CN113683658B - 一种修饰蛋白质组氨酸残基的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种修饰蛋白质组氨酸残基的方法，以缩硫醛类化合物为底物，在有机光催化剂存在下，通过合适波长的可见光的照射，用于化学修饰蛋白质组氨酸残基。本发明可使用无毒的有机化合物或金属有机化合物为催化剂，可见光为光源，适合实验室和工业化蛋白质组学研究应用。

Description

一种修饰蛋白质组氨酸残基的方法
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及一类蛋白质组氨酸探针，具体来说是一种修饰蛋白质组氨酸残基的方法。
背景技术
蛋白质组氨酸(His)残基具有缺电子的杂芳族咪唑侧链，在蛋白质中的丰度低至约2.2％。它在蛋白质功能中起着许多重要的作用，包括氢键供体/受体，质子穿梭，金属配位，金属介导的共价修饰和亲核催化。咪唑侧链是一个良好的亲核基团，并且是离去基团，但对热和酸不稳定，因此很难在生物样品中检测到修饰的组氨酸，例如磷酸化组氨酸。尽管近年来已报道了使用中性损失片段化进行大规模磷酸组氨酸的研究，并在近年来引起了越来越多的关注，但尚没有针对组氨酸残基的稳健修饰方法。
四价有机硫(IV)分子，包括锍盐和硫鎓盐等，通常表现出亲电性，因此可以进行经典的亲核取代反应，甚至已被用作SNAr反应中极好的离去基团。例如，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和蛋白质His残基之间的甲基转移酶催化的亲核甲基化反应。硫鎓盐是Pummerer反应的重要中间状态，在亲核反应和SEAr反应中作为底物具有很高的活性。
发明内容
针对蛋白质组氨酸残基的化学选择性修饰技术和应用的需求，本发明提供了一种修饰蛋白质组氨酸残基的方法，所述的修饰蛋白质组氨酸残基的方法是一种以缩硫醛为活性官能团的蛋白质组氨酸残基的高效选择性化学修饰方法。
本发明提供了一种修饰蛋白质组氨酸残基的方法，包括如下步骤：
1)以缩硫醛类化合物及其衍生物为反应底物；所述的缩硫醛类化合物及其衍生物的结构式如下所述，
Figure BDA0003207039600000011
或者
Figure BDA0003207039600000012
或者
Figure BDA0003207039600000021
或者
Figure BDA0003207039600000022
或者
Figure BDA0003207039600000023
或者
Figure BDA0003207039600000024
或者
Figure BDA0003207039600000025
或者
Figure BDA0003207039600000026
或者
Figure BDA0003207039600000027
或者
Figure BDA0003207039600000028
或者
Figure BDA0003207039600000029
或者
Figure BDA00032070396000000210
或者
Figure BDA00032070396000000211
或者
Figure BDA00032070396000000212
R为
Figure BDA00032070396000000213
或者
Figure BDA00032070396000000214
或者
Figure BDA00032070396000000215
或者
Figure BDA00032070396000000216
R’为
Figure BDA00032070396000000217
或者
Figure BDA00032070396000000218
R”为
Figure BDA0003207039600000031
或者
Figure BDA0003207039600000032
2)加入需要修饰的蛋白质，所述的化学修饰位点为蛋白质组氨酸残基；缩硫醛类化合物及其衍生物底物的投料为蛋白质的10当量至200当量；
3)采用光氧化还原催化剂，所述的光氧化还原催化剂为有机和金属光氧化还原催化剂；所用催化剂在反应体系中的浓度为10微摩尔每升至100微摩尔每升；所述的有机和金属光氧化还原催化剂的结构特征如下；
Figure BDA0003207039600000033
Figure BDA0003207039600000034
或者
Figure BDA0003207039600000035
Figure BDA0003207039600000036
或者
Figure BDA0003207039600000037
Figure BDA0003207039600000038
或者
Figure BDA0003207039600000039
Figure BDA0003207039600000041
4)采用光照，所使用的光源为蓝光，波长为430至480nm，功率为10至45W；
5)所述的反应溶剂为水或极性有机溶剂，pH范围为4至10；所述的溶剂选自水、乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇、乙二醇、甘油、三氟乙醇、六氟异丙醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺中的任意一种或者它们任意两种的混合溶剂；
6)所需的反应时间为1小时至6小时，反应温度为37摄氏度，完成蛋白质组氨酸残基的修饰。
