CN113686933B - 一种基于光强型检测装置高灵敏采集电化学发光光谱的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于光强型检测装置高灵敏采集电化学发光光谱的方法，通过一次ECL测试即可灵敏采集ECL光谱。采用在ECL测量池和光电倍增管之间加装滤光片转盘的方式调制ECL辐射，同时配合使用数据解析方法，在无需改动ECL分析仪结构的条件下，使得常规光强型ECL分析仪具备灵敏采集ECL光谱的性能。本发明采用不使用狭缝限制采光面积的方式提高光谱检测的灵敏度，能够通过数据分析程序动态校正ECL辐射随时间变化对光谱测定的影响，基于单一PMT和非波长扫描方式实现ECL光谱的采集；同时，本发明能够以免除使用光栅和电荷耦合检测器的方式大大降低ECL光谱仪的构建成本。

Description

一种基于光强型检测装置高灵敏采集电化学发光光谱的方法

技术领域

本发明涉及一种高灵敏采集电化学发光光谱信息的方法，属于电化学发光检测技术领域。

背景技术

电化学发光(Electrochemiluminescence,ECL)是一种利用电化学方法使某种物质(如荧光染料或半导体纳米材料)产生激发态和光辐射的化学测量学技术。ECL分析兼有电化学和化学发光(Chemiluminescence,CL)的优点，已在环境污染物监测、生化分析、医学诊断等领域获得广泛应用。

众所周知，以PMT为检测器的光谱分析仪要求待测辐射的强度稳定，以便能够采用波长扫描的方式顺次测定各波长下的辐射强度，获取光谱信息。ECL辐射较弱，且强度不稳定，常规ECL分析仪通常采用高灵敏度光电倍增管(Photomultiplier tube,PMT)直接采集ECL辐射总强度的方式实施ECL分析。由于摒弃了色散装置，常规光强型的ECL分析仪只能借助带通滤光片、采用多次平行测量的方式绘制ECL辐射的光谱信息。其具体做法如下：

将带通滤光片放置在工作电极和PMT之间，测定某一波段范围内ECL辐射强度随时间的变化曲线，然后更换另一中心波长的带通滤光片测定第二个波段范围内ECL辐射强度随时间的变化曲线，如此类推；通过综合使用多个带通滤光片，得到不同波段范围内ECL辐射强度随时间的变化曲线，进而获得ECL光谱。该方法需进行多次平行的ECL测试，存在测定速度慢，重现性较差等缺点。

在现有技术条件下，光强型ECL分析仪难以通过一次ECL测试实现光谱信息的采集。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种基于普通光强型ECL分析仪实施高灵敏采集ECL光谱的方法。本发明采用在光强型ECL分析仪的工作电极和PMT之间加装一个装载有滤光片阵列的旋转圆盘的方式，将ECL分析仪采集的ECL光强度-电位(或时间)曲线调制成一系列的小峰，各小峰依次对应若干特定波段的ECL辐射，其峰面积或峰高与特定波段的ECL光强成正比；通过数据解析程序校正时间差的影响，获得一系列波段下ECL光强度-电位(或时间)曲线，实现ECL光谱的高灵敏采集。本发明方法是一种以PMT为检测器测定超ECL光谱信息的方法，能够以常规光强型ECL分析仪依托、通过一次ECL测试实现光谱信息的灵敏采集。本发明中，用于装载滤光片阵列的旋转圆盘测试架可直接安装至普通光强型ECL仪的暗盒相内，无需改动ECL分析仪的原有硬件配置即可实现滤光片的快速连续更换和ECL光谱测量。

本发明的技术方案如下：

一种高灵敏测定ECL光谱的方法，包括用于调制ECL光强的硬件装置和用于处理调制后ECL强度信息、获取ECL光谱的数据解析方法，所述的调制ECL光强信息的硬件装置包括固定设置有直流马达和ECL池支架的固定底座，所述的直流马达通过轴承连接有滤光片转盘，沿滤光片转盘圆周均匀设置有不同中心波长的滤光片组；

