CN113667655A - 一种仙茅糖基转移酶Co84A-471基因及在制备苔黑酚葡萄糖苷中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种仙茅糖基转移酶Co84A‑471基因及在制备苔黑酚葡萄糖苷中的应用。仙茅糖基转移酶Co84A‑471基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。以苔黑酚和糖基供体UDP‑葡萄糖为原料，在由仙茅糖基转移酶Co84A‑471基因编码得到的仙茅糖基转移酶的催化下，在苔黑酚的C3或C5位上的羟基上进行一次糖基化，生成苔黑酚葡萄糖苷。本发明通过体外合成苔黑酚葡萄糖苷，可控性强，可以减少对原料种植的需求，节约农业用地，生产产物单一，便于后期苔黑酚葡萄糖苷的分离和纯化。所述仙茅糖基转移酶Co84A‑471基因作为苔黑酚葡萄糖苷生物合成的关键基因，还可用于仙茅等植物育种研究。

Description

一种仙茅糖基转移酶Co84A-471基因及在制备苔黑酚葡萄糖 苷中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种仙茅糖基转移酶Co84A-471基因及在制备苔黑酚葡萄糖苷上的应用。

背景技术

仙茅(Curculigo orchioides Gaertn)为石蒜科(Amaryllidaceae)仙茅属(Curculigo)药用植物，以根状茎入药。酚类成分在仙茅属中分布广泛，为主要成分，目前已从仙茅的根状茎中分离鉴定出多种酚苷类，其成分仙茅苷(Curculigoside)和苔黑酚葡萄糖苷(Orinol glucoside，OG)是仙茅的主要活性成分。

苔黑酚葡萄糖苷，具有多种显著的药理活性，如在有抗氧化、抗骨质疏松、抗抑郁、抗焦虑及免疫调节等多种药理学活性较为明显，并对不同消化道癌细胞系有一定的细胞毒活性(强明敏等，苔黑酚葡萄糖苷药代动力学及药理活性研究进展，辽宁中医药大学学报，20210514)。苔黑酚葡萄糖苷主要分布于仙茅等仙茅属植物中，在仙茅根状茎中含量较高,而这些植物对栽培环境要求较为苛刻，生长周期长，且产量低；此外，还具有提取工艺流程较为复杂、分离得率低等不足，使得苔黑酚葡萄糖苷的产量低，导致市场价格高。如何有效获得大量高纯度的苔黑酚葡萄糖苷，满足科学试验及市场应用需求，一直都是大家关注的焦点。

发明内容

为了解决如何高效快速获得大量高纯度的苔黑酚葡萄糖苷问题，本发明提供了一种仙茅糖基转移酶Co84A-471基因及在制备苔黑酚葡萄糖苷中的应用，所述仙茅糖基转移酶Co84A-471基因可作为苔黑酚葡萄糖苷的生物合成调控基因。

本发明提供的一种仙茅糖基转移酶Co84A-471基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供一种所述的仙茅糖基转移酶Co84A-471基因编码的仙茅糖基转移酶。

作为优选，一种所述的仙茅糖基转移酶Co84A-471基因编码的仙茅糖基转移酶Co84A-471的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种含有所述的仙茅糖基转移酶Co84A-471基因的重组质粒。

作为优选，所述的重组质粒，通过将所述的仙茅糖基转移酶Co84A-471基因与pET28a载体同源重组获得，命名为pET28a-UGTCo84A-471。

本发明还提供了一种转基因工程菌，含有所述的重组质粒，或所述基因工程菌的基因组中整合有外源的所述的仙茅糖基转移酶Co84A-471基因。

作为优选，所述的转基因工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

本发明还提供了所述的仙茅糖基转移酶或所述的仙茅糖基转移酶Co84A-471在制备苔黑酚葡萄糖苷中的应用。

本发明还提供了一种苔黑酚葡萄糖苷的制备方法，该方法包括：以苔黑酚和糖基供体UDP-葡萄糖为原料，在所述的仙茅糖基转移酶Co84A-471基因编码的仙茅糖基转移酶或所述仙茅糖基转移酶Co84A-471基因编码的仙茅糖基转移酶Co84A-471(氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)的催化下，在苔黑酚C3或C5位上的羟基上进行一次糖基化，生成苔黑酚葡萄糖苷。

