CN113699258A - 一种同时检测克罗诺杆菌和沙门氏菌的引物组合、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种同时检测克罗诺杆菌和沙门氏菌的引物组合、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测克罗诺杆菌和沙门氏菌的引物组合、试剂盒及其应用，属于食品安全技术领域。为了解决传统微生物学方法检测沙门氏菌和克罗诺杆菌中存在的问题，本发明提供一种基于LAMP反应的双重试纸条和引物组合如SEQ ID NO:1‑8所示，步骤为提取沙门氏菌和克罗诺杆菌DNA并经过LAMP反应扩增出大量目标产物，通过在稳定胶体金、金标抗体、复溶液和稀释液制备的基础上构建的双重试纸条对结果进行肉眼直接判读。本发明获得的双重试纸条具有制作简单、成本低廉以及检测灵敏等优点，可用于同时检测食品及食品加工过程中的沙门氏菌和克罗诺杆菌污染，尤其是婴幼儿配方乳粉中的致病菌污染。

Description

一种同时检测克罗诺杆菌和沙门氏菌的引物组合、试剂盒及 其应用
技术领域
本发明属于食品安全技术领域，具体一种同时检测克罗诺杆菌和沙门氏菌的引物组合、试剂盒及其应用。
背景技术
近年来，随着一系列涉及食源性致病菌的奶粉召回和重大感染事件的爆发，乳中致病菌的污染问题引起了全世界的关注。乳粉中食源性致病菌包括克罗诺杆菌、大肠埃希氏杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌和单核细胞增多性李斯特菌等，其中严重威胁婴儿健康以及生命安全的种类主要为克罗诺杆菌和沙门氏菌。
沙门氏菌，是全球范围内最常见的食源性致病菌之一，属于肠杆菌科家族中的一种能运动、无芽孢的兼性厌氧革兰氏阴性菌，当人体感染沙门氏菌12到14小时后，便会出现许多临床症状，例如：恶心、肠胃炎以及呕吐等。在沙门氏菌属中，致病性较强的有肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌两种。奶粉和婴儿配方乳粉中污染了非伤寒沙门氏菌是造成婴幼儿腹泻、败血症和脑膜炎等症状的重要原因，并且低水平的污染便可以产生感染的爆发，因此，尤以牛奶为原料的食品进行沙门氏菌的快速检测在食品安全领域有着极其重要的意义。
克罗诺杆菌属是肠杆菌科的一员，该菌是兼性厌氧型的革兰氏阴性致病菌，被定义为一种能够危及婴幼儿特别是新生儿生命的致病微生物，会引起新生儿严重的菌血症、坏死性小肠结肠炎以及脑膜炎等疾病。与其他食源性致病菌相比，该菌感染率不高，但对于特殊人群有高达40％—80％致死率。在克罗诺杆菌属中克罗诺杆菌、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌和苏黎世克罗诺杆菌这三个种与婴幼儿感染相关疾病具有非常紧密的联系。同时，在国际相关微生物检测标准中也明确指出克罗诺杆菌在PIF中是不能被检出的，在2002年，国际食品微生物委员会将克罗诺杆菌列为“可对特定人群造成生命威胁”的一种食源性致病微生物。因此，建立一种快速检测婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌属的方法对乳粉生产企业以及消费者都具有非常重要的意义。
目前，对沙门氏菌、克罗诺杆菌的检测方法主要有以培养为基础的传统微生物学法、基于抗原抗体的免疫学检测方法和分子生物学检测法，如核酸探针技术、聚合酶链式反应(PCR)和等温扩增技术等。传统的微生物学方法需要极长的检测时间和极繁琐的检测步骤，并不适合于当代快速生活和生产的节奏，所以该方法不能满足食源性致病菌快速检测的需求，因此迫切需要一种操作简单、快速的检测技术。
发明内容
本发明的目的是为了解决利用传统微生物学等检测致病菌方法中存在的问题，实现同时检测克罗诺杆菌和沙门氏菌。
本发明提供了一种同时检测克罗诺杆菌和沙门氏菌的引物组合，所述引物组合由以下序列组成：
SEQ ID NO:1所示序列：AGAAGCTTTTCAGAAGAGGA；
SEQ ID NO:2所示序列：GATAATAGCTTTACTCGTTGTACT；
SEQ ID NO:3所示序列：
CTGCCTGAGGAATAACCATTTCTATAATAAAGGCTTGGTTAGAAGACA GACA；
SEQ ID NO:4所示序列：
