CN113652413A - 一种细菌蛋白酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种细菌蛋白酶及其制备方法和应用，本发明所述的细菌蛋白酶为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)CSN423‑M，保藏编号为CCTCC No.M 2015024所产的胞外蛋白酶E423。采用发酵罐发酵工艺制备，包括斜面培养、种子培养和发酵罐发酵。利用本发明发酵培养基制备的发酵液提高了产酶量，缩短了产酶时间，且本发明的蛋白酶在胶原蛋白膨胀中，具有优异的效果。本发明为实现海洋菌蛋白酶的应用及胶原蛋白膨胀改性奠定了基础，具有巨大的经济效益和市场价值。

Description

一种细菌蛋白酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种细菌蛋白酶及其发酵罐发酵工艺和在胶原蛋白膨胀中的应用，属于微生物发酵和酶应用技术领域。
背景技术
胶原蛋白是动物体内含量最为丰富的蛋白质类型之一，是动物和鱼类皮、鳞、骨、腱、软骨等的最主要的组成成分。在动物加工的副产品中如皮、鳞、骨中富含大量胶原蛋白。海洋生物中也富含胶原，有些海洋鱼类鱼皮的胶原蛋白含量可高达80％以上。胶原蛋白具有结构稳定、致密性高、吸水保湿性能良好、免疫原性低、生物相容性强、可被人体吸收降解等特点，在食品加工、化妆品制造，以及生物医学等领域均有着重要的研究和应用价值。
①胶原蛋白在食品加工领域的应用。
胶原蛋白是一种重要的功能性营养食品，可作为食品添加剂增强肉类的嫩度，提高产品蛋白含量。胶原蛋白还被应用于食品薄膜材料的制备，如胶原肠衣、内包装膜等。胶原蛋白的水解产物明胶也是一种重要的食品加工原料，明胶熔点低，极易溶于热水，冷却后形成富有弹性的稳定形态，作为糖果添加剂广泛应用于橡皮糖、软糖、牛轧糖等糖果制备中。明胶在冷冻食品中的应用也十分广泛，可作为胶冻剂用于冷冻食品的肉质保护中。
②胶原蛋白在化妆品领域的应用
由于胶原蛋白优良的物理弹性及人体组织相容性，胶原蛋白被广泛应用于制备胶原注射液用以扩张填充人体软组织。胶原蛋白及其胶原水解产物含有大量羟基等亲水基团因此表现出极强的保水保湿性能，可应用于保水面膜，及各类精华液的制备。大量研究发现胶原蛋白水解肽具有极强的生物活性，如抗氧化活性、抗菌活性、抗衰老活性以及促进皮肤细胞生长等。
③胶原蛋白在生物医药领域的应用
胶原蛋白是哺乳动物细胞外基质的主要支撑成分，细胞依附锚定在基质胶原蛋白表面生长。已有研究证明，基质胶原蛋白能促进成纤维细胞迁移与增殖、有效诱导上皮细胞、成骨细胞的增殖分化，促进皮肤愈合及成骨再生等生物学特性。基于此，胶原蛋白广泛应用于制备如胶原填料、外科胶原敷料、胶原止血海绵、可吸收型手术缝合线等医用材料。另外，基于胶原纤维的稳定结构及生物相容性，胶原蛋白还可被利用于制备骨骼、脏腑器官及管状组织如气管等的支架材料。
尽管胶原蛋白在化妆品、医用材料如胶原面膜、胶原海绵、生物支架制备等方面具有良好应用前景，然而由于胶原蛋白存在结构较为致密、孔隙率低、单孔直径小、孔隙连通不理想、微孔结构与数量不符合细胞生长等问题，严重制约着化妆品、医用胶原材料开发应用。因此为获得孔结构更理想的胶原材料，必须开发新的方法或来对胶原蛋白进行改性、加工，以满足组织修复和细胞生长对胶原材料的要求。
发明内容
本发明从渤海湾潮间带筛选到一株假交替单胞菌Pseudoalteromonassp.CSN423，并通过紫外诱变获得了该菌的高产保外蛋白酶突变菌株Pseudoalteromonassp.CSN423-M，该菌于2015年1月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.M 2015024。该假交替单胞菌突变菌株CSN423-M培养96h后蛋白酶活力可以达到1461.33U/mL，较诱变出发菌株假交替单胞CSN423提高342％，可用于海洋蛋白酶的工业化生产。
胶原蛋白广泛应用于制备如胶原填料、外科胶原敷料、胶原止血海绵、可吸收型手术缝合线等医用材料。尽管胶原蛋白在化妆品、医用材料如胶原面膜、胶原海绵、生物支架制备等方面具有良好应用前景，但是由于胶原蛋白存在结构致密、孔隙率低、孔径小、孔隙连通不畅、不符合细胞生长等问题，影响了现有胶原化妆品、医用胶原材料开发应用。
本发明针对CSN423-M所产的蛋白酶发酵液进行了胶原蛋白膨胀实验，本发明发酵液即为Pseudoalteromonas sp.CSN423-M发酵液。研究表明，Pseudoalteromonassp.CSN423-M在不溶性牛腱I型胶原蛋白和猪皮为代表的胶原蛋白膨胀和吸附改性作用中都有着极好的应用前景。
