁氰化钾(纯度>99.99％)、氯化钾(纯度>99.5％)、氯化钠(纯度>99.5％)、磷酸二氢钠(纯度>99.0％)、磷酸氢二钠(纯度>99.0％)、柠檬酸钠(纯度>99.0％)、硫酸(纯度95％～98％)、TBHQ(纯度>98.0％)、柠檬酸(纯度>99.5％)、均购自阿拉丁公司(中国上海)。其余试剂均为分析纯及以上纯度。商品化的丝网印刷裸电极SPE(Xenstat，宁波元感生物科技有限公司)(含碳工作电极、Ag/AgCl参比电极、碳对电极)。配置样品溶液的实验用水为18.3MΩ·cm超纯水，由UPWS-I-60D型超纯水仪器制得。
2、测定丝网印刷裸电极SPE真实面积的电化学检测
为了克服不同电极带来的较大差异，通过计算每根电极的真实电化学面积建立三维标准曲面提高准确性。我们在含有2mmol/LK3[Fe(CN)6]和1mol/L KCl的水溶液中，测试了电极真实面积。
首先对于一个待测的丝网印刷裸电极SPE，将其与电化学工作站连接，使用含有2mmol/LK3[Fe(CN)6]和1mol/L KCl的水溶液作为电解液，采用循环伏安法在不同扫描速率υ下分别进行电化学反应，扫描速率分别设置为50、100、200、300、400mV/s，CV曲线在-0.3至0.6V之间进行扫描。丝网印刷裸电极SPE在50、100、200、300、400mV/s扫描速率下的CV曲线对比图如图1中的分图(A)所示。
从图1中的分图(A)可以看出，该反应的氧化还原电位差ΔEp大于57mV，并且随着扫描速率的增加而逐渐增大，说明反应是准可逆过程。因此，我们使用Randles–方程在准可逆条件下的公式来计算电极真实面积：
式(1)中，i是电化学反应时测得的CV曲线上的峰值电流，n是转移电子数，υ是扫描速率，F是法拉第常数(F＝96485C/moL)，A是电极真实面积，C是电解液中K3[Fe(CN)6]的浓度(在本发明的实施例中，C取值为2mmol/L)，D是电解液中过渡金属铁离子的扩散系数(取值为0.63×105cm2/s)，R是通用气体常数(R通常取值为8.314J/mol·K)，T是测试温度(本发明在实验室环境下测试，测试温度取值为298K)。
根据图1中的分图(A)，获得不同对应CV曲线下的峰值电流i。然后以扫描速率υ平方根为横坐标，以扫描速率υ下测得的CV曲线的峰值电流i为纵坐标作图，线性回归得到线性方程，获得线性方程斜率k，如图1中的分图(B)所示。将图1中的分图(B)中拟合直线的斜率k代入式(1)所示的方程，即能计算出电极真实面积的数值。
3、建立二维标准曲线用于裸电极SPE定量检测
为了证明该方法具有更高的准确性，我们对裸电极所得到的三维拟合平面进行了研究。首先，通过检测不同浓度的TBHQ溶液，确定了TBHQ在裸电极上的线性范围，得到标准曲线。
测试裸电极SPE的标准曲线的过程为，将工作电极面积为4.9mm2的裸电极SPE用于电化学测试：将裸电极SPE与电化学工作站连接，使用示差脉冲伏安法(DPV)在磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(pH＝2)中对TBHQ进行定量检测，DPV在-0.2至0.5V的范围内进行，振幅为0.05V，增量为0.004V。TBHQ溶液的检测浓度分别为1×10-4、2×10-4、4×10-4、6×10-4、8×10-4、10×10-4、12×10-4和14×10-4mol/L。按照上述过程，获得同一根裸电极SPE下在不同TBHQ溶液检测浓度下的DPV曲线，如图2中的分图(A)所示。
根据图2中的分图(A)，以TBHQ溶液检测浓度为横坐标，以对应DPV曲线上的峰值电流为纵坐标作图，如图2中的分图(B)所示，线性回归得到线性方程，得到裸电极SPE上检测TBHQ的峰值电流与TBHQ浓度之间的校正标准曲线。如图2中的分图A、B所示，在最佳的实验条件下，TBHQ的峰值电流随着TBHQ浓度的增加而逐渐增大，在1×10-4mol/L至1.4×10- 3mol/L的浓度范围内，TBHQ的峰值电流与TBHQ浓度有较好的线性关系，线性方程为I＝8.03×10-3C-4.58×10-7(R2＝0.998)，检出限为9.79×10-6mol/L。
4、建立三维标准曲面用于裸电极SPE定量检测