TACGACTGGGATATGAACGGGACTCATGTCAATAACTACATCAG；
SEQ ID NO:5所示序列：GTGTGGTCAACGCAGATG；
SEQ ID NO:6所示序列：TCCTTCCATTCGTGGGACA；
SEQ ID NO:7所示序列：
CGACTCGCTTGCTTGTATTCGTCACCACCTCTACTCGAAG；
SEQ ID NO:8所示序列：AGTGGCCAGCGGAGATGTACCGGTTCGTCACGAAGT。
进一步地限定，所述SEQ ID NO:3的5’端标记生物素；SEQ ID NO:4的5’端标记FITC。
进一步地限定，所述SEQ ID NO:7的5’标记地高辛；SEQ ID NO:8的5’端标记标记FITC。
进一步地限定，所述引物组合的浓度比为：(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)：(SEQID NO:3和SEQ ID NO:4)：(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)：(SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)＝1:(8～10):1:(7～11)。
本发明提供一种同时检测克罗诺杆菌和沙门氏菌的试剂盒，所述试剂盒含有权利要求1所述的引物组合。
进一步地限定，所述试剂盒还包括：阴性对照、阳性对照、dNTP、Mg2+、WarmStartDNA聚合酶和水。
进一步地限定，所述试剂盒还包括：试纸条和上样缓冲液。
进一步地限定，所述试剂盒还包括琼脂糖。
进一步地限定，所述克罗诺杆菌基因组DNA和沙门氏菌的基因组DNA各1μL。
本发明提供上述的引物组合或上述的试剂盒在同时检测克罗诺杆菌和沙门氏菌中的应用，所述应用是0.7～1μL的WarmStart DNA聚合酶、6～7mM的Mg2+、1.4～2mM的dNTP和权利要求1所述的引物组合物、2μL待检测样品DNA，水补足到25μL体系，在反应温度62～64℃和反应时间为45～75min的反应条件下进行反应。
有益效果：本发明的原理在于分别以沙门氏菌、克罗诺杆菌特异性靶基因设计引物，在多重LAMP反应体系中同时扩增，并通过双重免疫反应，以横向流动试纸条监测扩增产物并实现可视化检测。
1)本发明构建的双重检测试纸条，制作方法简单、成本低(每个样品约1.60美元)以及检测速度快(1h内即可完成反应)，为同时检测沙门氏菌和克罗诺杆菌提供新思路，为试纸条检测技术在致病菌检测中的应用提供理论基础。
2)本发明建立的双重试纸条具有很好地储藏稳定性，在室温下存放至少1年或在4℃下存放至少2年，为试纸条检测技术的推广乃至产业化提供了重要支撑。
3)利用本发明建立的方法可用于同时检测乳及乳制品中食源性致病菌，尤其是对婴幼儿配方奶粉生产中的沙门氏菌和克罗诺杆菌污染。
4)LAMP双重检测试纸条用于检测沙门氏菌和克罗诺杆菌，对纯培养物和人工污染婴幼儿配方乳粉的检测灵敏度均为100CFU/mL，且特异性良好。
附图说明
图1为沙门氏菌LAMP引物的筛选；其中，M:DNA Marker D2000；1-6:LAMP检测沙门氏菌第一至第六套引物siiA-1、siiA-2、siiA-3、siiA-4、siiA-5和siiA-6；
图2为克罗诺杆菌LAMP引物的筛选；其中，1-3:LAMP检测克罗诺杆菌第一至第三套引物ITS-1,ITS-2和ITS-3；
图3为LAMP体系中外引物与内引物浓度比的优化；其中，a)是沙门单重LAMP反应中外引物与内引物浓度比的优化，M:DNA Marker D2000；1:阴性对照；2：1:2；3：1:4；4：1:6；5：1:8；6：1:10；7：1:12；b)是沙门氏菌和克罗诺杆菌双重LAMP反应中外引物与内引物浓度比的优化，1：1:5；2：1:7；3：1:9；4：1:11)；
图4为双重LAMP体系中dNTP浓度的优化；其中，M：DNA Marker D2000；1：阴性对照；2：1.2mM；3：1.4mM；4：1.6mM；5：1.8mM；6：2mM；
图5为双重LAMP反应中甜菜碱浓度的优化；其中M:DNA Marker D2000；1：阴性对照；2：0mM；3：1mM；4：2mM；5：3mM；