本发明的一种修饰蛋白质组氨酸残基的方法，以缩硫醛类化合物为底物，在有机光催化剂存在下，通过合适波长的可见光的照射，用于化学修饰蛋白质组氨酸残基。本发明可使用无毒的有机化合物或金属有机化合物为催化剂，可见光为光源，适合实验室和工业化蛋白质组学研究应用。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明适用于蛋白质组氨酸残基的化学修饰，通过光催化在短时间内实现反应的快速进行。本发明使用的反应底物和光催化剂容易获得并且毒性较小，适合实验室和工业化生产，并适合实验室和工业化蛋白质组学研究应用。
附图说明
图1缩硫醛化合物的一般合成方法。
图2带长链的缩硫醛化合物的一般合成方法。
图3缩硫醛探针与离体蛋白质的反应的荧光显色蛋白胶图。
图4缩硫醛探针与细胞裂解液的反应的免疫共沉淀蛋白胶图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步详细说明本发明，但本发明绝非仅限于此。
实施例1
1.缩硫醛底物的合成
在圆底烧瓶中加入12.2g 4-羟基苯甲醛和11.8g溴丙炔并用300mL乙醇溶解。将13.8g无水碳酸钾加入反应体系，并油浴加热回流反应6小时。反应结束后，旋转蒸发去除有机溶剂，加入500mL水稀释所得粘稠混合物。使用100mL×3乙酸乙酯萃取该水溶液，合并有机相，100mL×2 0.1M稀盐酸和100mL×2饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发去除有机溶剂。使用石油醚和乙酸乙酯重结晶粗产品，过滤干燥所得白色固体，即为产物4-炔丙氧基苯甲醛(13.9g，收率87％)。
1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.84(s,1H),7.95–7.67(m,2H),7.16–6.94(m,2H),4.73(d,J＝2.4Hz,2H),2.57(t,J＝2.4Hz,1H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ190.85,162.34,131.87,130.48,115.14,77.55,76.44,55.91。
在圆底烧瓶中加入硫醇(4当量)和4-炔丙氧基苯甲醛(1当量)，并加入二氯甲烷溶解起始原料。将催化量的N-溴琥珀酰亚胺(NBS，5mol％)加入到混合物中。将溶液在室温下搅拌2小时。反应完成后，将有机相用饱和食盐水洗涤两次，并用无水硫酸钠干燥，并在旋转蒸发仪上浓缩。粗产物通过快速柱色谱使用洗脱液石油醚/乙酸乙酯纯化。产物结构即核磁表征数据如下。
Figure BDA0003207039600000061
(淡黄色油状物，收率93％)1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ7.47–7.30(m,2H),7.02–6.82(m,2H),4.90(s,1H),4.66(d,J＝2.3Hz,2H),2.71–2.37(m,5H),1.20(t,J＝7.4Hz,6H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ157.05,133.43,128.85,114.78,78.49,75.67,55.84,51.75,26.20,14.30.
Figure BDA0003207039600000062
(淡黄色油状物，收率91％)1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ7.35(d,J＝8.7Hz,2H),6.93–6.83(m,2H),4.84(s,1H),4.61(d,J＝2.4Hz,2H),2.60–2.36(m,5H),1.53(h,J＝7.1Hz,4H),0.91(t,J＝7.3Hz,6H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ157.01,133.59,128.86,114.72,78.58,75.76,55.81,52.48,34.25,22.55,13.58.
Figure BDA0003207039600000063
(淡黄色油状物，收率82％)1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ7.42–7.30(m,2H),6.99–6.85(m,2H),5.85–5.72(m,2H),5.13–5.06(m,4H),4.74(s,1H),4.67(d,J＝2.4Hz,2H),3.25(dd,J＝13.7,7.1Hz,2H),3.03(dd,J＝13.7,7.2Hz,2H),2.53(dt,J＝4.5,2.2Hz,1H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ157.13,133.81,132.77,129.23,117.57,114.85,78.46,75.68,55.84,49.68,35.24.
Figure BDA0003207039600000064
(白色粉末，收率90％)1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ7.34(d,J＝8.7Hz,2H),6.89(d,J＝8.7Hz,2H),5.03(s,1H),4.63(d,J＝2.3Hz,2H),3.66(t,J＝6.0Hz,4H),3.43(s,2H),2.82–2.69(m,2H),2.67–2.56(m,2H),2.54(t,J＝2.3Hz,1H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ157.23,132.92,128.93,114.97,78.43,75.98,61.34,55.88,52.45,35.10.
