CN113684166A

CN113684166A - 一种高效合成软骨素寡聚糖的重组谷氨酸棒杆菌

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Publication number: CN113684166A
Application number: CN202110926226.4A
Authority: CN
Inventors: 康振; 王阳; 胡立涛; 陈坚; 堵国成; 刘京京; 孙婕妤
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-08-12
Filing date: 2021-08-12
Publication date: 2021-11-23
Anticipated expiration: 2041-08-12
Also published as: CN113684166B

Abstract

本发明公开了一种高效合成软骨素及其寡聚糖的重组谷氨酸棒杆菌，属于生物工程技术领域。本发明构建的重组谷氨酸棒杆菌生产的软骨素寡聚糖的产量达到20g L^‑1。通过构建软骨素合成途径并异源表达软骨素裂解酶，可以直接一步法发酵获得软骨素寡聚糖。本发明为微生物高效合成高纯度软骨素奠定了坚实的基础，构建的重组谷氨酸棒杆菌适合于工业化生产应用。

Description

一种高效合成软骨素寡聚糖的重组谷氨酸棒杆菌

技术领域

本发明涉及一种高效合成软骨素寡聚糖的重组谷氨酸棒杆菌，属于生物工程技术领域。

背景技术

硫酸软骨素是由葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺为二糖单位聚合而成并经过一定程度修饰的直链酸性黏多糖。硫酸软骨素具有较好的粘弹性，保湿性和抑制炎性，还具有止痛、促进软骨再生等作用而被广泛应用于医药和保健品领域。高分子量软骨素具有良好的保湿、润滑的作用，可被用于医药领域。软骨素寡聚糖能够高效地被机体吸收，从而维护关节促进修复，而被用于口服保健品领域。

目前市场上的硫酸软骨素主要通过动物组织提取获得，但利用动物组织提取法提取硫酸软骨素存在许多缺点，首先组织提取法提取工艺复杂、步骤繁琐且最终获取产品纯度低，而产品的纯度直接影响产品的质量，低纯度的样品很难达到医药水平的要求。其次组织提取原材料为动物组织，存在原料来源限制问题且不同批次不同来源的组织，提取获得的样品分子量大小、修饰位点、修饰程度都存在差异，因此动物提取法获得的硫酸软骨素存在产品均一性问题。低分子量硫酸软骨素能够更好的被机体所吸收、利用，且功能更全面、高效。而组织提取获得的主要为高分子量的硫酸软骨素，获取寡聚糖还需要通过物理化学法和酶法等手段进一步处理才能获取，提高了产品制备的难度和成本。

为了解决上述的问题，人们希望利用基因工程技术在一些工程菌株中构建软骨素的合成途径获取软骨素，然后利用体外酶法催化获取专一、高纯度的硫酸软骨素。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是如何利用微生物一步合成软骨素寡糖。

[技术方案]

本发明在谷氨酸棒杆菌中引入软骨素的合成途径，并在此基础上引入软骨素裂解酶，从而获得能够一步法生产软骨素寡聚糖的重组菌株。

本发明提供一种用于合成软骨素寡糖的重组谷氨酸棒杆菌，该重组谷氨酸棒杆菌异源表达软骨素合酶，并异源表达能够降解软骨素分子的软骨素裂解酶，所述软骨素合酶为(a)、(b)或(c)所示：