图6为双重LAMP反应中镁离子浓度的优化；其中，M：DNA Marker D2000；1：阴性；2：1mM；3：2mM；4：3mM；5：4mM；6：5mM；7：6mM；8：7mM；
图7为双重LAMP反应中Bst 2.0 WarmStartDNA聚合酶浓度的优化；其中，M:DNAMarker D2000；1：0.5μL；2：0.6μL；3：0.7μL；4：0.8μL；5：0.9μL；6：1μL；7：阴性对照；
图8为双重LAMP反应温度的优化；其中，M:DNA Marker D2000；1-6：60℃～65℃；
图9为双重LAMP反应时间的优化；其中，M：DNA Marker D2000；1：30min；2：45min；3：60min；4：75min；5：90min；6：阴性对照；
图10为抗地高辛抗体pH值的优化；其中a)是肉眼观察；b)是灰度值读取。1、3、5分别代表抗地高辛抗体pH值为7.5、8和9的阴性结果；2、4、6分别代表抗地高辛抗体pH值为7.5、8和9的阳性结果；
图11为抗地高辛抗体浓度的确定；其中，a)肉眼观察不同抗体浓度的检测结果；b)灰度值读取不同抗体浓度的检测灰结果；1-4分别对应表11中所示的四种包埋抗体的条件；
图12为稀释液pH值的优化；其中，1、3、5、7：稀释液pH值分别为7.5、8、9、10的阴性结果；2、4、6、8：稀释液pH值分别为7.5、8、9、10的阳性结果；
图13为稀释液中氯化钠浓度的优化；其中，1、3、5、7、9：氯化钠浓度分别为0，0.01，0.02，0.05，0.1M时的阴性结果；2、4、6、8、10：氯化钠浓度分别为0，0.01，0.02，0.05，0.1M时的阳性结果；
图14为金标抗体稀释浓度的优化；其中，1、3、5：复溶液体积分别为60、80和100μL时的阴性结果；2、4、6：复溶液体积分别为60、80和100μL时的阳性结果；
图15为双重横向流动试纸条检测原理图；
图16为不同检测方法检测沙门氏菌和克罗诺杆菌纯培养物的灵敏度；其中，a)是双重LAMP与琼脂糖凝胶电泳相结合的检测方法；b)是双重LAMP与横向流动试纸条相结合的检测方法；M:DNA Marker D2000；1：阴性对照；2-12：纯培养物中沙门氏菌的浓度为5.2×108CFU/mL～5.2×10-2CFU/mL以及克罗诺杆菌的浓度为3.2×108CFU/mL～3.2×10-2CFU/mL)；
图17为不同检测方法检测人工污染婴儿配方乳粉中沙门氏菌和克罗诺杆菌的灵敏度；其中，a)是双重LAMP与琼脂糖凝胶电泳相结合的检测方法；b)是双重LAMP与横向流动试纸条相结合的检测方法。M:DNA Marker D2000；1：阴性对照；2-12：婴儿配方乳粉中污染有沙门氏菌的浓度为4.3×108CFU/g～4.3×10-2CFU/g以及克罗诺杆菌浓度为2.8×108CFU/g～2.8×10-2CFU/g)；
图18为双重试纸条稳定性；其中，1、3、5、7：在45℃干燥条件下分别保存第0、10、20、和30天的阴性结果；2、4、6、8：在45℃干燥条件下分别保存第0、10、20、和30天的阳性结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做出进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例所用的材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域常规的材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得，所用各种菌株均来源于东北农业大学乳品重点实验室。
实施例1.双重LAMP反应体系的建立
(1)不同致病菌LAMP扩增引物的设计
分别针对沙门氏菌siiA基因、克罗诺杆菌ITS序列作为靶序列设计并筛选引物。
①沙门氏菌
针对沙门氏菌保守序列siiA基因(STM4257，在NCBI中的序列号为：NC_003197)设计LAMP引物，并且应用网上在线软件PrimerExplorer V4设计出6套引物(表1～6)。最后，将筛选出的特异性引物作为模板进行LAMP扩增，并将扩增效率最好的一套引物用于后续实验。结果如图1，引物siiA-1扩增效果最优。
表1 LAMP检测沙门氏菌引物siiA-1
Figure BDA0003239750630000051
表2 LAMP检测沙门氏菌引物siiA-2
