CN113698538A - 一种负载姜黄素的LTBX-g-HEMA/EGDMA纳米粒的制备方法 - Google Patents

一种负载姜黄素的LTBX-g-HEMA/EGDMA纳米粒的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种负载姜黄素的LTBX‑g‑HEMA/EGDMA纳米粒的制备方法。以蔗渣木聚糖为原料，甲基丙烯酸羟乙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯为接枝单体，过硫酸铵为引发剂，在水溶剂中通过自由基反应合成蔗渣木聚糖三元接枝共聚物BX‑g‑HEMA/EGDMA；以4‑二甲氨基吡啶为催化剂，在氯化1‑烯丙基‑3‑甲基咪唑溶剂中，经茶氨酸酯化反应合成蔗渣木聚糖茶氨酸酯‑g‑HEMA/EGDMA；采用乳化分散‑TPP交联法制备负载姜黄素的蔗渣木聚糖茶氨酸酯‑g‑HEMA/EGDMA纳米粒。本发明提高了蔗渣木聚糖在医药、功能材料领域的应用价值，且具有安全性高、毒副作用小的特点。

Description

一种负载姜黄素的LTBX-g-HEMA/EGDMA纳米粒的制备方法
技术领域
本发明涉及生物质功能高分子材料技术领域，特别是一种负载姜黄素的LTBX-g-HEMA/EGDMA纳米粒即LTBX-g-HEMA/EGDMA-Cur纳米粒的制备方法。
背景技术
随着纳米技术的迅猛发展，纳米材料在癌症治疗方面取得显著成效。据研究报道，已有多种天然产物用于癌症治疗。其中，姜黄素(Cur)是一种从姜黄中分离出来的植物化学物质，它对肺癌、乳腺癌、宫颈癌等多种肿瘤细胞具有抗癌活性，且无明显毒副作用。然而，姜黄素存在代谢速率快、生物利用度低、稳定性较差等缺陷，因而其临床应用受到了较大地限制。而生物质多糖中羟基含量较高，具有一定的化学与生物活性，能够与许多活性基团通过化学键进行修饰。故本发明选取生物质多糖蔗渣木聚糖为纳米载体，不仅可以有效改善疏水性功能因子的生物利用率，还在提高机体免疫力及抗肿瘤活性等方面具有显著优势，为抗癌的有效协同增效治疗提供了新思路。
茶氨酸(LT)是茶叶中特有的非蛋白质氨基酸，可在生物化学及分子水平对肿瘤发生的多个环节进行干预，还可以提高多种化疗药物的敏感性，增强肿瘤特异性，减轻其毒副作用。若以蔗渣木聚糖作为纳米载体，可凭借其结构内的羟基来制备姜黄素纳米粒，进而改善姜黄素水溶性及生物利用率，使药物产生特定的靶向作用，在增强抗癌疗效、降低毒性等方面表现出独特优势，实现提高蔗渣木聚糖衍生物生物活性的目的。通过分子对接模拟可知，本发明合成的蔗渣木聚糖衍生物与受体蛋白6USZ的最佳结合自由能为-29.63kJ/mol，即化合物与受体蛋白的结合能力较强，对肺癌细胞的抑制作用较强。该结果为新型抗肺癌药物的研发奠定了良好基础，具有良好的应用前景。
本发明以蔗渣木聚糖(BX)为主要原料，甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)为接枝单体，过硫酸铵为引发剂，在水溶剂中通过自由基反应合成蔗渣木聚糖三元接枝共聚物BX-g-HEMA/EGDMA；然后，以4-二甲氨基吡啶为催化剂，在氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑溶剂中，经茶氨酸酯化反应合成蔗渣木聚糖茶氨酸酯-g-HEMA/EGDMA；最后采用乳化分散-TPP交联法制备负载姜黄素的蔗渣木聚糖茶氨酸酯-g-HEMA/EGDMA纳米粒即LTBX-g-HEMA/EGDMA-Cur纳米粒。
发明内容