(a)来源于大肠杆菌(Escherichia coli K4)的软骨素合酶KfoC(SEQ ID NO.1)，或与其有60％以上同源性的软骨素合酶；

(b)来源于多杀巴斯德杆菌(P.multocida)pmCS(SEQ ID NO.2)，或与其有60％以上同源性的酶；

(c)含有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的酶；

(d)在(a)或(b)中经过取代或缺失且具有软骨素合酶活性的由(a)或(b)衍生的蛋白质。

在一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌还重组表达N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶，催化UDP-葡萄糖胺合成UDP-半乳糖胺，从而促进软骨素合成。所述葡萄糖胺差向异构酶来源于大肠杆菌(E.coli K4)，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌还强化了前体物质UDP-N-乙酰半乳糖糖胺和/或UDP-葡萄糖醛酸的合成，包括强化pgM、ugdA、galU、glmS、glmM、glmU中一个或多个基因的表达。所述强化了前体物质UDP-N-乙酰半乳糖糖胺和/或UDP-葡萄糖醛酸合成，包括过对谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶、磷酸葡萄糖变位酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖-1-磷酸乙酰转移酶双功能酶、磷酸葡萄糖变构酶、葡萄糖-6-磷酸尿酰胺转移酶、UDP-葡萄糖脱氢酶的基因进行过表达。所述磷酸葡萄糖变位酶PgM(NCBI referencesequence:WP_038674316.1)，葡萄糖-6-磷酸尿酰胺转移酶GalU(NCBI referencesequence:WP_012677300.1)，UDP-葡萄糖脱氢酶UgdA(NCBI reference sequence:WP_012677300.1)，谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶GlmS(NCBI reference sequence:WP_012514860.1)，磷酸葡萄糖变构酶GlmM(NCBI reference sequence:WP_012677779.1)，UDP-N-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖-1-磷酸乙酰转移酶双功能酶GlmU(NCBIreference sequence:WP_012677301.1)来源于兽疫链球菌(Streptococcus equi)。

在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌是在异源表达软骨素合酶基因和N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶基因的基础上，通过构建表达框强化途径基因pgM、ugd、galU、glms、glmM和glmU的表达，从而加强软骨素的合成底物——UDP-N-乙酰半乳糖胺和UDP-葡萄糖醛酸的合成。

在一种实施方式中，所述软骨素裂解酶ChaseABC的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述软骨素裂解酶的N端还添加氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的麦芽糖促溶标签(MBP)，同时，还可以对N端的前5个氨基酸进行截短突变以提升蛋白的可溶性表达，并且通过选择具有不同结合能力的RBS序列(SEQ ID NO.6：AAAGGGTTCATAG、SEQ ID NO.7：AAAGGAGTTGCTT、SEQ ID NO.8：AAAGGTGGTTCAT、SEQ ID NO.9：AAAGGGGAGAGCC、SEQ IDNO.10：AAAGGCATGTTCT、SEQ ID NO.11：AAAGGCATGGCCG)来对软骨素裂解酶的表达量进行精细调控，最终实现软骨素寡聚糖的高效合成。

本发明的第二个目的是提供一种利用所述重组谷氨酸棒杆菌生产软骨素寡聚糖及其衍生产品方面的方法，包括以下步骤：

将重组谷氨酸棒杆菌经活化培养后，制成种子液，然后将种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，使重组谷氨酸棒杆菌以葡萄糖为底物合成软骨素寡聚糖，发酵过程中，将发酵液的pH控制在6.5-7之间，发酵培养基中葡萄糖含量控制在10g L^-1附近。

[有益效果]

本发明在工业安全菌株谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)中异源表达来源于大肠杆菌或多杀巴斯德杆菌来源的软骨素合酶和葡萄糖胺差向异构酶，构建了软骨素的合成途径。通过构建表达框强化途径基因pgM，ugd，galU，glms，glmM，glmU的表达，加强软骨素的前体物质UDP-N-乙酰半乳糖胺和UDP-葡萄糖醛酸的合成，以解决软骨素合成过程中底物供应不足的问题，从而强化重组谷氨酸棒杆菌软骨素的合成能力。在其基础上表达软骨素裂解酶，实现软骨素寡聚糖的一步法生产，最终软骨素寡聚糖的生产能力达到20gL^-1，是目前首次报道通过一步法实现合成软骨素寡聚糖。

附图说明

图1：重组谷氨酸棒杆菌生产软骨素的代谢途径及相关的酶类。

图2：软骨素裂解酶的表达优化；1，未改造的软骨素裂解酶；2，在软骨素裂解酶的N端融合MBP；3，在软骨素裂解酶的N端融合MBP的基础上，对N端进行截断改造。

图3：不同RBS序列对软骨素寡糖产量的影响。

图4：重组谷氨酸棒杆菌生产的软骨素寡聚糖的质谱图。

图5：重组谷氨酸棒杆菌的软骨素寡聚糖的5L发酵罐产量图。

具体实施方式

菌株、载体：谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum ATCC 13032)、pK18mobSacB