Figure BDA0003239750630000052
表3 LAMP检测沙门氏菌引物siiA-3
Figure BDA0003239750630000053
Figure BDA0003239750630000061
表4 LAMP检测沙门氏菌引物siiA-4
Figure BDA0003239750630000062
表5 LAMP检测沙门氏菌引物SiiA-5
Figure BDA0003239750630000063
表6 LAMP检测沙门氏菌引物siiA-6
Figure BDA0003239750630000064
②克罗诺杆菌
对克罗诺杆菌保守序列ITS进行LAMP引物的设计，并且应用网上在线软件PrimerExplorer V4设计出3套LAMP引物(表7～9)。最后，将筛选出的特异性引物作为模板进行LAMP扩增，并将扩增效率最好的一套引物用于后续实验。结果如图2所示，引物ITS-3扩增效果最优。
表7 LAMP检测克罗诺杆菌引物ITS-1
Figure BDA0003239750630000065
Figure BDA0003239750630000071
表8 LAMP检测克罗诺杆菌引物ITS-2
Figure BDA0003239750630000072
表9 LAMP检测克罗诺杆菌引物ITS-3
Figure BDA0003239750630000073
③双重LAMP扩增引物
应用上述所筛选出的检测沙门氏菌和克罗诺杆菌的LAMP引物构建双重LAMP检测体系。双重LAMP反应中所用两套引物的序列和标记情况如表10所示。
表10双重LAMP检测体系所用引物及标记方法
Figure BDA0003239750630000074
(2)基于利用实施例1(1)中筛选的引物构建双重LAMP扩增体系。分别优化引物浓度比、dNTP浓度、甜菜碱浓度、Mg2+浓度、Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶添加量、反应温度和时间。添加0.7～1μL的WarmStart DNA聚合酶Mg2+、dNTP和引物组合物、2μL待检测样品DNA，水补足到25μL体系。
(3)①引物浓度比优化
首先对沙门氏菌引物浓度比进行优化，将除了内引物以外的所有成分全部固定，向体系中加入不同浓度的内引物，从而达到与外引物形成不同的浓度比例进而对其进行优化。在优化过程中，使外引物与内引物的浓度比分别为：1：2、1：4、1：6、1：8、1：10和1：12。根据以上比例分别调整并配制相应的LAMP反应体系，在65℃条件下进行LAMP反应1h，随后为达到终止反应的目的，在80℃条件下加热5min。最后，用2％AGE对5μL扩增产物进行检测。将电泳条带最亮的条件，作为沙门氏菌单重LAMP反应的最佳引物浓度比。结果如图3中的a)所示，引物siiA-1引物浓度比为1:8～10扩增效果好。
随后对克罗诺杆菌引物浓度比进行优化，将上述沙门氏菌所用引物的量确定为单重LAMP检测时所用量的一半，再将检测克罗诺杆菌的外引物与内引物浓度比分别按照1:5，1:7，1:9和1:11加入到体系中，其他反应条件同上，最后，用2％AGE对5μL扩增产物进行检测。将电泳条带最亮的条件，作为沙门氏菌、克罗诺杆菌双重LAMP反应的最佳引物浓度比。结果如图3中的b)所示，ITS-3引物浓度比为1:7～11。
综上，引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)：(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)：(SEQID NO:5和SEQ ID NO:6)：(SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)＝1:(8～10):1:(7～11)。
②dNTP浓度优化
基于上述优化的沙门氏菌、克罗诺杆菌最优引物浓度比，将dNTP的浓度控制在1.2、1.4、1.6、1.8和2.0mM，其他反应条件同上，并通过琼脂糖凝胶电泳确定dNTP的浓度范围。结果如图4，dNTP最适的浓度范围为1.4～2mM。
③甜菜碱浓度优化
基于上述优化条件，将甜菜碱的浓度控制在0、0.2、0.4、0.6和0.8mM，其他反应条件同上，并通过琼脂糖凝胶电泳确定甜菜碱的浓度范围。结果如图5所示，不加甜菜碱效果最优。