本发明旨在制备一种安全高效的具有靶向作用的姜黄素纳米粒，解决姜黄素等难溶性植物分子在给药上存在的难题，提高其生物利用度，为研究新型多靶点药物载体奠定基础，提供了一种负载姜黄素的LTBX-g-HEMA/EGDMA纳米粒即LTBX-g-HEMA/EGDMA-Cur纳米粒的合成方法。
本发明的具体步骤为：
(1)称取6.0～8.0g蔗渣木聚糖置于60℃真空恒温干燥箱内干燥24小时至恒重，得干基蔗渣木聚糖。
(2)称取0.90～1.8g过硫酸铵于50mL烧杯中，加入10～20mL蒸馏水，在室温下搅拌溶解，配置成引发剂溶液，然后倒入100mL恒压滴液漏斗中，备用。
(3)量取3.0～6.0mL分析纯甲基丙烯酸羟乙酯和3.0～6.0mL分析纯乙二醇二甲基丙烯酸酯置于50mL烧杯中，搅拌均匀后得单体混合液，倒入另一100mL恒压滴液漏斗中，备用。
(4)称取5.0～7.0g步骤(1)所得干基蔗渣木聚糖置于250mL四口烧瓶中，再加入50～100mL的蒸馏水，升温至50～60℃，搅拌活化30～50分钟，得蔗渣木聚糖活化液。
(5)滴加三分之一步骤(2)所得引发剂溶液至步骤(4)所得蔗渣木聚糖活化液内，控制温度在50～60℃、滴加时间为40～60分钟，滴加完毕后，继续搅拌20～30分钟；然后分别同步滴加步骤(3)所得单体混合液及剩余三分之二步骤(2)所得引发剂溶液，控制体系温度在50～70℃，滴加时间在2～4小时，待单体混合液及引发剂溶液全部滴加完毕后，继续反应1～3小时。反应结束后，将所得物料冷却至室温。
(6)向步骤(5)所得物料中加入50～70mL分析纯环己烷，沉析20～30分钟，然后进行抽滤。依次分别量取10～20mL分析纯环己烷和10～15mL分析纯无水乙醇对沉析物进行洗涤、抽滤，重复上述步骤2～3次。将所得滤饼置于60℃恒温干燥箱内干燥24小时至恒重，即得粗BX-g-HEMA/EGDMA接枝共聚物。
(7)将步骤(6)所得粗BX-g-HEMA/EGDMA接枝共聚物置于索氏抽提器中，加入50～70mL分析纯环己烷，抽提18～24小时；抽提完毕后，取出物料放入表面皿中，置于60℃真空恒温干燥箱中干燥16～24小时至恒重，得纯接枝共聚物BX-g-HEMA/EGDMA。
(8)将40.0～60.0g氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑加入到250mL四口烧瓶中，加入15～25mL蒸馏水，将四口烧瓶置于水浴锅中加热至50～60℃，使氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑溶解为明亮的黄色液体；然后将4.0～5.0g干燥的BX-g-HEMA/EGDMA、0.30～1.5g 4-二甲氨基吡啶、0.1～0.15g蒙脱土加入四口烧瓶中，搅拌分散0.5～1小时；称取3.0～6.0g茶氨酸，均匀分三次每次间隔20分钟加入四口烧瓶中，控制反应温度在50～70℃，搅拌反应4～6小时。反应结束后将体系温度降至室温。
(9)向步骤(8)所得的物料中加入50～70mL的分析纯无水乙醇沉析20～30分钟，然后抽滤；每次量取10～15mL分析纯无水乙醇、15～20mL环己烷对滤饼洗涤、抽滤2～3次，然后将所得滤饼放入60℃真空恒温干燥箱中干燥24小时，得到产物LTBX-g-HEMA/EGDMA衍生物。
(10)将0.6～0.8g姜黄素加入100mL四口烧瓶中，再加入20～40mL分析纯无水乙醇，置于30℃恒温水浴中搅拌20～30分钟；然后依次加入0.3～0.5g食用卵磷脂和1.5～2.0mL化学纯吐温-80，搅拌0.5～1.5小时，配制成姜黄素乳化液。
(11)称取4.0～5.0g三聚磷酸钠(TPP)加入250mL烧杯中，再加入150mL蒸馏水，室温下搅拌均匀得TPP溶液，备用。