本发明还提供了一种克隆所述的仙茅糖基转移酶Co84A-471基因的引物，所述引物由引物F和引物R组成，所述引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)测序技术的快速发展，极大地推进了苔黑酚葡萄糖苷生物合成路径关键酶基因的挖掘，本发明中苔黑酚葡萄糖苷的生物合成调控基因即仙茅糖基转移酶Co84A-471基因是首次鉴定并成功验证，开辟了一种生产苔黑酚葡萄糖苷的新方法。本发明通过异源表达与体外催化的方式来获得目标产物，采用体外生物合成，进行定向生产，具有副产物少等优点。

(2)本发明提供了含有该Co84A-471基因的重组质粒、基因工程菌和重组蛋白，为通过生物工程方法大量合成苔黑酚葡萄糖苷，进一步为酚苷类生物合成调控研究奠定基础。

(3)通过体外合成苔黑酚葡萄糖苷，可控性强，可以减少对原料种植的需求，节约农业用地，生产产物单一，便于后期苔黑酚葡萄糖苷的分离和纯化。所述仙茅糖基转移酶Co84A-471基因作为苔黑酚葡萄糖苷生物合成的关键基因，还可用于仙茅等植物育种研究。

序列表中SEQ ID NO：1所示的是仙茅糖基转移酶Co84A-471基因的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：2所示的是仙茅糖基转移酶Co84A-471基因编码的仙茅糖基转移酶Co84A-471的氨基酸系列。

序列表中SEQ ID NO：3所示的是引物F的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：4所示的是引物R的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：5所示的是上游同源臂引物的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：6所示的是下游同源臂引物的核苷酸序列。

附图说明

图1为苔黑酚葡萄糖苷生物合成路径示意图。

图2为质粒pET28a-UGTCo84A-471的图谱(用于表达仙茅糖基转移酶Co84A-471)。

图3为仙茅糖基转移酶Co84A-471基因酶促反应的HPLC图谱，其中，图3-A为实验样品：仙茅糖基转移酶Co84A-471+苔黑酚+UDP-葡萄糖；图3-B为实验对照：苔黑酚+UDP-葡萄糖+灭活的仙茅糖基转移酶Co84A-471；图3-C为标准品：苔黑酚+苔黑酚葡萄糖苷。

图4为酶活性验证反应产物的质谱分析(LC/MS)图谱，其中，图4-A为总离子流图；图4-B为210nm紫外图谱；图4-C为底物苔黑酚的保留时间12.38分钟；图4-D为反应产物苔黑酚葡萄糖苷的保留时间12.36分钟。

图5为标准品苔黑酚葡萄糖苷的质谱分析(LC/MS)图谱，其中，图5-A为210nm紫外图谱；图5-B总离子流图；图5-C为标准品苔黑酚的保留时间23.53分钟；图5-D为标准品苔黑酚葡萄糖苷的保留时间12.52分钟。

图6为反应产物苔黑酚葡萄糖苷的碎离子图(理论分子量285)(LC/MS)。

图7为标准品苔黑酚葡萄糖苷的碎离子图(理论分子量285)(LC/MS)。

具体实施方式

实施例1

UGT候选基因糖基转移酶Co84A-471的挖掘及体外验证

以仙茅的膨大根茎和叶为材料，取样后送广州基迪奥生物科技有限公司进行转录组测序。首先，根据转录组数据的注释结果，筛选出全部候选的糖基转移酶101个。其次，结合已知功能的糖基转移酶基因，包括拟南芥UGT84A1，葡萄GT2等的特点，然后再结合苔黑酚葡萄糖苷在仙茅根茎中的含量分布特点，以及基因表达量进行综合分析，初步筛选出6个可能的候选基因。对候选基因经过克隆、同源重组、原核表达、体外酶促反应、高效液相检测及LC/MC鉴定等一系列工作后，最终鉴定出可以与苔黑酚的C3或C5位上的羟基进行催化反应(图1)，生成苔黑酚的目标候选基因Co84A-471，命名为仙茅糖基转移酶Co84A-471基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