包括步骤如下：

将用于调制ECL光强信息的硬件装置装载至普通光强型ECL分析仪的暗盒系统内，使得工作电极、滤光片组和光电倍增管位于同一光路中，向ECL测量池中加入反应溶液，启动光强型ECL分析仪，工作电极表面产生ECL辐射；同步开启直流马达，滤光片转盘带动滤光片组旋转，使得工作电极产生的ECL辐射周期性地通过滤光片组中的不同中心波长的带通滤光片，得到经过调制的ECL光强-电位曲线或ECL光强-时间曲线；

运用数据解析方法处理所得的ECL光强-电位曲线或ECL光强-时间曲线；利用曲线上的定位峰，确定同一测量周期中各滤光片对应的时间点，计算各测量周期中起始定位峰的峰位置t₀、峰高或峰面积F₀，然后对同一周期中的每一个测量点进行时差校正，使每个测定点的测量时间统一校正为t₀，以第m个测量周期为例，校正公式如下：

I_校正＝I_原始/[1+(F_n0/F_m0-1)*(t-t_m0)/(t_n0-t_m0)]，t_m0≤t≤t_n0；

式中，n＝m+1，即n为m的最相邻后续测量周期；

在完成校正ECL光强度-电位(或时间)曲线的时差后，再计算每个滤光片通道所对应的光谱峰的峰面积A_i，按下式计算各通道中ECL的相对强度：

RI_i＝A_i/A_λi

式中，A_λi为中心波长为λ_i滤光片的透光率-波长曲线的积分面积，以RI_i对λ_i作图，即得该ECL体系在t₀时的ECL光谱曲线。

本发明中，所述的直流马达可驱动滤光片转盘匀速旋转，使得滤光片组中的不同中心波长的带通滤光片依次切换进入工作电极、滤光片和光电倍增管所在的光路中，实施对ECL辐射的快速、连续调制。

根据本发明，所述的普通光强型ECL分析仪为现有设备，包括ECL分析仪主机、数据采集与分析系统和ECL分析仪的暗盒系统；

所述的ECL分析仪的暗盒系统内设置有ECL辐射产生与采集单元，包括ECL测量池和光电倍增管，所述的ECL测量池设置有分别与ECL分析仪主机连接的参比电极、工作电极和对电极，工作电极和光电倍增管位于同一光路中，所述的光电倍增管与ECL分析仪主机连接，所述的ECL分析仪主机与数据采集与分析系统连接。优选的，ECL测量池由玻璃加工而成，底部透光良好，工作电极的位置与光电倍增管处于同轴位置。

有些普通光强型ECL分析仪中，还包括聚光系统，聚光系统位于工作电极和光电倍增管之间，用于将工作电极产生的ECL辐射最大程度的汇聚到光电倍增管中。

根据本发明，优选的，所述的滤光片组和聚光系统之间还设置有采光窗口和关闸，且与ECL测量池、滤光片组和光电倍增管位于同一光路中。设置关闸可以根据需要关闭和开启，来阻断和开启ECL测量池产生的电化学辐射光进入到聚光系统中。

根据本发明，优选的，所述的滤光片组中不同中心波长的滤光片的形状为圆形；

优选的，滤光片的个数为3个以上，进一步优选3-12个。

根据本发明，优选的，所述的滤光片转盘包括上盘、中盘和下盘，所述的中盘沿圆周均匀设置有圆孔，每个圆孔设置有滤光片；所述的上盘和下盘同样设置有孔，分别对应中盘的圆孔；所述的上盘和下盘将中盘连同滤光片固定夹持在中间；

上盘用于固定滤光片，中盘用于安放滤光片，下盘用于固定滤光片和遮光；优选的，上盘开孔形状为圆形，开孔直径小于中盘开孔直径；下盘开孔形状为等腰梯形，等腰梯形的下底位于下盘外周。由于滤光片转盘围绕轴承做圆周运动，带动滤光片组做圆周运动，为了保证每个滤光片的透光面积最大，且与采光窗口面积尽量相同，将下盘开孔形状设置为等腰梯形。

根据本发明，优选的，采用直径90mm的黑色PVC塑料圆片，其厚度为2mm，在上盘上加工出12个直径10mm的圆孔，在中盘上加工出12个直径13mm的圆孔；在底盘上加工出12个等腰梯形孔(内边6.2mm，外边8.1mm，高11mm)，这12组孔的中心位置在三个圆片中是相同的；上、中、下三盘通过3个螺丝固定，其中螺母嵌入上盘的露丝孔中。