(12)称取6.0～9.0g LTBX-g-HEMA/EGDMA于500mL四口烧瓶中，加入200～220mL蒸馏水，室温下搅拌均匀后，将其置于高速搅拌机中，以800r/min的速率搅拌分散1～3小时，得LTBX-g-HEMA/EGDMA混合液。
(13)将步骤(10)所得姜黄素乳化液和步骤(11)所得TPP溶液同步滴入步骤(12)所得LTBX-g-HEMA/EGDMA混合液混合液中，滴加时间控制在30～60分钟；滴加完毕后，继续搅拌0.5～1.0小时；设置4000r/min离心速率，离心0.5～1.0小时后分离上清液，收集沉淀；每次分别用30～50mL蒸馏水洗涤、离心10分钟，分离上清液，收集沉淀，重复操作2～3次；最后将所得物料送入-25～-18℃冷冻干燥机中冷冻干燥24小时，得纯接枝共聚物负载姜黄素的LTBX-g-HEMA/EGDMA纳米粒即LTBX-g-HEMA/EGDMA-Cur纳米粒。
(14)利用酸碱滴定法对步骤(9)产物LTBX-g-HEMA/EGDMA进行酯化取代度的测定，具体步骤如下：精确称取约0.5g产物LTBX-g-HEMA/EGDMA样品放入50mL锥形瓶中，向锥形瓶中加入30mL去离子水并充分摇匀，加入3～4滴酚酞指示剂，用浓度为0.5mol/L的NaOH标准溶液将样品溶液滴定至浅红色，且能维持30秒内红色不褪去。加入2.5mL浓度0.5mol/L的氢氧化钠溶液，摇匀，密封，在室温下置于电动振荡器震荡皂化4小时后，用浓度为0.5mol/L的盐酸标准溶液滴定至溶液体系为无色，记录滴定消耗的盐酸标准溶液体积为V1；在相同条件下，用蔗渣木聚糖接枝共聚物进行空白滴定，记录消耗的盐酸标准溶液体积V0。目标产物中羧酸酰基的质量分数(wc)、LTBX-g-HEMA/EGDMA的酯化取代度(DS)的计算公式如下：
Figure BDA0003235097480000041
Figure BDA0003235097480000042
式中：
wc——目标产物中含有羧酸酰基的质量分数，％；
V0——进行空白滴定消耗盐酸标准溶液体积，单位mL；
V1——滴定目标产物消耗的盐酸标准溶液体积，单位mL；
CHCl——盐酸标准溶液浓度，单位mol/L；
m——目标产物样品的质量，单位g；
DS——LTBX-g-HEMA/EGDMA的酯化取代度；
M———羧酸酰基的摩尔质量，g/mol；
132——木聚糖脱水单元的相对分子质量。
本发明通过采用接枝、酯化、负载等化学修饰的方法合成了负载姜黄素的LTBX-g-HEMA/EGDMA纳米粒。随着甲基丙烯酸羟乙酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯等功能性基团的引入，蔗渣木聚糖的热稳定性及溶解度均有所提高。通过分子对接可知，产物与受体蛋白6USZ可形成较强的氢键网络和疏水作用，不仅有效地解决了姜黄素水溶性差、在机体内难以吸收等问题，还可以显著提升它在生物体内的利用率，极大地提高蔗渣木聚糖在医药、功能材料等领域的应用价值，且具有安全性高、毒副作用小等特点。
附图说明
图1为原蔗渣木聚糖的SEM照片。
图2为本发明实施例制备的LTBX-g-HEMA/EGDMA的SEM图，
图3为本发明实施例制备的LTBX-g-HEMA/EGDMA-Cur的SEM图。
图4为原蔗渣木聚糖的IR图。
图5为本发明实施例制备的LTBX-g-HEMA/EGDMA及LTBX-g-HEMA/EGDMA-Cur的IR图。
图6为原蔗渣木聚糖和本发明实施例制备的LTBX-g-HEMA/EGDMA的XRD图。
图7为本发明实施例制备的LTBX-g-HEMA/EGDMA-Cur的XRD图。
图8为本发明实施例制备的LTBX-g-HEMA/EGDMA-Cur与6USZ受体蛋白对接图。