通过仙茅糖基转移酶Co84A-471催化苔黑酚的C3或C5位上的羟基进行糖基化生成苔黑酚葡萄糖苷，此过程中所有试剂、仪器均为市售。各阶段的具体操作如下：

(1)cDNA模板的制备

以仙茅根茎为材料，取鲜样，液氮速冻后，进行RNA提取。RNA提取采用Magen(美基生物)的HiPure Plant RNAMini Kit试剂盒，按试剂盒的操作步骤提取获得RNA，经检测合格后，使用TAKARA反转录试剂盒，根据其说明书，将RNA反转录成cDNA，-80℃保存备用。

(2)目标基因的克隆

基于仙茅根状茎的转录组数据，获得候选基因仙茅糖基转移酶Co84A-471的核酸序列，以cDNA为模板，按高保真KOD酶使用说明书操作，用引物SEQ ID NO：3(引物F)和SEQID NO：4(引物F)进行PCR扩增获得仙茅糖基转移酶Co84A-471基因片段。此外与载体pET28a进行同源重组的仙茅糖基转移酶Co84A-471的基因需要带同源臂引物，所以，结合仙茅糖基转移酶Co84A-471基因在大肠杆菌pET28a中的插入位置(BamHI and Xhol)，使用CE Design软件设计同源臂引物，用同源臂引物，以上述获得的仙茅糖基转移酶Co84A-471基因片段为模板再次进行PCR扩增(按高保真KOD酶使用说明书操作)，获得带载体同源臂的仙茅糖基转移酶Co84A-471基因片段。所用同源臂引物由上游同源臂引物和下游同源臂引物组成，所述上游同源臂引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，下游同源臂引物的核苷酸序列如SEQID NO：6所示。

上游同源臂引物：cagcaaatgggtcgcggatccATGGAAGCATCAACCACCAC(SEQ ID NO：5)

下游同源臂引物：tggtggtgctcgagtgcggccgcTTATTCCCCACTACGCATCC(SEQ ID NO：6)

(SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6中小写字母代表同源臂，大写字母代表仙茅糖基转移酶Co84A-471基因特异性引物序列)。

采用高保真KOD酶进行仙茅糖基转移酶Co84A-471基因克隆，PCR程序为：94℃、5min；94℃、30S，58℃、50S，72℃、90s，35个循环；72℃、7min。PCR结束后，进行跑胶，确认扩增成功后采用EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒进行目的条带回收进行。回收后在NanoReady超微量紫外可见分光光度计上测定其回收浓度，最后放-20℃冰箱中保存备用。

(3)同源重组

采用BamHI and Xhol酶对大肠杆菌pET28a进行双酶切得到线性化载体，基因回收使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒。同源重组时，则按照同源重组酶的操作说明进行组装，然后根据插入片段和载体的浓度，并按照重组说明计算各组分用量，将重组表达质粒转化到宿主菌株E.coli BL21(DE3)感受态细胞。组装完毕后，进行涂板，所用平板为添加了含100μg/ml卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养箱内暗培养12-15小时。之后挑选平板上的单菌落，进行菌水PCR扩增、跑胶等，检测为阳性克隆后，送测序公司检测，作进一步最终确认。组装成功后进行保种，得到仙茅糖基转移酶Co84A-471的重组表达菌株(图2)。

表1候选基因重组反应体系

其中X＝(0.02×pET28a碱基对数)ng/线化化pET32a浓度ng/μL；Y＝(0.02×pET28a碱基对数)ng/仙茅糖基转移酶Co84A-471回收浓度ng/μL。