Figure BDA0003207039600000071
(黄色油状物,收率88％)1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ7.75(d,J＝8.3Hz,2H),7.46(d,J＝8.2Hz,2H),6.91(t,J＝4.8Hz,1H),4.84(s,1H),4.19(dd,J＝5.3,2.5Hz,2H),2.55–2.33(m,4H),2.23(t,J＝2.5Hz,1H),1.53(h,J＝7.2Hz,4H),0.90(t,J＝7.4Hz,6H).
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ166.84,144.64,133.06,127.91,127.43,79.59,71.65,52.57,34.28,29.67,22.46,13.47.
Figure BDA0003207039600000072
(白色粉末，收率92％)1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ7.52–7.41(m,2H),6.97–6.86(m,2H),5.62(s,1H),4.65(d,J＝2.4Hz,2H),3.50–3.36(m,2H),3.36–3.21(m,2H),2.57(t,J＝2.4Hz,1H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ157.26,133.03,129.27,114.84,78.70,75.96,55.96,55.88,40.31.
Figure BDA0003207039600000073
(白色粉末，收率90％)1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ7.40(d,J＝8.6Hz,2H),6.93(d,J＝8.7Hz,2H),5.13(s,1H),4.67(d,J＝2.3Hz,2H),3.17–2.82(m,4H),2.52(t,J＝2.2Hz,1H),2.26–2.09(m,1H),2.01–1.81(m,1H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ157.50,132.22,128.96,115.02,78.39,75.64,55.80,50.66,32.14,25.04.
向圆底烧瓶中加入溶于50mL四氢呋喃和2,2'-(乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-1-醇)(1.5g，10mmol)。冰浴冷却下，一次加入NaOH(0.8g，20mmol)。搅拌反应1小时后，滴加溴丙炔(1.18g，10mmol)。反应溶液升至室温反应16小时。反应完成后，除去溶剂，加入20mL水。用1M稀盐酸中和该水溶液，并用二氯甲烷(3×20mL)萃取。有机相用饱和食盐水(2×10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。粗产物通过快速柱色谱纯化。纯化的中间体直接用于下一步。将中间体2-(2-(2-(2-(2--2-(丙-2-炔-1-氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-醇)、对甲苯磺酰氯(TsCl，1.9g，10mmol)和三乙胺(1.01g，10mmol)，溶于50mL二氯甲烷。将溶液搅拌2小时。一次性加入4-羟基苯甲醛(1.22g，10mmol)，并继续反应16小时。反应完成后，除去溶剂，加入50mL水。混合物用二氯甲烷(3×20mL)萃取。有机相用饱和食盐水(2×10mL)洗涤，并用无水硫酸钠干燥。粗产物通过快速柱色谱使用洗脱液石油醚/乙酸乙酯(2∶1)纯化，得到无色油状物即为产物(1.87g，两步收率64％)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.83(s,1H),7.83–7.73(m,2H),7.04–6.92(m,2H),4.17(dd,J＝5.4,4.3Hz,2H),4.15(d,J＝2.4Hz,2H),3.84(dd,J＝5.4,4.1Hz,2H),3.71–3.67(m,2H),3.64(tdd,J＝4.3,2.7,0.9Hz,6H),2.40(t,J＝2.4Hz,1H).13C NMR(126MHz,Chloroform-d)δ190.82,163.87,131.96,130.05,114.91,79.66,74.64,70.89,70.66,70.47,69.48,69.11,67.79,58.41.
由醛基中间体制备缩硫醛产物的方法与上述缩硫醛的合成相同。
Figure BDA0003207039600000081
(无色油状物，收率91％):1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.38–7.29(m,2H),6.91–6.78(m,2H),4.81(s,1H),4.17(d,J＝2.5Hz,2H),4.11–4.07(m,2H),3.84–3.80(m,2H),3.70(ddt,J＝6.5,3.6,2.0Hz,2H),3.67–3.65(m,6H),2.54–2.41(m,4H),2.40(d,J＝2.4Hz,1H),1.54(pd,J＝7.7,1.0Hz,4H),0.91(t,J＝7.3Hz,6H).
13C NMR(126MHz,Chloroform-d)δ158.31,132.85,128.85,114.53,79.69,74.59,70.85,70.69,70.48,69.74,69.13,67.47,58.43,52.51,34.33,22.60,13.58.