④Mg2+浓度优化
基于上述优化条件，将Mg2+的浓度控制在2、3、4、5、6和7mM，其他反应条件同上，并通过琼脂糖凝胶电泳确定Mg2+的浓度范围。结果如图6所示，Mg2+浓度为6～7mM效果最优。
⑤Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶添加量的优化
基于上述优化条件，将Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶的添加量控制在0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1μL，其他反应条件同上，并通过琼脂糖凝胶电泳确定Bst 2.0 WarmStartDNA聚合酶的添加量范围。结果如图7所示，Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶的添加量为0.7～1μL效果最优。
⑥反应温度优化
基于上述优化条件，将反应温度控制在61～65℃，其他反应条件同上，并通过琼脂糖凝胶电泳确定反应温度范围。结果如图8所示，反应温度62～64℃效果最优。
⑦反应时间优化
基于上述优化条件，将反应时间控制在30～90min，其他反应条件同上，并通过琼脂糖凝胶电泳确定反应温度范围。结果如图9所示，反应时间为45～75min效果最优。
实施例2.双重试纸条构建
(1)包被抗体条件的确定
T1线包被抗链酶亲和素抗体，T2线包被抗地高辛抗体：在NC膜中包被抗体的优化决定着双重LFD的检测效果，分别对抗体pH值和抗体浓度优化。对抗地高辛抗体的pH值进行优化，实验结果如图10所示。结果表明，无论抗地高辛抗体的pH值为多少时，阴性结果都存在微弱的假阳性，pH值为9时，阳性结果中T2线的检测信号最强。根据表11进行第二种抗体浓度的优化，结果如图11所示。当T1线抗体稀释浓度为0.5mg/mL时，T1线检测信号明显下降，会影响T1线检测灵敏度，因此T1线抗体浓度确定为1mg/mL。对于T2线抗体检测结果通过肉眼不能很好的判断，因此应用Quantity One软件对图11中的a)进行灰度值的读取。从图11中的b)所显示的灰度值可以得知：当T1线抗体稀释浓度均为1mg/mL时，T2线抗体浓度为1.5mg/mL所产生的检测信号弱于抗体浓度为1mg/mL。同时，T2线抗体喷条浓度为1.5μL/cm所产生的检测信号弱于T2线抗体喷条浓度为1μL/cm时的检测信号。通过实验结果可以发现：降低T1线抗体浓度并不会明显增加T2线检测信号；增加抗体喷条浓度不会增加检测信号；当检测线抗体量过多时，反而会降低检测信号。综上所述，最佳的包被抗体条件为：T1线包被链酶亲和素浓度为1mg/mL，pH值为9；T2线包被抗地高辛抗体浓度为1mg/mL，pH值为9。并且两条检测线上抗体的喷条浓度均为1μL/cm。
表11双重LFD包被抗体浓度的优化
Figure BDA0003239750630000091
(2)稀释液成分的确定
以50～150mM Tris(pH 8)缓冲液、0.05％～0.15％酪蛋白、0.2％BSA、0.5％～1％TritonX-100、0.5％～1％PEG 2000和2％～4％海藻糖为基础配方，对稀释液的pH和氯化钠浓度进行优化。
①稀释液pH值的确定
复溶液-稀释液-包被抗体三部分的pH值会形成一整套的检测pH值体系，在构建双重LFD时，对稀释液pH值(7.5、8、9和10)进行优化，从而达到提高检测信号的目的。结果如图12所示，随着稀释液pH值从7.5增加至10时，双重LFD的检测线信号有着逐步和明显的增强，但当稀释液的pH值增加至10时，T2线出现了明显的假阳性结果。所以在构建双重LFD的实验中，稀释液最佳pH值为8～9。
②氯化钠浓度的确定
氯化钠在构建试纸条的过程中，可以有效的提高抗原抗体的特异性反应。因此，在构建双重LFD的过程中，对稀释液中氯化钠的浓度(0、0.01、0.02、0.05和0.1M)进行优化，从而消除所出现的假阳性检测结果。结果如图13所示，当双重试纸条稀释液中氯化钠的浓度小于0.01M时，第二条检测线(T2线)出现了明显的的假阳性现象，随着氯化钠浓度从0.01M增加到0.1M时，双重试纸条的假阳性现象消失，与此同时阳性结果的信号随之降低，因此在构建双重试纸条时，稀释液中加入氯化钠最佳范围为0.01～0.02M。