LB培养基:酵母粉5g L^-1，蛋白胨10g L^-1，氯化钠10g L^-1

BHI培养基:脑心浸出液37g L^-1，山梨醇91g L^-1

发酵培养基：葡萄糖：40g L^-1，玉米浆干粉:20g/L，(NH₄)₂SO₄:20g L^-1，KH₂PO₄：1gL^-1，K₂HPO₄:1g L^-1，MgSO₄:25g L^-1，MOPS(3-吗啉丙磺酸):42g L^-1。

软骨素寡聚糖样品的制备：

取适当发酵液，10000xg离心10min取上清，加4倍体积的预冷乙醇，放入-20℃冰箱醇沉6h，10000xg离心10min弃沉淀，上清冷冻干燥加水复溶，10000xg离心10min取上清，弃沉淀，并加4倍体积的预冷乙醇，重复上述步骤三次。将获得的样品，加水复溶，待测定软骨素寡聚糖含量时，根据标准曲线的线性有效范围稀释样品，然后通过硫酸咔挫法测定产量。

软骨素寡聚糖含量的检测计算：

硫酸咔唑法进行测定：向装有5mL硼砂硫酸(500mL浓H₂SO₄中溶解4.77g硼砂)的玻璃管中加入1mL样品，左右轻微晃动混匀后在沸水浴中加热15min后，放置冰上冷却。并缓缓加入250μL咔唑试剂(100mL无水乙醇中溶解0.125g咔唑)，混匀后沸水浴中再煮10min，对照为相同条件下的野生型谷氨酸棒杆菌发酵液。处理结束后测定样品在紫外530nm处的吸光值。分别用不同浓度(0、l0、20、30、40、50μg mL^-1)的葡萄糖醛酸标准品作为标准曲线，最后将样品的吸光值带入标准曲线，计算出软骨素寡聚糖的含量。

标准曲线方程：y＝126.88x-9.2639，R²＝0.9991(x：吸光度A530；y：样品中葡萄糖醛酸含量(μg mL^-1))。软骨素寡聚糖产量计算公式：软骨素寡聚糖含量(g/L)＝(标准曲线测出的浓度*稀释倍数*2.067)/1000。

软骨素寡聚糖的LC-MS测定：

发酵上清，通过反复已醇溶解去除杂质，获得较高纯度的软骨素寡聚糖，然后在样品中加入9倍体积的无水甲醇，离心去除杂质后，经过有机膜过滤除去不溶杂质后，通过液相质谱联用LC-MS分析二糖单位的结构。

实施例1:重组谷氨酸棒杆菌的构建

(1)软骨素合酶基因的整合

提取谷氨酸棒杆菌(ATCC 13032)的基因组DNA，并将其作为模板，以U-up-F、U-up-R和D-down-F、D-down-R为引物进行PCR，扩增整合位点(乳酸脱氢酶基因)上下游1000bp长度的片段U-up和D-down并进行PCR产物纯化；

合成编码软骨素合酶的基因序列KfoC(SEQ ID NO.1)和编码N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶KfoA的基因序列(SEQ ID NO.3)，以KfoC-F、KfoC-R和KfoA-F和KfoC-R为引物进行PCR扩增，并进行PCR产物纯化；

将质粒pK18mobsacB使用EcoRI/BamhI进行酶切反应，用Gibson Assembly试剂盒将U-up、D-down、KfoC和KfoA四个基因片段连接到质粒pK18mobsacB上，获得的重组质粒将其命名为pK18-KfoC-KfoA；

采用电穿孔仪将质粒pK18-KfoC-KfoA通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌(ATCC13032)中，电击条件为电压1.5KV，5ms(电击杯宽度为1mm)，电击两次后加入预热的培养基46℃热激6min。30℃摇床后培养2h，涂板至含卡那霉素BHI平板上进行重组菌的第一次筛选。挑取阳性重组子进一步在液体BHI培养基里过夜培养，然后在含有100g L^-1的蔗糖BHI平板上进行二次筛选。利用U-up-F和D-down-R为引物进行菌落PCR，菌落PCR验证大小正确的重组子进行测序验证，并将重组菌命名为C.glutamicum-KfoC-KfoA。

U-up-F:CGACGGCCAGTGCCAAGCTTACAGCCAGGTTAGCAGCCGT(SEQ ID NO.12)