使用时，先将上盘和中盘中各圆孔的位置对齐，用四氢呋喃将上盘和中盘粘为一体，按照编号在12个直径13mm的圆孔中安放11个不同中心波长并且直径为12.7mm的滤光片，另外一个圆孔中加装直径为12.7mm黑色PVC塑料带孔圆片；盖上带等腰梯形透光孔的黑色PVC塑料圆片，用螺栓将三个PVC圆片和滤光片固定，构成滤光片转盘，最后安装在轴承上。

根据本发明，优选的，所述的采光窗口位于滤光片底部，为等腰梯形的切口，其尺寸小于滤光片的直径，其投影与位于光电倍增管关闸之上的固定同尺寸的等腰梯形的切口有一位置可以完全重叠，由滤光片转盘的旋转等腰梯形和固定的等腰梯形切口的重叠区构成的采光窗口，确保滤光片之间测定峰分离。

根据本发明，所述的滤光片转盘设置由三个以上不同中心波长的滤光片组成的滤光片组，一个不放滤光片的定位孔；滤光片的切换速度为3～12滤光片/秒，滤光片旋转过程中穿过工作电极和光电倍增管之间的测量光区，将ECL光强度-电位(或时间)曲线调制成一系列小峰。

根据本发明，优选的，先使用分光光度计测量所选用滤光片的透光率-波长曲线，由此计算各个滤光片的中心波长(λ_i)、透光率-波长的积分面积(A_i),用于ECL光谱测定和校正。

根据本发明，优选的，滤光片切换采用滤光片转盘的方式，滤光片转盘由微型直流马达驱动，通过调节工作电压(0.5～7V)控制马达转速，变速范围在10～150rpm，直流马达的工作电压由外置直流稳压电源供给。当ECL辐射通过不带滤光片的定位圆孔时，其光强度是通过滤光片后最大峰光强的2～3倍(由黑色PVC塑料圆片的开孔直径调控)，成为同一圈12个调制光强峰中的最强峰以作为定位峰，以此确定同一圈中其它11个光强峰所对应的滤光片中心波长。

根据本发明，当采用原有光电化学工作站的数据处理和显示界面时，可以观察到由一系列小峰构成的ECL光强度-电位(或时间)曲线，从中可以看到ECL光谱的大致轮廓。扫描结束后，将测定的ECL光强度-电位(或时间)曲线导入数据分析软件，进行滤光片通带宽度和滤光片轮盘的时差校正后，可以获得所测体系的ECL光谱，以及ECL光谱随扫描电位或扫描时间的变化曲线；将测定的ECL光强度-电位(或时间)曲线通过相匹配的数据解析方法进行分析获得ECL光谱；数据解析方法包括根据定位孔位置确定各个滤光片对应的测量峰并计算峰面积或峰高、校正滤光片通带宽度的影响、校正滤光片之间时差的影响、不同周期数据的比较和综合等算法；

优选的，所述的数据解析方法可以加入到ECL分析仪现有数据处理软件中实现在线分析，也可以将数据导出到专门的计算程序中，如Visual Basic，Sigmaplot，C语言等。

根据本发明，当能获得原有光电化学工作站的ECL光强度-电位(或时间)曲线的动态数据时，ECL光谱分析程序可以实时显示所测体系的ECL光谱、以及ECL光谱随扫描电位或扫描时间的变化曲线。

根据本发明，优选的，当进行基于ECL的多组分测定时，滤光片轮盘的滤光片数量可减少为3～6个，滤光片的采光窗口为直径10mm的圆孔增加采光面积以提高检测灵敏度。

根据本发明，优选的，如果进行基于ECL的多组分测定存在光谱干扰时，利用多元线性回归分析法消除组分之间的相互光谱干扰。

本发明未详尽说明的，均按本领域现有技术。

本发明的有益效果如下：

1、本发明以PMT为检测器灵敏获取ECL辐射的光谱信息，并可比较不同电化学状态或实验条件下辐射的光谱变化。

2、本发明中的用于调制ECL光强信息的硬件装置与常规光强型ECL仪器兼容，可在不改动仪器其它硬件设施的条件下，放置该硬件装置于常规光强型ECL仪器的暗盒系统中测定ECL光谱，而移除该硬件装置即可恢复ECL仪的原样和功能。