S1：准备一系列10个不同电极，按照步骤2的测试过程，对于每一个电极分别测定其电化学活性面积，分别为3.18，2.97，3.06，3.19，3.32，3.31，3.40，3.16，2.97，3.10mm2(可以看出实验室中同一规格的不同电极，在实际使用时电极的电化学活性面积是有一定程度偏差的)；
S2：对于步骤1)测出的10个电极的活性面积，每一个活性面积的电极均按照以下过程进行电化学测试：将某一个裸电极SPE与电化学工作站连接，使用示差脉冲伏安法(DPV)在磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(pH＝2)中对TBHQ进行定量检测，DPV在-0.2至0.5V的范围内进行，振幅为0.05V，增量为0.004V。TBHQ溶液的检测浓度分别为1×10-4、2×10-4、4×10-4、6×10-4、8×10-4、10×10-4、12×10-4和14×10-4mol/L。按照上述过程，获得裸电极SPE在不同TBHQ浓度的电解液中检测的DPV曲线，由此获得TBHQ浓度与对应DPV曲线上的峰值电流之间的对应关系；
按照上述过程，对于10个不同活性面积的电极分别测试TBHQ浓度与对应DPV曲线上的峰值电流之间的对应关系，然后以不同电极的活性面积作为变量，与TBHQ浓度和峰值电流一并组成三维坐标系，然后针对该三维坐标系进行平面拟合，得到峰值电流随TBHQ浓度和电极活性面积两个变量之间变化关系的平面方程，即得电化学标准曲面。
测试结果如图3所示，在上述确定的线性范围内，将不同电极的电活性面积作为变量，与TBHQ的浓度和峰值电流组成三维坐标系。使用origin软件进行平面拟合，所得到的平面方程为i＝7.98×10-3C+2.588×10-5A-1.211×10-6。
5、验证检测方法的准确性
将TBHQ溶解于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(pH＝2)中，配制TBHQ浓度分别为2.0×10-4、4.0×10-4、6.0×10-4、8.0×10-4、和1.0×10-3mol/L的样品溶液。
对于上述配制的样品溶液，分别采用以下两种方法进行定量检测：
第一种：基于步骤3建立的二维标准曲线进行定量检测，使用与步骤3相同的一根裸电极SPE用于电化学测试：将裸电极SPE与电化学工作站连接，以上述配制的样品溶液作为电解液，采用示差脉冲伏安法(DPV)在样品溶液中对TBHQ进行定量检测，DPV在-0.2至0.5V的范围内进行，振幅为0.05V，增量为0.004V。按照上述过程，获得同一根裸电极SPE下在样品溶液中检测的DPV曲线，将DPV曲线上的峰值电流代入步骤3建立的二维标准曲线的线性方程中，即可计算得到样品溶液中TBHQ的实际测试浓度。采用标准曲线法对不同TBHQ浓度的样品溶液进行测试时，样品溶液中TBHQ的实际浓度及相应的相对误差结果汇总于表1中，其相对误差在1.72％～7.27％之间。
第二种：基于步骤4建立的三维标准曲面进行定量检测，过程如下：
S1：选取一个丝网印刷裸电极SPE，按照步骤2的方法测试其真实面积(即电化学活性面积)，测试结果约为3.30mm2；
S2：对于步骤S1测出真实面积后的裸电极SPE，按照以下过程进行电化学测试：将所述裸电极SPE与电化学工作站连接，采用示差脉冲伏安法(DPV)在样品溶液中对TBHQ进行定量检测，DPV在-0.2至0.5V的范围内进行，振幅为0.05V，增量为0.004V。按照上述过程，获得步骤S1测出真实面积后的裸电极SPE在样品溶液中检测的DPV曲线，将DPV曲线上的峰值电流及步骤S1测出真实面积一并代入步骤4建立的电化学标准曲面的平面方程中，即可计算得到样品溶液中TBHQ的实际测试浓度。采用标准曲面法对不同TBHQ浓度的样品溶液进行测试时，样品溶液中TBHQ的实际浓度及相应的相对误差结果汇总于表1中，其相对误差在0.09％～4.30％之间。
表1裸电极的标准曲面与标准曲线准确性对比
本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。
Claims (9)
1.一种基于电化学标准曲面定量检测的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)准备一系列N个不同电极，对于每一个电极分别测定其电化学活性面积；