U-up-R:GTTAATTGCTTGATTTAAGATAGACATGAGGACAATCTTGTTACCGACG(SEQ IDNO.13)

KfoC-F:CGTCGGTAACAAGATTGTCCTCATGTCTATCTTAAATCAAGCAATTAAC(SEQ IDNO.14)

KfoC-R:CGTGACCAGGATGTTCATTTACAAATCGTTTTCGATTTTCTCC(SEQ ID NO.15)

KfoA-F:AGAAAATCGAAAACGATTTGTAAATGAACATCCTGGTCACGG(SEQ ID NO.16)

KfoA-R:GCGCAGGGTATTTGCGGTTAAATGTACCCGTTAGGGTTTTTCATC(SEQ ID NO.17)

D-down-F:GGAGAAAATCGAAAACGATTTGTAAATTCCGCAAATACCCTGCGC(SEQ ID NO.18)

D-down-R:CTATGACCATGATTACGAATTCTCGTCGAGAATCTCATCGGC(SEQ ID NO.19)

(2)前体物质UDP-N-乙酰半乳糖糖胺和/或UDP-葡萄糖醛酸的合成途径的表达

S.equi subsp.zooepidimicu接种于5mL LB液体培养基，在37℃200rpm培养24h，收集菌体，并通过细胞基因组提取试剂盒提取基因组DNA。设计引物PgM-F/PgM-R，galU-F/galU-R，glmU-F/glmU-R，ugd-F/ugd-R，glmM-F/glmM-R和glmS-F/glmS-R，并以提取的基因组DNA为模板，通过PCR扩增获取pgM、galU、glmU、ugd、glmM和glmS的基因。并以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，以cUP-F/cUP-R和cdown-F/cdown-R为引物进行PCR从而获得片段cUP和cDown。

将质粒pK18mobsacB使用EcoRI/BamhI进行酶切反应，用Gibson Assembly试剂盒将pgM、galU、glmU、ugd、glmM、glmS、cUP和cDown基因片段连接到质粒pK18mobsacB上，获得的重组质粒将其命名为pK18-GUD。将pK18-GUD转化将大肠杆菌JM109感受态细胞，取阳性转化子进行质粒测序，与序列比对，确认重组质粒pK18-GUD构建成功。利用电穿孔仪将质粒pK18-GUD通过电转化转入到步骤(1)构建的重组谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum-KfoC-KfoA)中，电击条件为电压1.5KV，5ms(电击杯宽度为1mm)。通过筛选和PCR扩增基因片段进行测序等方式，获得正确的重组菌株C.glutamicum-CNA。

Galu-F:AAGGAGCGTATATCATGACAAAGGTCAGAAAAGCCATT(SEQ ID NO.20)

Galu-R:CATGATATACGCTCCTTATTTCTTGACGTCCTTGTTCAGTTG(SEQ ID NO.21)

PgM-F:AAGGAGCGTATATCATGACGCTCAGTCCTTTGGCAGG(SEQ ID NO.22)

PgM-R:CATGATATACGCTCCTTCTtcaggcaatggcttcatcgacc(SEQ ID NO.23)

GlmU-F:AAGGAGCGTATATCATGAAAAACTACGCCATTATCCTAG(SEQ ID NO.24)

GlmU-R:CATGATATACGCTCCTTCTAGGCTTGATTTGGGTGATGTG(SEQ ID NO.25)

Ugd-F:AAGGAGCGTATATCGTGAAAATTTCTGTAGCAGGC(SEQ ID NO.26)

Ugd-R:CATGATATACGCTCCTTCTAGTCTCTTCCAAAGACATCTCT(SEQ ID NO.27)

GlmM-F:AAGGAGCGTATATCATGGGAAAATATTTTGGAACGGATG(SEQ ID NO.28)

GlmM-R:CATGATATACGCTCCTTTTAATCAAGGCCAATTTCCGCACG(SEQ ID NO.29)

GlmS-F:AAGGAGCGTATATCATGTGTGGAATTGTTGGAGTTGTAG(SEQ ID NO.30)

GlmS-R:GCGCAGGGTATTTGCGGAATTTTACTCAACTGTAACAGCCTTGGC(SEQ ID NO.31)