(3)金标抗体浓度的确定
当金标抗体的量不够充足时，会影响LAMP产物与其结合所形成结合物的量，从而会影响整个检测体系检测信号的强度以及检测灵敏度。因此，对金标抗体的稀释浓度进行优化是非常有必要的。具体方法为：在制备金标抗体的过程中，分别用不同量的复溶液(60、80和100μL)对金标抗体进行稀释和重悬，组装双重试纸条后应用所构建的试纸条对双重LAMP反应的阴性和阳性产物进行检测，并对检测结果进行观察和判断。结果如图14所示，当使用60μL的复溶液进行重悬金标抗体后，两条检测线的信号虽然增强，但出现了明显的T1和T2检测线的假阳性现象。而其他阴性结果全部正常，并且随着重悬所用复溶液体积的增加，检测线条带亮度逐渐变暗。因此，在本实验中，重悬金标抗体时，所用最佳的复溶液体积为80～100μL。
(4)试纸条的组装
试纸条主要由四部分组成，分别为：样品垫、金标结合垫、检测区(NC膜)和吸水垫。在组装试纸条时，首先将喷涂好抗体的NC膜粘附在PVC底板上，在试纸条上端交叠NC膜2mm的位置粘贴吸水垫，在NC膜的另一端交叠NC膜2mm的位置，粘贴处理好的金标结合垫，最后在金标结合垫的另一端交叠2mm的位置，粘贴处理好的样品垫。将试纸条交叠处压实，防止后续实验过程中发生脱落。随后，用自动切条机将试纸条切割成3mm的宽度。最后，将切好的试纸条放入自封袋中，在4℃条件下密闭干燥保存。原理图如图15所示，sample pad(样品垫),conjugate pad(结合垫),T1 line(T1线),T2 line(T2线),control line(对照线),absorbent pad(吸水垫垫),backing card(底板卡),anti-digoxigenin antibody(抗地高辛抗体),anti-biotin antibody(抗生物素抗体),anti-mouse secondary antibody(抗小鼠二抗),anti-FITC-AuNP(抗FITC-aunp),products(产品),the LAMP products labeled(LAMP产品标记),the LAMP products labeled with FITC and digoxigenin(FITC和地高辛标记的LAMP产品)。
施例3.LAMP双重试纸条检测沙门氏菌和克罗诺杆菌
(1)菌株的活化、培养与DNA提取
将选取的冻存菌液按照2％比例加入LB液体培养基中，37℃条件下培养8h，重复以上操作，对菌液进行二次活化。随后接种于LB固体培养基中，37℃条件下培养12h-16h，将平板置于4℃条件下保存备用，并作为短期保藏菌种。挑取单菌落于LB培养基中，在37℃200r/min条件下培养8h，此时菌种达到对数生长期末期。
应用煮沸法对纯培养物中不同微生物的细菌基因组DNA进行提取,具体步骤如下：
步骤一、将1mL菌液，在12,000×g条件下离心2min，弃去上层液体。
步骤二、用50μL TE缓冲液重悬。
步骤三、在95℃条件下加热10min。
步骤四、在12,000×g条件下离心2min,用离心管收集上清液，即为提取的基因组DNA，在-20℃条件下保存备用
(2)灵敏度检测：
LAMP-LFD技术是环介导横温扩增技术(Loop-mediated isothermalamplification)与横向流动试纸条(Lateral flow dipstick)
LAMP-AGE技术是环介导横温扩增技术与琼脂糖凝胶电泳。
①对纯培养物的检测灵敏度
选择沙门氏菌ATCC 14028和阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544作为目标菌株，对其进行双重LAMP-LFD法和双重LAMP-AGE法检测灵敏度的确定。按照实施例3(1)中所述方法对两种不同目标菌进行培养，并达到对数生长期末期。随后，用浓度为0.85％的灭菌生理盐水将两种不同的菌液分别进行十倍梯度的稀释，并应用标准平板计数法对菌液浓度进行确定，得到沙门氏菌的菌液浓度范围在5.2×108到5.2×10-2CFU/mL之间，克罗诺杆菌的菌液浓度范围在3.2×108到3.2×10-2CFU/mL之间。对每个稀释度的1mL菌液按照实施例3(1)中所示的方法进行DNA的提取，并分别取2μL加入到最佳双重LAMP反应体系中，用实施例2中所构建的方法进行灵敏度相关检测，从而确定相应检测方法的检测灵敏度。