(4)蛋白表达及纯化

经蛋白表达小试后确定仙茅糖基转移酶Co84A-471的蛋白诱导条件为：16℃、0.1mM的IPTG、210转/分，诱导14小时。再对重组表达菌株进行大摇，待OD值在0.6-0.8之间时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，混匀后在16℃摇床中进行培养，转速为210转/分，诱导14小时；之后在4℃，5000rpm的条件下，进行离心收菌。采用Tris-HCl缓冲液(pH:8.0，50mMTris，200mM NaCl)缓冲液对离心后菌体进行充分重悬，重悬结束后采用细胞破碎仪进行破碎；对破碎菌液在4℃条件下进行高速离心，留上清；采用镍柱(Ni NTA beads)对上清进行纯化,先利用两个柱体积的Tris-HCl(pH:8.0，50mM Tris，200mM NaCl)对镍柱进行一个平衡，再依次用分别含有20mM，40mM，60mM，80mM，100mM咪唑的Tris-HCl缓冲液(pH:8.0，50mMTris，200mM NaCl)洗去杂蛋白，之后用含有200mM咪唑的Tris-HCl(pH:8.0，50mM Tris，200mM NaCl)洗脱得到目标蛋白，纯化结束后采用Millipore超滤管进行浓缩，得到纯酶。

(5)酶活性验证

体外验证的酶促反应体系(表1)，进行糖基转移酶实验

表2体外验证的酶促反应体系

组分	用量(微升)	浓度(毫摩尔)
			苔黑酚	2	100mM
UDP-葡萄糖	4	100mM
			仙茅糖基转移酶Co84A-471	94	/
总体系	100	/

在30℃温度条件下培养反应12小时，之后用100微升色谱甲醇终止反应。

(6)产物检测

对产物分别进行HPLC、LC/MS检测。

HPLC检测方法如下：

液相色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱子(250mm×4.6mm，5.0μm)。流动相为：0.01％甲酸水(A)和乙腈(B).梯度洗脱程序如下：0～13min，90％A；20min，75％A；25min，65％A，30min，20％A。波长：210nm。流速0.6mL/min。柱温25℃。样品进样量10μL。高效液相检测结果见图3，在对照组(苔黑酚2微升+UDP-葡萄糖4微升+94微升灭活的仙茅糖基转移酶Co84A-471)中没有产物苔黑酚葡萄糖苷的出现。而在实验组(苔黑酚2微升+UDP-葡萄糖4微升+94微升仙茅糖基转移酶Co84A-471)在12.577分钟出现了新峰，并与标准品苔黑酚葡萄糖苷(1mM，10微升)的出峰时间12.369分钟基本对应。

LC/MS检测方法如下：

为了进一步确认所得到的产物为苔黑酚葡萄糖苷，采用Agilent Q-TOF 6540液相色谱质谱联用仪(LC/MS)进行检测，检测方法如下：

质谱条件：离子源采用的是负离子模式，电压3500V；碎裂电压:175V；锥孔电压:65V；射频电压:750V，扫描范围：50-1700m/z。

色谱条件：使用的柱子是Agilent ZORBAX SB-C18柱子(250mm×4.6mm，5.0μm)，流速0.6ml/min。流动相是0.01％甲酸(A)和乙腈(B)，梯度是0分钟A:B＝90:10，13分钟是A:B＝90:10，20分钟是A:B＝75:25，25分钟是A:B＝35:65，30分钟是A:B＝20:80。

由检测结果图4～图7，可以看出，产物的出峰时间、及特征碎离子均与标准品苔黑酚葡萄糖苷相吻合，确认反应产物为苔黑酚葡萄糖苷。最终得出糖基转移酶Co84A-471具有催化苔黑酚的C3或C5位上的羟基上进行一次糖基化的能力，生成苔黑酚葡萄糖苷。

序列表

<110> 云南农业大学

<120> 一种仙茅糖基转移酶Co84A-471基因及在制备苔黑酚葡萄糖苷中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1401

<212> DNA

<213> 仙茅(Curculigo orchioides Gaertn)