Cup-F:CGACGGCCAGTGCCAAGCTTACAGCCAGGTTAGCAGCCGT(SEQ ID NO.32)

Cup-R:CATGATATACGCTCCTTGAGGACAATCTTGTTACCGACG(SEQ ID NO.33)

CDown-F:CGTCGGTAACAAGATTGTCCTCAATTCCGCAAATACCCTGCGC(SEQ ID NO.34)

CDown-R:CTATGACCATGATTACGAATTCTCGTCGAGAATCTCATCGGC(SEQ ID NO.35)

(3)软骨素裂解酶基因的表达

按照现有技术报道的序列，在金唯智(GENEWIZ)合成软骨素裂解酶基因序列，并通过引物Chase-F/Chase-R扩增软骨素裂解酶基因片段，并将其连接至质粒pECXK99E上，获得重组质粒pEC-chase。

在重组质粒pEC-chase的基础上，通过引物MBP-F/MBP-R扩增编码MBP蛋白的序列，然后与裂解酶基因序列连接，获得重组质粒pEC-MBP-chase，从而使裂解酶N端融合麦芽糖结合蛋白(MBP：理论分子量为42.0kDa)。同时，由于裂解酶N端序列的改变也会在翻译水平上影响目的蛋白的总表达水平，我们通过引物Del2-5-F/Del2-5-R在重组质粒pEC-MBP-chase的基础上，对裂解酶N端的前五个氨基酸进行截短，获得重组质粒pEC-MBP-N5chase。

利用电穿孔仪将上述重组质粒通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌C.glutamicum，电击条件为电压1.5KV，5ms(电击杯宽度为1mm)。通过筛选和PCR扩增基因片段进行测序等方式，获得正确的重组菌株。将上述重组菌株，挑选单克隆接种于BHI液体培养基中，在200rpm，30℃的条件下培养10h后，并按2％的接种量转接于250mL装有发酵培养基的三角摇瓶中，在200rpm，28℃条件下培养，培养时长为24h，收集超声破碎，并进行SDS-PAGE凝胶电泳实验。结果如图2所示(1，未改造的软骨素裂解酶；2，在软骨素裂解酶的N端融合MBP；3，在软骨素裂解酶的N端融合MBP的基础上，对N端进行截断改造)，通过蛋白胶图我们可以发现，N端融合MBP标签和N端序列改造显著提高了csABC I的可溶表达量。

软骨素裂解酶的表达强弱对，软骨素寡聚糖的合成至关重要。因此我们通过在MBP蛋白基因前，设计不同强弱的RBS序列(AAAGGGTTCATAG、AAAGGAGTTGCTT、AAAGGTGGTTCAT、AAAGGGGAGAGCC、AAAGGCATGTTCT、AAAGGCATGGCCG)从而调控软骨素裂解酶的表达强弱。以重组质粒pEC-MBP-N5chase为模板，分别利用引物RBS1-F，RBS2-F，RBS3-F，RBS4-F，RBS5-F，RBS6-F和RBS-R对重组质粒进行PCR扩增，从而获得重组质粒RBS1，RBS2，RBS3，RBS4，RBS5和RBS6。利用电穿孔仪将上述重组质粒通过电转化转入到重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum-CNA中，电击条件为电压1.5KV，5ms(电击杯宽度为1mm)。通过筛选和PCR扩增基因片段进行测序等方式，获得正确的重组菌株CGRBS1，CGRBS2，CGRBS3，CGRBS4，CGRBS5和CGRBS6。

Chase-F:CTCGGTACCCGGGGATCCAAGGAGCGTATATCATGACTGCACTTGCAATGACATTG(SEQID NO.36)

Chase-R:CAAGCTTGCATGCCTGCAGTCAAGGGAGTGGCGAGAG(SEQ ID NO.37)

MBP-F:CTCGGTACCCGGGGATCCATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGG(SEQ ID NO.38)

MBP-R:GCAGTAAAACGAAATATCGGCATAGTCTGCGCGTCTTTCAGG(SEQ ID NO.39)

Del2-5-F:TTTACTGCACTTGCAATGACAT(SEQ ID NO.40)

Del2-5-R:ATGTCATTGCAAGTGCAGTAAATAGTCTGCGCGTCTTTCAGG(SEQ ID NO.41)