图9为本发明实施例制备的LTBX-g-HEMA/EGDMA-Cur与6USZ受体活性空腔对接图。
具体实施方式
实施例：
(1)称取7.0g蔗渣木聚糖置于60℃真空恒温干燥箱内干燥24小时至恒重，得干基蔗渣木聚糖。
(2)称取1.2g过硫酸铵于50mL烧杯中，加入15mL蒸馏水，在室温下搅拌溶解，配置成引发剂溶液，然后倒入100mL恒压滴液漏斗中，备用。
(3)量取5.6mL分析纯甲基丙烯酸羟乙酯和5.8mL分析纯乙二醇二甲基丙烯酸酯置于50mL烧杯中，搅拌均匀后得单体混合液，倒入另一100mL恒压滴液漏斗中，备用。
(4)称取6.0g步骤(1)所得干基蔗渣木聚糖置于250mL四口烧瓶中，再加入75mL的蒸馏水，升温至50℃，搅拌活化30分钟，得蔗渣木聚糖活化液。
(5)滴加三分之一步骤(2)所得引发剂溶液至步骤(4)所得蔗渣木聚糖活化液内，控制温度在60℃、滴加时间为50分钟，滴加完毕后，继续搅拌30分钟；然后分别同步滴加步骤(3)所得单体混合液及剩余三分之二步骤(2)所得引发剂溶液，控制体系温度在60℃，滴加时间在3小时，待单体混合液及引发剂溶液全部滴加完毕后，继续反应2小时。反应结束后，将所得物料冷却至室温。
(6)向步骤(5)所得物料中加入60mL分析纯环己烷，沉析30分钟，然后进行抽滤。依次分别量取15mL分析纯环己烷和10mL分析纯无水乙醇对沉析物进行洗涤、抽滤，重复上述步骤3次。将所得滤饼置于60℃恒温干燥箱内干燥24小时至恒重，即得粗BX-g-HEMA/EGDMA接枝共聚物。
(7)将步骤(6)所得粗BX-g-HEMA/EGDMA接枝共聚物置于索氏抽提器中，加入60mL分析纯环己烷，抽提24小时；抽提完毕后，取出物料放入表面皿中，置于60℃真空恒温干燥箱中干燥24小时至恒重，得纯接枝共聚物BX-g-HEMA/EGDMA。
(8)将60.0g氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑加入到250mL四口烧瓶中，加入20mL蒸馏水，将四口烧瓶置于水浴锅中加热至60℃，使氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑溶解为明亮的黄色液体；然后将4.5g干燥的BX-g-HEMA/EGDMA、0.30g 4-二甲氨基吡啶、0.1g蒙脱土加入四口烧瓶中，搅拌分散0.5小时；称取3.0g茶氨酸，均匀分三次每次间隔20分钟加入四口烧瓶中，控制反应温度在60℃，搅拌反应5小时。反应结束后将体系温度降至室温。
(9)向步骤(8)所得的物料中加入60mL的分析纯无水乙醇沉析30分钟，然后抽滤；每次量取12mL分析纯无水乙醇、15mL环己烷对滤饼洗涤、抽滤3次，然后将所得滤饼放入60℃真空恒温干燥箱中干燥24小时，得到产物LTBX-g-HEMA/EGDMA衍生物。
(10)将0.8g姜黄素加入100mL四口烧瓶中，再加入30mL分析纯无水乙醇，置于30℃恒温水浴中搅拌30分钟；然后依次加入0.3g食用卵磷脂和1.5mL化学纯吐温-80，搅拌1.5小时，配制成姜黄素乳化液。
(11)称取4.5g三聚磷酸钠(TPP)加入250mL烧杯中，再加入150mL蒸馏水，室温下搅拌均匀得TPP溶液，备用。
(12)称取6.0g LTBX-g-HEMA/EGDMA于500mL四口烧瓶中，加入220mL蒸馏水，室温下搅拌均匀后，将其置于高速搅拌机中，以800r/min的速率搅拌分散2小时，得LTBX-g-HEMA/EGDMA混合液。