2)对于步骤1)测出的N个电极的活性面积，每一个活性面积的电极均按照以下过程进行电化学测试：将电极与电化学工作站连接，以pH缓冲溶液与待测物的混合液作为电解液，所述待测物为电活性物质，采用示差脉冲伏安法在不同待测物浓度下分别进行电化学反应，获得电极在不同待测物浓度的电解液中检测的DPV曲线，由此获得电解液中的待测物浓度与对应DPV曲线上的峰值电流之间的对应关系；
按照上述过程，对于N个不同活性面积的电极分别测试待测物浓度与对应DPV曲线上的峰值电流之间的对应关系，然后以不同电极的活性面积作为变量，与待测物浓度和峰值电流一并组成三维坐标系，然后针对该三维坐标系进行平面拟合，得到峰值电流随待测物浓度和电极活性面积两个变量之间变化关系的平面方程，即得电化学标准曲面；
3)进行样品中待测物含量定量分析时，将样品溶于pH缓冲溶液中备用；对电极测定电化学活性面积后与电化学工作站连接，以溶解样品的pH缓冲溶液作为电解液采用示差脉冲伏安法进行电化学测试，获得检测样品的DPV曲线；
4)将步骤3)测出的DPV曲线上的峰值电流及电极活性面积代入步骤2)的电化学标准曲面的平面方程中，即能计算出样品中的待测物含量；
步骤1)中测定电化学活性面积的步骤如下：
首先将待测活性面积的电极与电化学工作站连接，以含有1～3mmol/L过渡金属铁氰化物和0.5～2.0mol/L钾离子或钠离子的水溶液作为电解液，采用循环伏安法在不同扫描速率υ下分别进行电化学反应，获得不同扫描速率υ下的CV曲线以及对应CV曲线下的峰值电流i；然后以扫描速率υ平方根为横坐标，以扫描速率υ下测得的CV曲线的峰值电流i为纵坐标作图，线性回归得到线性方程，获得线性方程斜率k；
上述进行电化学反应中，电极活性面积按照如下计算公式确定：
式(1)中，i是电化学反应时测得的CV曲线上的峰值电流，n是转移电子数，υ是扫描速率，F是法拉第常数，A是电极活性面积，C是电解液中过渡金属铁氰化物的浓度，D是电解液中过渡金属铁离子的扩散系数，R是通用气体常数，T是测试温度；
将上述获得的线性方程斜率k代入式(1)所示的方程，即能计算出电极活性面积的数值。
2.如权利要求1所述的一种基于电化学标准曲面定量检测的方法，其特征在于所述过渡金属铁氰化物为K3[Fe(CN)6]，K3[Fe(CN)6]在电解液中的浓度为2mmol/L，电解液中含有1mol/L浓度的KCl。
3.如权利要求1所述的一种基于电化学标准曲面定量检测的方法，其特征在于所述电极为丝网印刷电极。
4.如权利要求1所述的一种基于电化学标准曲面定量检测的方法，其特征在于扫描速率υ在0.05～0.4V/s范围内，测试CV曲线在-0.3至0.6V之间进行扫描。
5.如权利要求1所述的一种基于电化学标准曲面定量检测的方法，其特征在于步骤2)或步骤3)中，所述pH缓冲溶液磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，其pH＝2。
6.如权利要求1所述的一种基于电化学标准曲面定量检测的方法，其特征在于步骤2)中，所述待测物为食用油抗氧化剂叔丁基对苯二酚TBHQ，TBHQ的测试浓度在1.0×10-4～1.4×10-3。
7.如权利要求1所述的一种基于电化学标准曲面定量检测的方法，其特征在于步骤2)或步骤3)中，采用示差脉冲伏安法检测的参数为：检测DPV曲线在-0.2至0.5V的范围内进行，振幅为0.05V，增量为0.004V。
8.如权利要求1所述的一种基于电化学标准曲面定量检测的方法，其特征在于所述N为3～20之间的整数。
9.如权利要求8所述的一种基于电化学标准曲面定量检测的方法，其特征在于所述N为6～15之间的整数。
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| Three-dimensional graphite paper based imprinted electrochemicalsensor for tertiary butylhydroquinone selective recognition andsensitive detection;Limei Fan 等;《Sensors and Actuators B: Chemical》;第256卷;520-527 * |
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