Figure BDA0003207039600000091
(无色油状物，收率83％):1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.34(d,J＝8.4Hz,2H),6.85(d,J＝8.4Hz,2H),5.04(s,1H),4.22–4.13(m,2H),4.08(d,J＝4.4Hz,2H),3.88–3.76(m,2H),3.67(q,J＝5.4Hz,10H),3.19(t,J＝38.8Hz,2H),2.78(dq,J＝12.0,6.8,5.7Hz,2H),2.63(dt,J＝13.1,5.8Hz,2H),2.46(s,1H).
13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ158.52,132.26,128.94,114.72,79.67,74.84,70.75,70.60,70.39,69.67,69.08,67.47,61.38,58.40,52.54,35.21.
Figure BDA0003207039600000092
(无色油状物，收率81％)1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.53(s,1H),7.55–7.46(m,2H),6.72(d,J＝8.6Hz,2H),3.90(d,J＝4.3Hz,2H),3.57(dd,J＝5.7,3.7Hz,2H),3.38–3.28(m,8H).
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ190.80,163.60,131.73,129.66,114.65,72.37,70.45,69.94,69.06,67.47,61.00.
由醛基中间体制备缩硫醛产物的方法与上述缩硫醛的合成相同。
Figure BDA0003207039600000093
(无色油状物，收率87％)1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.24(d,J＝8.3Hz,2H),6.75(d,J＝8.3Hz,2H),4.75(s,1H),3.99(t,J＝4.8Hz,2H),3.72(dd,J＝5.7,3.8Hz,2H),3.59(dq,J＝4.9,2.8,2.3Hz,4H),3.56–3.52(m,2H),3.48–3.44(m,2H),2.48–2.29(m,4H),1.45(h,J＝7.3Hz,4H),0.83(t,J＝7.4Hz,6H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ158.15,132.81,128.81,114.40,72.61,70.69,70.22,69.58,67.31,61.44,52.39,34.21,22.51,13.53.
由醛基中间体制备缩硫醛产物的方法与上述缩硫醛的合成相同。
Figure BDA0003207039600000101
(白色固体，收率86％):1H NMR(300MHz,Methanol-d4)δ7.52–7.42(m,2H),7.10–7.01(m,2H),4.98(s,1H),4.48(dd,J＝7.8,4.3Hz,1H),4.30(dd,J＝7.9,4.5Hz,1H),3.27–3.15(m,1H),3.03–2.76(m,2H),2.64–2.43(m,6H),1.77(ddd,J＝15.3,7.4,4.6Hz,3H),1.70–1.52(m,7H),0.94(t,J＝7.4Hz,6H).
13C NMR(75MHz,MeOD)δ180.18,172.35,164.68,150.12,138.71,128.56,121.31,61.98,60.21,55.57,51.91,39.72,33.93,33.42,29.21,28.30,24.46,22.23,12.46.
由醛基中间体制备缩硫醛产物的方法与上述缩硫醛的合成相同。
Figure BDA0003207039600000102
(无色油状物，收率89％):1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.77(d,J＝8.2Hz,2H),7.45(d,J＝8.4Hz,2H),7.31(t,J＝4.8Hz,1H),6.81(t,J＝5.1Hz,1H),6.72(s,1H),5.99(s,1H),4.84(s,1H),4.47–4.38(m,1H),4.28–4.18(m,1H),3.68–3.53(m,8H),3.49(dt,J＝10.9,5.3Hz,2H),3.36(dtt,J＝14.3,8.8,4.1Hz,2H),3.07(q,J＝7.3Hz,1H),2.82(dd,J＝12.8,4.7Hz,1H),2.72–2.61(m,2H),2.55–2.40(m,4H),2.15(t,J＝7.6Hz,2H),1.72–1.48(m,8H),1.36(p,J＝7.3Hz,2H),0.91(t,J＝7.3Hz,6H).