3、本发明中的检测系统为光电倍增管，而且发光电极和检测器之间不设置狭缝，可大幅度提高ECL光谱测定的信噪比，适合于超弱ECL体系的光谱测定。

4、本发明中采用用于调制ECL光强信息的硬件装置作为分光元件，滤光片切换速率可以达到10～20片/秒，甚至更高，可在400～900nm的波长范围内实时测定ECL光谱。

5、本发明中的数据解析方法，通过校正不同滤光片之间时差的影响，确保ECL光谱测定结果的可靠性。

6、采用本发明中所示方法开展光谱分辨型ECL检测，可使用直径12.7mm滤光片与光电倍增管匹配，具有比采用带狭缝单色器与CCD联用的ECL光谱仪更高的检测灵敏度。

7、采用本发明开展光谱分辨型多组分检测，当滤光片数将大于待测组分数时，可以利用多元线性回归分析法消除组分之间的相互光谱干扰。

附图说明

图1为本发明实施例1中高灵敏度采集ECL光谱的装置示意图。

其中：1.ECL分析仪主机，2.数据采集与分析系统，3.ECL分析仪的暗盒系统，4.光电倍增管，5.聚光系统，6.关闸，7.滤光片转盘，8.采光窗口，9.滤光片组，10.轴承，11.固定底座，12.直流马达，13.ECL测量池，14.参比电极，15.工作电极，16.对电极。

图2为本发明实施例1高灵敏度采集ECL光谱的装置中，滤光片转盘和滤光片组的结构示意图。其中：a为上盘，用于固定滤光片；b为中盘，用于安放滤光片；c为下盘，用于固定滤光片和遮光。

图3由本发明实施例1所测定的荧光棒化学发光光谱与采用荧光光度计测定的荧光棒化学发光光谱。其中：a.采用日立荧光分光光度计F-7100测定的荧光棒化学发光光谱，b.本发明所测定的荧光棒化学发光光谱(未校正滤光片光谱通带宽度的差异)，c.本发明所测定的荧光棒化学发光光谱；插图：滤光片转轮旋转一周的强度-时间曲线。

图4由本发明实施例2所测定鲁米诺的化学发光和ECL的原始光强度-时间曲线；

插图：时间标尺放大后的3组强度-时间曲线。

图5本发明的校正滤光片时间差的计算方法与校正前后对比图。

图6由本发明实施例2所测定的鲁米诺ECL光谱与荧光光度计测定的鲁米诺化学发光光谱的对比图。a.荧光光度计测定的鲁米诺的化学发光光谱，b.本发明所测定的鲁米诺的ECL光谱；插图：由滤光片转盘中定位峰强度表示的鲁米诺的ECL强度-电位曲线。

图7本发明实施例3所测定的钌-吡啶的阳极ECL光强度-时间原始曲线。其中插图为解析出的ECL光谱，电位扫描速率50mV/s。

图8本发明实施例3所测定的钌-吡啶的阳极ECL光强度-时间原始曲线。其中插图为解析出的ECL光谱，电位扫描速率100mV/s。

图9本发明实施例3所测定的钌-吡啶的阳极ECL光强度-时间原始曲线。其中插图为解析出的ECL光谱，电位扫描速率200mV/s。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例都属于本发明保护的范围。

实施例中术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的物品或者设备不仅包括那些要素而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素并不排除在包括所述要素的物品或者设备中还存在另外的相同要素。

对所公开的实施例的上述说明：使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

实施例以西安瑞迈分析仪器有限公司生产的MPI-E型电化学发光检测仪为基础，采用将用于调制ECL光强的硬件装置装载进入ECL分析仪暗盒系统的方式实施ECL信号调制，在此基础上利用数据分析程序处理所得调制信号，实现ECL光谱的采集。移除用于调制ECL光强的硬件装置之后，该仪器即可恢复原貌和原来的各项功能。

如图1所示，其为本发明以MPI-E型电化学发光检测仪载体采集ECL光谱的硬件装置示意图，包括：MPI-E型ECL分析仪主机1、数据采集与分析系统2、MPI-E型ECL分析仪暗盒系统3；