纯培养物中灵敏度的检测结果如图16所示，在图16中的a)中，应用双重LAMP-AGE检测方法检测时，当沙门氏菌和克罗诺杆菌的浓度范围在108CFU/mL到100CFU/mL之间时，出现了特有的梯形条带，而浓度为10-1CFU/mL和10-2CFU/mL时，与阴性结果相同，没有出现扩增。证明双重LAMP-AGE检测法对纯培养物中沙门氏菌和克罗诺杆菌的检测灵敏度相同，分别为5.2×100CFU/mL和3.2×100CFU/mL。在图16中的b)中，应用双重LAMP-LFD检测方法检测时，当沙门氏菌和克罗诺杆菌的浓度范围在108CFU/mL到100CFU/mL之间时，双重LFD的C线和两条T线均出现了检测信号，证明检测结果为双阳性；而其他菌浓度时，只有C线出现了检测信号，证明检测结果为阴性。由此证明，双重LAMP-LFD检测法对沙门氏菌和克罗诺杆菌纯培养物的检测灵敏度相同相同，分别为5.2×100CFU/mL和3.2×100CFU/mL。综上所述，在本研究中建立的双重LAMP-AGE和双重LAMP-LFD两种检测方法，对纯培养物的检测灵敏度具有相同的限量级，均为100CFU/mL。
②乳中致病菌检测灵敏度
将两种目标菌株(沙门氏菌和克罗诺杆菌)人工污染至婴儿配方乳粉中，分别取1mL每个浓度梯度的两种菌液与7mL蛋白胨水溶液(BPW)充分混合后，分别加入1g婴儿配方乳粉。此时，便获得了含有相同浓度梯度的沙门氏菌和克罗诺杆菌的乳样品。分别取1mL不同浓度的液体乳样品，实施例3(1)中所示的方法进行DNA的提取。并将2μL不同浓度的DNA提取液作为模板分别进行双重LAMP扩增，并且应用双重LFD和AGE两种方法分别对LAMP产物进行检测。
在婴幼儿配方乳粉中灵敏度检测结果如图17所示，在图17中的a)中，应用双重LAMP-AGE法对人工污染婴儿配方乳粉中沙门氏菌和克罗诺杆菌进行灵敏度的检测，当沙门氏菌和克罗诺杆菌的浓度范围在4.3×108CFU/g到4.3×100CFU/g以及2.8×108到2.8×100CFU/g之间时，出现了特有的梯形条带，而其他浓度时，均出现阴性的检测结果，没有出现扩增。证明双重LAMP-AGE法检测人工污染PIF中沙门氏菌和克罗诺杆菌这两种致病菌的检测灵敏度分别为4.3×100CFU/g和2.8×100CFU/g。在图17中的b)中，应用双重LAMP-LFD法对人工污染婴儿配方乳粉中沙门氏菌和克罗诺杆菌进行灵敏度的检测，当沙门氏菌和克罗诺杆菌的浓度范围在4.3×108CFU/g到4.3×100CFU/g以及2.8×108到2.8×100CFU/g之间时，试纸条的C线和两条T线均出现了检测信号，证明检测结果为双阳性；而在其他浓度范围时，只有C线出现检测信号，证明检测结果为阴性。因此，证明了双重LAMP-LFD法对人工污染PIF中沙门氏菌和克罗诺杆菌这两种致病菌的检测灵敏度分别为4.3×100CFU/g和2.8×100CFU/g。综上所述，在研究中建立的双重LAMP-AGE和双重LAMP-LFD两种检测方法，在婴儿配方乳粉中对沙门氏菌和克罗诺杆菌的检测具有相同的检出限数量级，均为100CFU/g。
(3)双重试纸条特异性研究
应用已构建好的双重LAMP-LFD和双重LAMP-AGE两种检测方法，分别对所有21株沙门氏菌、7株克罗诺杆菌和29株其他非目标菌株进行细菌基因组DNA的快速检测。每个菌株均重复检测三次。结果如表12所示，
表12双重检测法的特异性检测结果
Figure BDA0003239750630000131
Figure BDA0003239750630000141
双重LAMP-AGE:双重环介导等温扩增(LAMP)与琼脂糖凝胶电泳(AGE)相结合的方法同时检测两种不同的目标序列；
双重LAMP-LFD：双重环介导等温扩增(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)相结合的方法同时检测两种不同的目标序列。
(4)双重试纸条稳定性研究