<400> 1

atggaagcat caaccaccac caccaccacc gggactcccc acatcctcat ggtctccttc 60

cccggccaag gccacatcaa ccccctcctc cgcttcgcca agcgcgtcgc cgccaagggc 120

gccctcgtca ccctctcctc cacccacgac atgggccacc gcatcttcca ctcctccaac 180

ctaacccccg ccgctcctat acctatcgga ctcggccacc tccgcttcga gttcttctcc 240

gacggctggc ccgtcgacga cccccgccgc aaggacctcg accccgtcat ggccaacctc 300

agctccgccg gcgccctcgc cctcgccgac ctcatccgcc tccaggccga ccagggccgc 360

cccgttgact gcgtggtcaa caaccccttc atcccctggg ccctcgacgt cgcctccgat 420

ctctccgtcc cctccgccgt cctctgggtc cagtcctgcg ccgtcttctc cacctactac 480

cactaccacc gcaagctcgt ccccttcccg acccgagaaa accctgacgt ccacgtcacc 540

ctccccggca tgccgactct actccccggc gacctcccga cgttcctgct cccgtcgaac 600

ccctacacgt cgttgaccga cgcgatcctt gcccagttcg agaacctcgc caaggcctcg 660

tgggtgttcg ccaactcgtt tctagagctc gagaaagacg ttatcgaagc cctgtccgac 720

gtgtggccgg tgatccccgt cggcccactg gtagacgctg gcggacagga gccgtcgtcg 780

gagataagga cggacctctg gaaggcggcc gatgactgca tggagtggct ggacgggcag 840

cagccggtgt ccgtcgtcta cgtgtctgtt ggcagcgtgg tcatattgac caaagaggag 900

gtggcgacga tggctgacgg gttgaagtcc accggccggc cgttcctgtg ggtcctacgg 960

gagaacttcc gggagctgtt gccggaggat tttgaaaagt caacggacgg gagagggaag 1020

gtggtggggt ggagcccgca ggagagggtg ctgggccacg tggcggtggg ttgcttcgtg 1080

acgcactgcg ggtggaactc gactctggag gcgctggcgg ccggagtggc ggtggtggcc 1140

tacccgcagt ggggggacca ggtgcccgac gccaagctgc tcgtcgacgg gctcggggtc 1200

ggtgctaggt tgagccaact cgcggagctg gcggcgagag tggaggaggt gatggccggg 1260

ccgagggcgg aggagatgcg gggcagggcg agggggtggc gagagaaggc gagggtggcg 1320

gtggctgacg gcgggtcgtc ggataagagg atacaagagt ttgtggacga ggtgagaaag 1380

aggatgcgta gtggggaata a 1401

<210> 2

<211> 466

<212> PRT

<213> 仙茅(Curculigo orchioides Gaertn)

<400> 2

Met Glu Ala Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Gly Thr Pro His Ile Leu