所述的ECL分析仪的暗盒系统3内设置有电化学辐射与光谱采集单元，包括ECL测量池13和光电倍增管4，所述的ECL测量池13设置有分别与ECL分析仪主机1连接的参比电极14、工作电极15和对电极16，工作电极15和光电倍增管4位于同一光路中，所述的光电倍增管4与ECL分析仪主机1连接，所述的ECL分析仪主机1与数据采集与分析系统2连接；

所述的ECL分析仪的暗盒系统3装载有用于调制ECL光强的硬件装置，所述的调制ECL光强信息的硬件装置包括固定设置有直流马达12和ECL池支架的固定底座11，所述的直流马达12通过轴承10连接有滤光片转盘7，沿滤光片转盘7圆周均匀设置有不同中心波长的滤光片组9；

ECL测量池13由玻璃加工而成，底部透光良好，设置在ECL池支架上，工作电极15的位置与光电倍增管4处于同轴位置。

优选的，装置还包括聚光系统5，聚光系统5位于工作电极15和光电倍增管4之间，用于将工作电极15产生的ECL辐射最大程度的汇聚到光电倍增管4中。

优选的，所述的滤光片组9和聚光系统5之间还设置有采光窗口8和关闸6，且与ECL测量池13、滤光片组9、聚光系统5和光电倍增管4位于同一光路中。设置关闸6可以根据需要关闭和开启，来阻断和开启ECL测量池13产生的电化学辐射光进入到聚光系统5中。

优选的，所述的滤光片组9中不同中心波长的滤光片的形状为圆形；优选的，滤光片的个数为3个以上，进一步优选3-12个。

优选的，所述的滤光片转盘7包括上盘、中盘和下盘，所述的中盘沿圆周均匀设置有圆孔，每个圆孔设置有滤光片；所述的上盘和下盘同样设置有孔，分别对应中盘的圆孔；所述的上盘和下盘将中盘连同滤光片固定加持在中间；

上盘用于固定滤光片，中盘用于安放滤光片，下盘用于固定滤光片和遮光；优选的，上盘开孔形状为圆形，开孔直径小于中盘开孔直径；下盘开孔形状为等腰梯形，等腰梯形的下底位于下盘外周。由滤光片转盘7围绕轴承10做圆周运动，带动滤光片组9做圆周运动，为了保证每个滤光片的透光面积最大，且与采光窗口8面积尽量相同，将下盘开孔形状设置为等腰梯形。

优选的，上盘、中盘和下盘为黑色PVC塑料圆片；其厚度为2mm，在上盘上加工出12个直径10mm的圆孔，起透光和固定滤光片的作用；在中盘上加工出12个直径13mm的圆孔用于安放直径12.7mm的滤光片；在底盘上加工出12个等腰梯形孔(内边6.2mm，外边8.1mm，高11mm)用作光窗并固定滤光片，这12组孔的中心在三个圆片中是相同的；通过固定螺丝联为一体构成滤光片转盘。

使用时，先将上盘和中盘中各圆孔的位置对齐，用四氢呋喃将上盘和中盘粘为一体，按照编号在12个直径13mm的圆孔中安放11个不同中心波长并且直径为12.7mm的滤光片，另外一个圆孔中加装直径为12.7mm黑色PVC塑料带孔圆片；盖上带等腰梯形透光孔的黑色PVC塑料圆片，用螺栓将三个PVC圆片和滤光片固定，构成旋转圆盘滤光片阵列单元，最后安装在轴承上。

优选的，所述的采光窗口8位于滤光片底部，为等腰梯形的切口，其尺寸小于滤光片的直径，其投影与位于光电倍增管关闸6之上的固定同尺寸的等腰梯形的切口有一位置可以完全重叠，由滤光片转盘7的旋转等腰梯形和固定的等腰梯形切口的重叠区构成的采光窗口8，确保滤光片之间测定峰分离。

使用上述装置高灵敏度采集动态电致化学发光光谱的方法，包括步骤如下：

向ECL测量池13中加入反应溶液，启动光强型ECL分析仪，工作电极15表面产生ECL辐射；同步开启直流马达12，滤光片转盘7带动滤光片组9旋转，使得工作电极15产生的ECL辐射周期性地通过滤光片组9中的不同中心波段的带通滤光片，得到经过调制的ECL光强-电位曲线或ECL光强-时间曲线；