RBS1-F:CTCGGTACCCGGGGATCCAAAGGGTTCATAGATGAAAATCGAAGAAGGTAA(SEQ IDNO.42)

RBS2-F:CTCGGTACCCGGGGATCCAAAGGAGTTGCTTATGAAAATCGAAGAAGGTAA(SEQ IDNO.43)

RBS3-F:CTCGGTACCCGGGGATCCAAAGGTGGTTCATATGAAAATCGAAGAAGGTAA(SEQ IDNO.44)

RBS4-F:CTCGGTACCCGGGGATCCAAAGGGGAGAGCCATGAAAATCGAAGAAGGTAA(SEQ IDNO.45)

RBS5-F:CTCGGTACCCGGGGATCCAAAGGCATGTTCTATGAAAATCGAAGAAGGTAA(SEQ IDNO.46)

RBS6-F:CTCGGTACCCGGGGATCCAAAGGCATGGCCGATGAAAATCGAAGAAGGTAA(SEQ IDNO.47)

RBS-R:GGATCCCCGGGTACCGAG(SEQ ID NO.48)

实施例2:利用重组谷氨酸棒杆菌生产软骨素寡聚糖

将实施例1构建的重组谷氨酸棒杆菌CGRBS1、CGRBS2、CGRBS3、CGRBS4、CGRBS5和CGRBS6在平板上活化，挑选单克隆接种于BHI液体培养基中，在200rpm，30℃的条件下培养10h后，并按2％的接种量转接于250mL装有发酵培养基的三角摇瓶中，在200rpm，28℃条件下培养，培养时长为48h。

发酵结束后收集上清，在上清中加入4倍体积的乙醇进行醇沉，去沉淀，将上清进行干燥。取干燥后固体加水溶解，去除不溶物，并重复上述操作三后进行收集。纯化后的样品通过硫酸咔唑法对软骨素寡聚糖含量进行测定，结果如图3所示，通过RBS序列的优化，摇瓶发酵软骨素寡聚糖产量最高达到1.1g L^-1(重组菌株CGRBS6)。纯化后的样品通过LC-MS-IT-TOF对分子结构进行鉴定，结果如图4所示。

实施例3:重组谷氨酸棒杆菌的5L发酵罐发酵培养

将实施例1构建的重组谷氨酸棒杆菌重组菌株CGRBS6在平板上活化，挑选单克隆接种于BHI液体培养基中，在200rpm，30℃的条件下培养10h后，并按2％的接种量转接于250mL三角摇瓶中，在200rpm、30℃条件下培养8h，然后以10％的接种量接种于5L发酵罐中，发酵培养基的装液量为1.5L，温度为30℃，搅拌转速为500rpm，通气量为5vv min，发酵过程中，通过流加14％的氨水，将发酵液的pH控制在6.5-7之间，通过流加500g L^-1的葡萄糖溶液维持发酵液环境中葡萄糖含量在10g L^-1附近，以维持菌株正常的生长所需，并在20h时添加0.1mM的氨苄青霉素。从图5可以看出，软骨素寡聚糖的产量在48h时最高达到20g L^-1。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种高效合成软骨素寡聚糖的重组谷氨酸棒杆菌