(13)将步骤(10)所得姜黄素乳化液和步骤(11)所得TPP溶液同步滴入步骤(12)所得LTBX-g-HEMA/EGDMA混合液混合液中，滴加时间控制在30分钟；滴加完毕后，继续搅拌0.5小时；设置4000r/min离心速率，离心0.5小时后分离上清液，收集沉淀；每次分别用30mL蒸馏水洗涤、离心10分钟，分离上清液，收集沉淀，重复操作3次；最后将所得物料送入-25～-18℃冷冻干燥机中冷冻干燥24小时，得纯接枝共聚物负载姜黄素的LTBX-g-HEMA/EGDMA纳米粒即LTBX-g-HEMA/EGDMA-Cur纳米粒。
(14)利用酸碱滴定法对LTBX-g-HEMA/EGDMA的酯化取代度进行测定，测得DSc为0.76。
(15)对LTBX-g-HEMA/EGDMA-Cur进行SEM分析可知，其形貌呈颗粒状，平均粒径在120nm左右。
对BX、LTBX-g-HEMA/EGDMA及LTBX-g-HEMA/EGDMA-Cur进行SEM分析可知，经茶氨酸酯化后的BX-g-HEMA/EGDMA形貌呈棒状结构，棒的直径大约500～700nm；而LTBX-g-HEMA/EGDMA-Cur的形貌呈颗粒状，平均粒径在120nm左右，由于氢键的存在导致粒子黏连。IR分析可知，BX的IR谱图在3432cm-1形成了宽而强的侧链-OH的伸缩振动吸收峰，890～865cm-1处为β-D糖苷键构型的木聚糖分子骨架振动峰；LTBX-g-HEMA/EGDMA的IR谱图在3340cm-1处为-NH的伸缩振动峰，2983cm-1和2940cm-1处为—CH3的伸缩振动峰，1658cm-1处为C＝O伸缩振动峰，1590cm-1和1545cm-1处分别为茶氨酸中伯胺和仲胺-NH面内弯曲振动峰，1161cm-1和1069cm-1分别为茶氨酸中伯胺和仲胺的C—N伸缩振动峰；LTBX-g-HEMA/EGDMA-Cur的IR谱图在3426cm-1处出现-OH特征峰，表明LTBX-g-HEMA/EGDMA与Cur之间发生了相互作用。经XRD分析可知，LTBX-g-HEMA/EGDMA在23°、28°、30°等处出现新的衍射峰，证明其结晶度增大，晶体区域扩大；而LTBX-g-HEMA/EGDMA-Cur的峰形则表现为宽而钝，证明负载姜黄素的LTBX-g-HEMA/EGDMA纳米粒的结晶度降低，晶体区域降低。通过分子对接可知，负载姜黄素的LTBX-g-HEMA/EGDMA纳米粒与6USZ的最佳结合自由能为-29.63kJ/mol，发生氢键作用的氨基酸残基为GLU-62、GLY-10，氢键键长分别为2.1、
Figure BDA0003235097480000071
形成了较强的氢键网络，而且产物与受体蛋白6USZ活性空腔处的疏水环境具有疏水作用，对肺癌细胞表现出较好的抑制作用，说明该产物具有良好的抗肺癌活性。

Claims (1)

1.一种负载姜黄素的LTBX-g-HEMA/EGDMA纳米粒即LTBX-g-HEMA/EGDMA-Cur纳米粒的制备方法，其特征在于具体步骤为：
(1)称取6.0~8.0g蔗渣木聚糖置于60℃真空恒温干燥箱内干燥24小时至恒重，得干基蔗渣木聚糖；
(2)称取0.90~1.8g过硫酸铵于50mL烧杯中，加入10~20mL蒸馏水，在室温下搅拌溶解，配置成引发剂溶液，然后倒入100mL恒压滴液漏斗中，备用；
(3)量取3.0~6.0mL分析纯甲基丙烯酸羟乙酯和3.0~6.0mL分析纯乙二醇二甲基丙烯酸酯置于50mL烧杯中，搅拌均匀后得单体混合液，倒入另一100mL恒压滴液漏斗中，备用；
(4)称取5.0~7.0g步骤(1)所得干基蔗渣木聚糖置于250mL四口烧瓶中，再加入50~100mL的蒸馏水，升温至50~60℃，搅拌活化30~50分钟，得蔗渣木聚糖活化液；