运用数据解析方法处理所得的ECL光强-电位曲线或ECL光强-时间曲线；利用曲线上的定位峰，确定同一测量周期中各滤光片对应的时间点，计算各测量周期中起始定位峰的峰位置t₀、峰高或峰面积F₀，然后对同一周期中的每一个测量点进行时差校正，使每个测定点的测量时间统一校正为t₀，以第m个测量周期为例，校正公式如下：

I_校正＝I_原始/[1+(F_n0/F_m0-1)*(t-t_m0)/(t_n0-t_m0)]，t_m0≤t≤t_n0；

式中，n＝m+1，即n为m的最相邻后续测量周期；

在完成校正ECL光强度-电位(或时间)曲线的时差后，再计算每个滤光片通道光谱峰的峰面积A_i，按下式计算各通道中ECL的相对强度：

RI_i＝A_i/A_λi

式中，A_λi为中心波长为λ_i滤光片的透光率-波长曲线的积分面积，以RI_i对λ_i作图，即得该电化学发光体系在t₀时的ECL光谱曲线。

优选的，当采用原有光电化学工作站的数据处理和显示界面时，可以观察到由一系列小峰构成的ECL光强度-电位(或时间)曲线，从中可以看到ECL光谱的大致轮廓。扫描结束后，将测定的ECL光强度-电位(或时间)曲线导入数据分析软件，进行滤光片通带宽度和滤光片轮盘的时差校正后，可以获得所测体系的ECL光谱，以及ECL光谱随扫描电位或扫描时间的变化曲线；

进一步优选的，将测定的ECL光强度-电位(或时间)曲线通过相匹配的数据解析方法处理获得ECL光谱；优选的数据解析方法包括根据定位孔位置确定各个滤光片对应的测量峰并计算峰面积或峰高、校正滤光片通带宽度的影响、校正滤光片之间时差的影响、不同周期数据的比较和综合等算法；所述的相匹配数据解析方法可嵌入ECL分析仪的数据处理软件中实现在线分析，也可将利用专门计算程序处理相关数据，如Visual Basic，Sigmaplot，C语言等。

优选的，当能获得ECL光强度-电位(或时间)曲线的动态数据时，ECL光谱分析程序可以实时显示所测体系的ECL光谱、以及ECL光谱随扫描电位或扫描时间的变化曲线。

电化学发光的激发电位由ECL分析仪主机1提供，由数据采集与分析系统2优选计算机实现仪器控制、数据采集和分析。由工作电极15产生的ECL辐射通过固定在滤光片转盘7上的滤光片组9分解成一系列波段的信号、然后经过采光窗口8、关闸6、聚光系统5后由光电倍增管4检测。

实施例1

荧光棒的化学发光光谱测定。因为波长扫描型荧光分光光度计只适用于稳态发光信号的测定，在此实施例中，选用具有稳定发光强度的荧光棒为光源。将荧光棒中的溶液充分混合均匀之后，荧光棒发射出明亮的冷光，即化学发光。荧光棒发光1小时后，其强度可稳定很长一段时间。将荧光棒放置在固定底座11上，开动直流马达12，转速设为15rpm，关闭ECL分析仪的暗盒系统3，以化学发光模式测定光强的随滤光片切换的变化曲线，结果如图3中插图所示。由图3可见，原本稳定的化学发光强度因为滤光片组9旋转所引起的透光窗口面积变化而呈现出一组12个小峰，小峰高度与荧光棒的化学发光光谱分布有关，其中的最强峰是无滤光片条件下的光强。为便于观察各波长下的光强度变化，通过缩小透光面积的方法使最强峰的峰高为其它11个峰中最高峰的2～3倍，这样既便于数据分析程序准确发现定位峰，也便于其它11个峰的动态显示。将该组数据导入数据分析程序中，即可得出荧光棒的化学发光光谱在11个波长点的取值。

因为荧光棒的化学发光强度很稳定，采用日立荧光分光光度计F-7100测定了该稳态化学发光辐射的光谱，以此作为参照标准检验本发明装置所测光谱的可靠性。由图3可见，由本发明所测定的荧光棒的化学发光光谱与荧光分光光度计的测定结果相吻合。