<130> BAA210253A

<160> 48

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 686

<212> PRT

<213> Escherichia coli K4

<400> 1

Met Ser Ile Leu Asn Gln Ala Ile Asn Leu Tyr Lys Asn Lys Asn Tyr

1 5 10 15

Arg Gln Ala Leu Ser Leu Phe Glu Lys Val Ala Glu Ile Tyr Asp Val

20 25 30

Ser Trp Val Glu Ala Asn Ile Lys Leu Cys Gln Thr Ala Leu Asn Leu

35 40 45

Ser Glu Glu Val Asp Lys Leu Asn Arg Lys Ala Val Ile Asp Ile Asp

50 55 60

Ala Ala Thr Lys Ile Met Cys Ser Asn Ala Lys Ala Ile Ser Leu Asn

65 70 75 80

Glu Val Glu Lys Asn Glu Ile Ile Ser Lys Tyr Arg Glu Ile Thr Ala

85 90 95

Lys Lys Ser Glu Arg Ala Glu Leu Lys Glu Val Glu Pro Ile Pro Leu

100 105 110

Asp Trp Pro Ser Asp Leu Thr Leu Pro Pro Leu Pro Glu Ser Thr Asn

115 120 125

Asp Tyr Val Trp Ala Gly Lys Arg Lys Glu Leu Asp Asp Tyr Pro Arg

130 135 140

Lys Gln Leu Ile Ile Asp Gly Leu Ser Ile Val Ile Pro Thr Tyr Asn

145 150 155 160

Arg Ala Lys Ile Leu Ala Ile Thr Leu Ala Cys Leu Cys Asn Gln Lys

165 170 175

Thr Ile Tyr Asp Tyr Glu Val Ile Val Ala Asp Asp Gly Ser Lys Glu

180 185 190

Asn Ile Glu Glu Ile Val Arg Glu Phe Glu Ser Leu Leu Asn Ile Lys

195 200 205

Tyr Val Arg Gln Lys Asp Tyr Gly Tyr Gln Leu Cys Ala Val Arg Asn

210 215 220

Leu Gly Leu Arg Ala Ala Lys Tyr Asn Tyr Val Ala Ile Leu Asp Cys

225 230 235 240

Asp Met Ala Pro Asn Pro Leu Trp Val Gln Ser Tyr Met Glu Leu Leu

245 250 255

Ala Val Asp Asp Asn Val Ala Leu Ile Gly Pro Arg Lys Tyr Ile Asp

260 265 270

Thr Ser Lys His Thr Tyr Leu Asp Phe Leu Ser Gln Lys Ser Leu Ile

275 280 285

Asn Glu Ile Pro Glu Ile Ile Thr Asn Asn Gln Val Ala Gly Lys Val

290 295 300

Glu Gln Asn Lys Ser Val Asp Trp Arg Ile Glu His Phe Lys Asn Thr

305 310 315 320

Asp Asn Leu Arg Leu Cys Asn Thr Pro Phe Arg Phe Phe Ser Gly Gly

325 330 335

Asn Val Ala Phe Ala Lys Lys Trp Leu Phe Arg Ala Gly Trp Phe Asp

340 345 350

Glu Glu Phe Thr His Trp Gly Gly Glu Asp Asn Glu Phe Gly Tyr Arg

355 360 365

Leu Tyr Arg Glu Gly Cys Tyr Phe Arg Ser Val Glu Gly Ala Met Ala

370 375 380

Tyr His Gln Glu Pro Pro Gly Lys Glu Asn Glu Thr Asp Arg Ala Ala

385 390 395 400

Gly Lys Asn Ile Thr Val Gln Leu Leu Gln Gln Lys Val Pro Tyr Phe

405 410 415

Tyr Arg Lys Lys Glu Lys Ile Glu Ser Ala Thr Leu Lys Arg Val Pro

420 425 430

Leu Val Ser Ile Tyr Ile Pro Ala Tyr Asn Cys Ser Lys Tyr Ile Val

435 440 445

Arg Cys Val Glu Ser Ala Leu Asn Gln Thr Ile Thr Asp Leu Glu Val

450 455 460

Cys Ile Cys Asp Asp Gly Ser Thr Asp Asp Thr Leu Arg Ile Leu Gln

465 470 475 480

Glu His Tyr Ala Asn His Pro Arg Val Arg Phe Ile Ser Gln Lys Asn

485 490 495

Lys Gly Ile Gly Ser Ala Ser Asn Thr Ala Val Arg Leu Cys Arg Gly

500 505 510

Phe Tyr Ile Gly Gln Leu Asp Ser Asp Asp Phe Leu Glu Pro Asp Ala

515 520 525

Val Glu Leu Cys Leu Asp Glu Phe Arg Lys Asp Leu Ser Leu Ala Cys

530 535 540

Val Tyr Thr Thr Asn Arg Asn Ile Asp Arg Glu Gly Asn Leu Ile Ser

545 550 555 560

Asn Gly Tyr Asn Trp Pro Ile Tyr Ser Arg Glu Lys Leu Thr Ser Ala

565 570 575

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<213> 人工序列