1 5 10 15

Met Val Ser Phe Pro Gly Gln Gly His Ile Asn Pro Leu Leu Arg Phe

20 25 30

Ala Lys Arg Val Ala Ala Lys Gly Ala Leu Val Thr Leu Ser Ser Thr

35 40 45

His Asp Met Gly His Arg Ile Phe His Ser Ser Asn Leu Thr Pro Ala

50 55 60

Ala Pro Ile Pro Ile Gly Leu Gly His Leu Arg Phe Glu Phe Phe Ser

65 70 75 80

Asp Gly Trp Pro Val Asp Asp Pro Arg Arg Lys Asp Leu Asp Pro Val

85 90 95

Met Ala Asn Leu Ser Ser Ala Gly Ala Leu Ala Leu Ala Asp Leu Ile

100 105 110

Arg Leu Gln Ala Asp Gln Gly Arg Pro Val Asp Cys Val Val Asn Asn

115 120 125

Pro Phe Ile Pro Trp Ala Leu Asp Val Ala Ser Asp Leu Ser Val Pro

130 135 140

Ser Ala Val Leu Trp Val Gln Ser Cys Ala Val Phe Ser Thr Tyr Tyr

145 150 155 160

His Tyr His Arg Lys Leu Val Pro Phe Pro Thr Arg Glu Asn Pro Asp

165 170 175

Val His Val Thr Leu Pro Gly Met Pro Thr Leu Leu Pro Gly Asp Leu

180 185 190

Pro Thr Phe Leu Leu Pro Ser Asn Pro Tyr Thr Ser Leu Thr Asp Ala

195 200 205

Ile Leu Ala Gln Phe Glu Asn Leu Ala Lys Ala Ser Trp Val Phe Ala

210 215 220

Asn Ser Phe Leu Glu Leu Glu Lys Asp Val Ile Glu Ala Leu Ser Asp

225 230 235 240

Val Trp Pro Val Ile Pro Val Gly Pro Leu Val Asp Ala Gly Gly Gln

245 250 255

Glu Pro Ser Ser Glu Ile Arg Thr Asp Leu Trp Lys Ala Ala Asp Asp

260 265 270

Cys Met Glu Trp Leu Asp Gly Gln Gln Pro Val Ser Val Val Tyr Val

275 280 285

Ser Val Gly Ser Val Val Ile Leu Thr Lys Glu Glu Val Ala Thr Met

290 295 300

Ala Asp Gly Leu Lys Ser Thr Gly Arg Pro Phe Leu Trp Val Leu Arg

305 310 315 320

Glu Asn Phe Arg Glu Leu Leu Pro Glu Asp Phe Glu Lys Ser Thr Asp

325 330 335

Gly Arg Gly Lys Val Val Gly Trp Ser Pro Gln Glu Arg Val Leu Gly

340 345 350

His Val Ala Val Gly Cys Phe Val Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr

355 360 365

Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Val Ala Val Val Ala Tyr Pro Gln Trp

370 375 380

Gly Asp Gln Val Pro Asp Ala Lys Leu Leu Val Asp Gly Leu Gly Val

385 390 395 400

Gly Ala Arg Leu Ser Gln Leu Ala Glu Leu Ala Ala Arg Val Glu Glu

405 410 415

Val Met Ala Gly Pro Arg Ala Glu Glu Met Arg Gly Arg Ala Arg Gly

420 425 430

Trp Arg Glu Lys Ala Arg Val Ala Val Ala Asp Gly Gly Ser Ser Asp

435 440 445

Lys Arg Ile Gln Glu Phe Val Asp Glu Val Arg Lys Arg Met Arg Ser

450 455 460

Gly Glu

465

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggaagcat caaccaccac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttattcccca ctacgcatcc 20

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cagcaaatgg gtcgcggatc catggaagca tcaaccacca c 41

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggtggtgct cgagtgcggc cgcttattcc ccactacgca tcc 43

Claims (10)

1.一种仙茅糖基转移酶Co84A-471基因，其特征在于，所述仙茅糖基转移酶Co84A-471基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种权利要求1所述的仙茅糖基转移酶Co84A-471基因编码的仙茅糖基转移酶。

3.一种权利要求1所述的仙茅糖基转移酶Co84A-471基因编码的仙茅糖基转移酶Co84A-471，其特征在于，所述仙茅糖基转移酶Co84A-471的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.一种含有权利要求1所述的仙茅糖基转移酶Co84A-471基因的重组质粒。

5.权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒通过将权利要求1所述的仙茅糖基转移酶Co84A-471基因与pET28a载体同源重组获得，命名为pET28a-UGTCo84A-471。

6.一种转基因工程菌，其特征在于，含有权利要求4或5所述的重组质粒，或所述基因工程菌的基因组中整合有外源的权利要求1所述的仙茅糖基转移酶Co84A-471基因。

7.如权利要求6所述的转基因工程菌，其特征在于，所述转基因工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

8.权利要求2所述的仙茅糖基转移酶或权利要求3所述的仙茅糖基转移酶Co84A-471在制备苔黑酚葡萄糖苷中的应用。

9.一种苔黑酚葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，包括：

以苔黑酚和糖基供体UDP-葡萄糖为原料，在权利要求2所述的仙茅糖基转移酶或权利要求3所述的仙茅糖基转移酶Co84A-471的催化下，生成苔黑酚葡萄糖苷。

10.一种克隆权利要求1所述的仙茅糖基转移酶Co84A-471基因的引物，其特征在于，所述引物由引物F和引物R组成，所述引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

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