需要说明的是，滤光片的中心波长需用分光光度计进行标定。此外，通常一组滤光片的半峰宽并不相同，滤光片的半峰宽越大，透光率-波长的积分面积(A_i),总透光强度越大，使ECL光谱在该波长的测定值越高，故需进行强度归一化校正，其方法是将强度测定值除以滤光片的透光率-波长的积分面积。

实施例2

鲁米诺的ECL光谱测定。将20微升浓度为0.1mg/mL的鲁米诺和0.7％壳聚糖混合溶液滴加在玻碳电极表面，红外灯烤干。取一定体积的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7)于ECL测量池13中作为支持电解质溶液，加入0.1mg/mL的鲁米诺溶液，100mmol/L K₂S₂O₈，60mmol/L H₂O₂,安放玻碳工作电极，Ag/AgCl参比电极，Pt丝对电极，并与ECL分析仪主机1相连接，开启电位扫描，循环扫描电位范围为0～1V，扫描速率为100mV/s，结果如图4所示。在K₂S₂O₈和H₂O₂存在下，鲁米诺在中性pH溶液中有稳态的化学发光，当扫描电位达到鲁米诺的起峰电位时，电化学发光与化学发光叠加，使鲁米诺的发光强度显著增加。由图4中的插图可见，鲁米诺的ECL强度随扫描电位(或时间)快速变化。采用如图5所示的计算方法校正滤光片通道之间时差的影响，即可获得ECL光谱。利用鲁米诺在K₂S₂O₈和H₂O₂存在下在中性pH溶液中有稳态的化学发光的性质，采用荧光分光光度计测定鲁米诺的化学发光光谱，结果如图6所示。由图6可见，采用本发明装置测得的鲁米诺ECL光谱与其化学发光光谱相吻合。

需要说明的是，受光电倍增管采样频率(最大值200点/秒)的影响，滤光片转盘7的旋转速率不能太高，这样各滤光片采集ECL光谱的时间点存在差异。因此在进行数据解析的程序中，加入了采样时差校正算法。对于单ECL发光体的光谱测定，可以采用将一次扫描中滤光片转轮的多圈数据累加的方法，也可以利用定位峰光强度进行基线校正。此外，定位峰的光强度平均值也可用于勾勒出ECL发光体的光强度-电位曲线，如图6中的插图所示。

实施例3

联钌吡啶的ECL光谱测定。将20μL浓度为0.025mg/mL的联钌吡啶和0.7％壳聚糖混合溶液滴加在玻碳电极表面，红外灯烤干。取一定体积的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7)于ECL测量池13中作为支持电解质溶液，加入100mmol/L三乙醇胺,安放玻碳工作电极，Ag/AgCl参比电极，Pt丝对电极，并与ECL分析仪主机1相连接，开启电位扫描，循环扫描电位范围为0～1.5V，试验的电位扫描速率为50mV/s、100mV/s、200mV/s，所得结果如图7、图8、图9所示。当滤光片转盘7的转速设为80rpm时，光谱测定的扫描周期为0.75s，因为本发明的分光装置的采光面积大，并用高灵敏的PMT检测器，仅用一个测定周期即可测定ECL体系的光谱。在电化学发光中，不同的测量周期对应不同的电化学条件，故加装本发明的用于调制ECL光强的硬件装置后，即可用普通的ECL仪获取ECL光谱随扫描电位或扫描时间的变化信息。

Claims (13)

1.一种高灵敏采集ECL光谱的方法，包括利用调制ECL光强信息的硬件装置和数据解析方法，所述的调制ECL光强信息的硬件装置包括固定设置有直流马达和ECL池支架的固定底座，所述的直流马达通过轴承连接有滤光片转盘，沿滤光片转盘圆周均匀设置有不同中心波长的滤光片组；

包括步骤如下：

将调制ECL光强信息的硬件装置装载至普通光强型ECL分析仪的暗盒系统内，使得工作电极、滤光片组和光电倍增管位于同一光路中，向ECL测量池中加入反应溶液，启动光强型ECL分析仪，工作电极表面产生ECL辐射；同步开启直流马达，滤光片转盘带动滤光片组旋转，使得工作电极产生的ECL辐射周期性地通过滤光片组中的不同中心波段的带通滤光片，得到经过调制的ECL光强-电位曲线或ECL光强-时间曲线；