2.缩硫醛探针与离体蛋白质的反应
为了验证缩硫醛与组氨酸(His)共价结合在蛋白标记层面的反应性，将10μM商业化的BSA(牛血清蛋白)与200μM TA1-5在带有5％虎红钠盐催化剂的PBS溶液中于37℃蓝光下(440nm)孵育2小时。然后利用“click”反应给蛋白标记荧光标签，具体做法是在反应体系中加入CuSO4(1mM)，TECP(1mM)，TBTA(100μM)，5-TAMRA-N3(100μM)，最后跑SDS-PAGE蛋白胶，观察胶内荧光。
从图3b蛋白的标记实验中，我们观察到缩硫醛TA2与TA4较强的荧光，因此我们选择TA2与TA4进行后续蛋白标记反应。蓝光很重要，白光下蛋白标记的效率明显降低，没有光源无法实现TA2探针的蛋白标记(图3c)。
从图3d中发现TA2探针在碱性条件下显示出更好的标记效率。为了进一步探究TA2探针标记反应的动力学与化学计量关系，将BSA跟TA2探针在不同的时间梯度以及浓度梯度下发生反应，图3e跟图3f表明20倍蛋白单量的TA2探针够跟蛋白充分反应，并且该反应在2小时后达到饱和。TA2与BSA的标记能被1a竞争，表明该标记是由硫缩醛探针引发的，而不是非特异性标记(图3g)。最后，通过LC-MS/MS确定了带有BSA的TA2标记位点，图3h显示半胱氨酸和组氨酸残基被BSA共价修饰。两者合计，结果表明TA2可有效地选择性标记蛋白质上的天然组氨酸残基。最后，我们进行了TA2标记MCF-7细胞裂解液的凝胶内荧光分析，图3i表明TA2能够高效标记复杂的细胞裂解液环境。
3.缩硫醛探针与细胞裂解液的反应
为了在组氨酸标记中进一步应用硫缩醛探针(图3a)，我们使用另一种蛋白质碳酸酐酶(包含9个组氨酸残基但不含半胱氨酸残基)进行标记并通过蛋白免疫印迹检测(图4a)。在图4b中，TA6探针的印迹条带比TA7探针强，可能是因为更长的接头具有更大的空间位阻。MCF7细胞裂解物中的标记也证明了较大空间位阻的影响(图4c)。为了增加TA2与TA4探针在细胞裂解液或者细胞培养中的溶解度，我们合成了TA8与TA9探针。将商业化的碳酸酐酶蛋白与TA8探针在带有5％虎红钠盐催化剂的PBS溶液中于37℃蓝光下孵育2小时，然后将反应体系与Biotin-Azide通过点击化学反应连接起来，紧接着进行蛋白免疫印迹分析。TA8探针更强的条带显示了更好的标记效率(图4d)。然后，为了评估TA8探针与乳腺癌细胞系(MCF-7)的蛋白质组反应性，我们进行了浓度依赖性标记反应。图4e显示，在复杂细胞裂解液环境中，40μM TA8就可以产生许多清晰可见的条带，并在80μM处达到饱和。TA8与MCF-7裂解液的标记能被1b竞争(图4f)，这与BSA竞争性标记的结果一致。随后，用IAA预处理的整个泳道中的荧光强度也降低了，表明TA8能够微弱地标记半胱氨酸(图4g)。相比之下，NHS-Ace预处理的泳道显示出很强的标记荧光，证实了TA8标记主要不发生在赖氨酸残基上(图4h)。

Claims (1)

1.一种修饰蛋白质组氨酸残基的方法，其特征在于包括如下反应步骤：
1)以缩硫醛类化合物或其衍生物为反应底物；所述的缩硫醛类化合物或其衍生物的结构式如下所述，
Figure FDA0004129031830000011
或者
Figure FDA0004129031830000012
或者
Figure FDA0004129031830000013
或者
Figure FDA0004129031830000014
或者
Figure FDA0004129031830000015
R为
Figure FDA0004129031830000016
或者
Figure FDA0004129031830000017
R’为
Figure FDA0004129031830000018
或者
Figure FDA0004129031830000019
R”为
Figure FDA00041290318300000110
或者
Figure FDA00041290318300000111
2)加入需要修饰的蛋白质，所述的化学修饰位点为蛋白质组氨酸残基；缩硫醛类化合物或其衍生物底物的投料为蛋白质的10当量至200当量；
3)加入光氧化还原催化剂，所使用的光氧化还原催化剂为有机和金属光氧化还原催化剂；所用催化剂在反应体系中的浓度为10微摩尔每升至100微摩尔每升；
所述的有机和金属光氧化还原催化剂的结构特征如下；
Figure FDA0004129031830000021
或者
Figure FDA0004129031830000022
Figure FDA0004129031830000023
Figure FDA0004129031830000024
或者R″′＝Me；
4)采用光照，所使用的光源为蓝光，波长为430至480nm，功率为10至45W；
5)所述的反应溶剂为水或极性有机溶剂，所述的反应溶剂的pH范围为4至10；所述的反应溶剂选自水、乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇、乙二醇、甘油、三氟乙醇、六氟异丙醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺中的任意一种或者它们任意两种的混合溶剂；
6)所需的反应时间为1小时至6小时，反应温度为37摄氏度，完成蛋白质组氨酸残基的修饰。
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