<400> 38

ctcggtaccc ggggatccat gaaaatcgaa gaaggtaaac tgg 43

<210> 39

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

gcagtaaaac gaaatatcgg catagtctgc gcgtctttca gg 42

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

tttactgcac ttgcaatgac at 22

<210> 41

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

atgtcattgc aagtgcagta aatagtctgc gcgtctttca gg 42

<210> 42

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

ctcggtaccc ggggatccaa agggttcata gatgaaaatc gaagaaggta a 51

<210> 43

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

ctcggtaccc ggggatccaa aggagttgct tatgaaaatc gaagaaggta a 51

<210> 44

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

ctcggtaccc ggggatccaa aggtggttca tatgaaaatc gaagaaggta a 51

<210> 45

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

ctcggtaccc ggggatccaa aggggagagc catgaaaatc gaagaaggta a 51

<210> 46

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

ctcggtaccc ggggatccaa aggcatgttc tatgaaaatc gaagaaggta a 51

<210> 47

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

ctcggtaccc ggggatccaa aggcatggcc gatgaaaatc gaagaaggta a 51

<210> 48

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

ggatccccgg gtaccgag 18

Claims

1.一种用于合成软骨素寡聚糖的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，异源表达软骨素合酶从而构建软骨素的合成途径，异源表达N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶和强化前体物质UDP-N-乙酰半乳糖胺和/或UDP-葡萄糖醛酸的合成途径的酶的表达以促进软骨素的合成，并表达软骨素裂解酶用于将软骨素裂解为软骨素寡聚糖。

2.根据权利要求1所述的一种用于合成软骨素寡聚糖的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述软骨素合酶为(a)、(b)、(c)或(d)所示：

(a)来源于大肠杆菌(Escherichia coli K4)的软骨素合酶KfoC，或与其有60％以上同源性的酶；

(b)来源于多杀巴斯德杆菌(Pasteurella multocida)软骨素合酶pmCS，或与其有60％以上同源性的酶；

(c)含有SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的酶；

3.根据权利要求1所述的一种用于合成软骨素寡聚糖的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶来源于大肠杆菌(E.coli K4)。

4.根据权利要求1所述的一种用于合成软骨素寡聚糖的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述强化前体物质UDP-N-乙酰半乳糖胺和/或UDP-葡萄糖醛酸的合成途径的酶的表达包括：过表达谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶、磷酸葡萄糖变位酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖-1-磷酸乙酰转移酶双功能酶、磷酸葡萄糖变构酶、葡萄糖-6-磷酸尿酰胺转移酶和UDP-葡萄糖脱氢酶。

5.根据权利要求1～4任一项所述的一种用于合成软骨素寡聚糖的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述的软骨素裂解酶是动物来源或者微生物来源的任何一种能够降解软骨素分子的软骨素裂解酶。

6.根据权利要求5所述的一种用于合成软骨素寡聚糖的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，软骨素裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

7.根据权利要求6所述的一种用于合成软骨素寡聚糖的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述的软骨素裂解酶N端融合了麦芽糖促融标签，且软骨素裂解酶N端前5个氨基酸序列进行了截短突变。

8.根据权利要求1-7任一项所述的一种用于合成软骨素寡聚糖的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，将编码软骨素合酶、编码前体物质UDP-N-乙酰葡萄糖胺和UDP-葡萄糖醛酸合成途径的基因及编码软骨素裂解酶的基因与载体连接或者整合至谷氨酸棒杆菌基因组上进行表达；所述载体包括以下任一种：pXMJ19、pECXK99E、pEC-XT99A、pEKEx1、pEKEx2、pVWEx1、pVWEx2、pZ8-1、pECTAC-K99、pAPE12；基因组整合位点包括基因组上任何非必需基因位点。

9.一种生产软骨素寡聚糖的方法，其特征在于，应用权利要求1～8任一所述的重组谷氨酸棒杆菌进行发酵培养；所述发酵培养指的是在含有碳源、氮源、无机盐、金属离子和氧气的环境中，于10～45℃的条件下进行发酵培养，培养周期在8-240h之间；优选在发酵过程补料流加碳源、氮源、无机盐、金属离子等营养物质。

10.权利要求1～8任一所述重组谷氨酸棒杆菌在制备软骨素及其衍生产品方面的应用。