运用数据解析方法处理所得的ECL光强-电位曲线或ECL光强-时间曲线；利用曲线上的定位峰，确定同一测量周期中各滤光片对应的时间点，计算各测量周期中起始定位峰的峰位置t₀、峰高或峰面积F₀，然后对同一周期中的每一个测量点进行时差校正，使每个测量点的测量时间统一校正为t₀，以第m个测量周期为例，校正公式如下：

式中，n=m+1，即n为m的最相邻后续测量周期；

在完成校正ECL光强度-电位曲线或ECL光强度-时间曲线的时差后，再计算每个滤光片通道光谱峰的峰面积A_i，按下式计算各通道中ECL的相对强度：

式中，

为中心波长为

滤光片的透光率-波长曲线的积分面积，以

对

作图，即得该电化学发光体系在t₀时的ECL光谱曲线。

2.根据权利要求1所述的高灵敏采集ECL光谱的方法，其特征在于，所述的普通光强型ECL分析仪，包括ECL分析仪主机、数据采集与分析系统和ECL分析仪的暗盒系统；

所述的ECL分析仪的暗盒系统内设置有ECL辐射产生与采集单元，包括ECL测量池和光电倍增管，所述的ECL测量池设置有分别与ECL分析仪主机连接的参比电极、工作电极和对电极，工作电极和光电倍增管位于同一光路中，所述的光电倍增管与ECL分析仪主机连接，所述的ECL分析仪主机与数据采集与分析系统连接。

3.根据权利要求2所述的高灵敏采集ECL光谱的方法，其特征在于，所述的普通光强型ECL分析仪中，还包括聚光系统，聚光系统位于工作电极和光电倍增管之间，用于将工作电极产生的ECL辐射最大程度的汇聚到光电倍增管中。

4.根据权利要求3所述的高灵敏采集ECL光谱的方法，其特征在于，所述的滤光片组和聚光系统之间还设置有采光窗口和关闸，且与ECL测量池、滤光片组和光电倍增管位于同一光路中。

5.根据权利要求1所述的高灵敏采集ECL光谱的方法，其特征在于，所述的滤光片组中不同中心波长的滤光片的形状为圆形。

6.根据权利要求5所述的高灵敏采集ECL光谱的方法，其特征在于，滤光片的个数为3个以上。

7.根据权利要求6所述的高灵敏采集ECL光谱的方法，其特征在于，滤光片的个数为3-12个。

8.根据权利要求1所述的高灵敏采集ECL光谱的方法，其特征在于，所述的滤光片转盘包括上盘、中盘和下盘，所述的中盘沿圆周均匀设置有圆孔，每个圆孔设置有滤光片；所述的上盘和下盘同样设置有孔，分别对应中盘的圆孔；所述的上盘和下盘将中盘连同滤光片固定夹持在中间。

9.根据权利要求5所述的高灵敏采集ECL光谱的方法，其特征在于，上盘、中盘和下盘均采用直径90 mm的黑色PVC塑料圆片，其厚度为2 mm；在上盘上加工出12个直径10 mm的圆孔，在中盘上加工出12个直径13mm的圆孔；在下盘上加工出12个等腰梯形孔，等腰梯形孔的内边6.2 mm、外边8.1 mm、高11 mm；这12组孔的中心位置在三个圆片中是相同的。

10.根据权利要求1所述的高灵敏采集ECL光谱的方法，其特征在于，滤光片转盘带动滤光片组旋转，使得滤光片的切换速度为3~12滤光片/秒。

11.根据权利要求1所述的高灵敏采集ECL光谱的方法，其特征在于，直流马达的工作电压为0.5~7V，直流马达转速范围在10~150 rpm。

12.根据权利要求1所述的高灵敏采集ECL光谱的方法，其特征在于，先使用分光光度计测量所选用滤光片的透光率-波长曲线，由此计算各个滤光片的中心波长λ _i 、透光率-波长的积分面积A_i，用于ECL光谱测定和校正。

13.根据权利要求1所述的高灵敏采集ECL光谱的方法，其特征在于，所述的数据解析方法加入到ECL分析仪现有数据处理软件中实现在线分析，或者将数据导出到计算程序中进行解析。

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