(5) 滴加三分之一步骤(2)所得引发剂溶液至步骤(4)所得蔗渣木聚糖活化液内，控制温度在50~60℃、滴加时间为40~60分钟，滴加完毕后，继续搅拌20~30分钟；然后分别同步滴加步骤(3)所得单体混合液及剩余三分之二步骤(2)所得引发剂溶液，控制体系温度在50~70℃，滴加时间在2~4小时，待单体混合液及引发剂溶液全部滴加完毕后，继续反应1~3小时；反应结束后，将所得物料冷却至室温；
(6)向步骤(5)所得物料中加入50~70mL分析纯环己烷，沉析20~30分钟，然后进行抽滤；依次分别量取10~20mL分析纯环己烷和10~15mL分析纯无水乙醇对沉析物进行洗涤、抽滤，重复上述步骤2~3次；将所得滤饼置于60℃恒温干燥箱内干燥24小时至恒重，即得粗BX-g-HEMA/EGDMA接枝共聚物；
(7)将步骤(6)所得粗BX-g-HEMA/EGDMA接枝共聚物置于索氏抽提器中，加入50~70mL分析纯环己烷，抽提18~24小时；抽提完毕后，取出物料放入表面皿中，置于60℃真空恒温干燥箱中干燥16~24小时至恒重，得纯接枝共聚物BX-g-HEMA/EGDMA；
(8)将40.0~60.0g氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑加入到250mL四口烧瓶中，加入15~25mL蒸馏水，将四口烧瓶置于水浴锅中加热至50~60℃，使氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑溶解为明亮的黄色液体；然后将4.0~5.0g 干燥的BX-g-HEMA/EGDMA、0.30~1.5g 4-二甲氨基吡啶、0.1~0.15g蒙脱土加入四口烧瓶中，搅拌分散0.5~1小时；称取3.0~6.0g茶氨酸，均匀分三次每次间隔20分钟加入四口烧瓶中，控制反应温度在50~70℃，搅拌反应4~6小时；反应结束后将体系温度降至室温；
(9)向步骤(8)所得的物料中加入50~70mL的分析纯无水乙醇沉析20~30分钟，然后抽滤；每次量取10~15mL分析纯无水乙醇、15~20mL环己烷对滤饼洗涤、抽滤2~3次，然后将所得滤饼放入60℃真空恒温干燥箱中干燥24小时，得到产物LTBX-g-HEMA/EGDMA衍生物；
(10)将0.6~0.8 g姜黄素加入100 mL四口烧瓶中，再加入20~40 mL分析纯无水乙醇，置于30℃恒温水浴中搅拌20~30分钟；然后依次加入0.3~0.5 g食用卵磷脂和1.5~2.0mL化学纯吐温-80，搅拌0.5~1.5小时，配制成姜黄素乳化液；
(11)称取4.0~5.0g三聚磷酸钠即TPP加入250mL烧杯中，再加入150mL蒸馏水，室温下搅拌均匀得TPP溶液，备用；
(12)称取6.0~9.0g LTBX-g-HEMA/EGDMA于500mL四口烧瓶中，加入200~220mL蒸馏水，室温下搅拌均匀后，将其置于高速搅拌机中，以800r/min的速率搅拌分散1~3小时，得LTBX-g-HEMA/EGDMA混合液；
(13)将步骤(10)所得姜黄素乳化液和步骤(11)所得TPP溶液同步滴入步骤(12)所得LTBX-g-HEMA/EGDMA混合液混合液中，滴加时间控制在30~60分钟；滴加完毕后，继续搅拌0.5~1.0小时;设置 4000r/min 离心速率，离心0.5~1.0小时后分离上清液，收集沉淀；每次分别用30~50mL蒸馏水洗涤、离心10分钟，分离上清液，收集沉淀，重复操作2~3次；最后将所得物料送入-25~-18℃冷冻干燥机中冷冻干燥24小时，得纯接枝共聚物负载姜黄素的LTBX-g-HEMA/EGDMA纳米粒即LTBX-g-HEMA/EGDMA-Cur纳米粒。
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