稳定性是评价LFD的重要指标之一，选用加速老化实验来评价试纸条的稳定性。根据阿伦尼乌斯公式可以计算出对应的温度与老化天数的关系。当试纸条在45℃干燥密封的条件下存放一个月，相当于在室温干燥的条件下保存1年以上或者在4℃干燥的条件下保存2年以上。稳定性测试结果如图18所示，在45℃条件下，将双重LFD分别保存第0、10、20、和30天时，取试纸条进行双重LAMP反应阴性产物进行检测时，检测结果全部正常，没有假阳性结果的产生；同时对双重LAMP反应阳性产物进行检测时，检测线条带亮度没有明显的变化。由以上结果可以判断出所构建的双重LFD在45℃干燥条件下保存一个月后，不会对试纸条的检测效果产生明显的影响。由此可以证明双重试纸条在室温干燥的条件下可以保存1年以上或者在4℃干燥的条件下保存2年以上。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 东北农业大学
<120> 一种同时检测克罗诺杆菌和沙门氏菌的引物组合、试剂盒及其应用
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (10)

1.一种同时检测克罗诺杆菌和沙门氏菌的引物组合，其特征在于，所述引物组合由以下序列组成：
SEQ ID NO:1所示序列：AGAAGCTTTTCAGAAGAGGA；
SEQ ID NO:2所示序列：GATAATAGCTTTACTCGTTGTACT；
SEQ ID NO:3所示序列：
CTGCCTGAGGAATAACCATTTCTATAATAAAGGCTTGGTTAGAAGACA GACA；
SEQ ID NO:4所示序列：
TACGACTGGGATATGAACGGGACTCATGTCAATAACTACATCAG；
SEQ ID NO:5所示序列：GTGTGGTCAACGCAGATG；
SEQ ID NO:6所示序列：TCCTTCCATTCGTGGGACA；
SEQ ID NO:7所示序列：
CGACTCGCTTGCTTGTATTCGTCACCACCTCTACTCGAAG；
SEQ ID NO:8所示序列：AGTGGCCAGCGGAGATGTACCGGTTCGTCACGAAGT。
2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述SEQ ID NO:3的5’端标记生物素；SEQ ID NO:4的5’端标记FITC。
3.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述SEQ ID NO:7的5’标记地高辛；SEQ ID NO:8的5’端标记标记FITC。
4.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合的浓度比为：(SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2)：(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)：(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)：(SEQID NO:7和SEQ ID NO:8)＝1:(8～10):1:(7～11)。
5.一种同时检测克罗诺杆菌和沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的引物组合。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：阴性对照、阳性对照、dNTP、Mg2+、WarmStart DNA聚合酶和水。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：试纸条和上样缓冲液。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括琼脂糖。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述克罗诺杆菌基因组DNA和沙门氏菌的基因组DNA各1μL。
10.权利要求1-4任一项所述的引物组合或权利要求5-9任一项所述的试剂盒在同时检测克罗诺杆菌和沙门氏菌中的应用，其特征在于，所述应用是添加0.7～1μL的WarmStartDNA聚合酶、6～7mM的Mg2+、1.4～2mM的dNTP和权利要求1所述的引物组合物、2μL待检测样品DNA，水补足到25μL体系，在反应温度62～64℃和反应时间为45～75min的反应条件下进行反应。
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