本发明的首要目的是提供一种细菌蛋白酶E423，所述的细菌蛋白酶为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)CSN423-M(保藏编号为CCTCC No.M 2015024)所产的胞外蛋白酶。蛋白酶E423通过硫铵沉淀，离子交换、分子筛层析进行分离纯化，然后通过氮端测序确定氮端的氨基酸序列，然后依据氨基酸序列设计引物通过PCR获得该酶的基因序列，进一步翻译成氨基酸序列，该蛋白酶氨基酸序列如下：
MNLSKITIATLAAFTLVQATSAVAANKKYLNQQANINNSAQNGVSSVLMVSPDQLVGLEAGNELVVLKEIKSNNGDTTRRYQQVYNGLPVIGDTVSLTFNNNGQLKRAHGAAVYDISSDIETVTPKLNQKLAVAKGLQKSSAAIKSVGLEKHNEKSQLAIWVDEQGEAHLVYEVSYVTYGSNPSRPYQIIDANSGDVLFSFDNLQHADATGPGGNLKTGKYIYGTDFDSLNVSQTGNNCSMNTTNVKTINLNGGTSGSSAYSFTCPENTFKEINGAYSPLNDAHYFGNVIFNMYNDWIGTPPLSFQLQMRVHYSSNYENAFWDGSAMTFGDGQNTFYPLVSLDVSAHEVSHGFTEQNSGLVYSGKSGGLNEAFSDMAGEAAEFYMKGTNDWLVGKDIFKGNGALRYMNNPTQDGRSIDNQSSYSSGMDVHYSSGVFNKAFYNLATTSGWDTEKAFKVMARANQLYWTASTNWDLAGNGVMDAACDLNYDPSAVKAALSAVGVNSNLSSGSSCGTTTPPAEDEALSNGVTRTGISGSAKEQLFFTLDVPAGASNLVFNTNGGSGDADLYVRFGSKPTLSTYDCNSTTSTSTESCSIGSAQAGTYYVMVEAWQAISGVSLTGSYDGSTGGGVSPINRTESNVSVASGGWTRFTQNLDAGYSSLDISMAGGSGDADLYVNFGSASSTSSYECRPYKNGNVETCTIENPQAGTWYIDLQGYSAASGITLSISAN，见SEQ ID NO.1。
蛋白酶E423的P结构域(P-domain)氨基酸序列如下：
FFTLDVPAGASNLVFNTNGGSGDADLYVRFGSKPTLSTYDCNSTTSTSTESCSIGSAQAGTYYVMVEAWQAISGVSLTGSYDGSTGGGVSPINRTESNVSVASGGWTRFTQNLDAGYSSLDISMAGGSGDADLYVNFGSASSTSSYECRPYKNGNVETCTIENPQAGTWYIDLQGYSAASGITLSISAN，见SEQ ID NO.2。
蛋白酶E423与GST蛋白融合表达的P端结构域的结构模式图和电泳图见图1。
本发明的第二个目的是提供所述的细菌蛋白酶E423的制备方法，所述的细菌蛋白酶E423采用假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)CSN423-M发酵制备；优选：发酵培养基按质量百分数计包含以下组分组成：玉米粉1.40-1.45％、豆粉3.60-3.65％、酪素1.8-2.1％、CaCl2 0.13-0.18％、K2HPO4 0.2-0.4％、KH2PO4 0.08-0.14％，水补足，NaOH调pH为7.5-8.0；
进一步优选：玉米粉1.41％、豆粉3.62％、酪素2％、CaCl2 0.16％、K2HPO4 0.3％、KH2PO4 0.1％，水补足，NaOH调pH为8.0。
进一步地，所述的制备方法，将发酵种子按发酵培养基体积的4-10％接入发酵罐中，发酵罐参数：罐温15-25℃、罐压0.03-0.05MPa，搅拌速率380-420rpm，通气比为1:1.0-1：1.5，发酵时间为72-96h；优选：罐温18-22℃、罐压0.04MPa，搅拌速率400rpm，通气比为1:1.0，发酵时间为72h。
进一步地，所述的制备方法，先采用人工海水代替蒸馏水配制的培养基进行斜面培养和种子培养，最后采用发酵罐培养
(1)斜面培养
采用划线法将CSN423-M接种到2216E固体斜面培养基上，16～22℃培养24-48h得到复壮菌体；2216E固体斜面培养基：蛋白胨5g，酵母粉1g，Fe2(PO4)30.01g，加人工海水至1000ml，pH 8.0，琼脂粉15g，高压蒸汽灭菌；
(2)种子培养
将步骤(1)中的复壮菌体接种到人工海水LB液体种子培养基中，16～22℃，160-200rpm培养16-20h，得到发酵种子；
人工海水LB液体种子培养基：蛋白胨1％、酵母粉0.5％、NaCl 1％，人工海水补足，NaOH调pH为8.0。
人工海水配方：NaCl 28.15g,MgSO4·7H2O 6.92g,KCl 0.67g,MgCl·6H2O 5.51g,CaCl·H2O 1.45g,加ddH2O至1000ml。
本发明的第三个目的是提供所述的细菌蛋白酶E423在胶原蛋白膨胀中的应用。
进一步地，所述的胶原蛋白包括：不溶性牛腱I型胶原蛋白或者猪皮胶原蛋白。
进一步地，胶原蛋白膨胀时，将不溶性牛腱I型胶原蛋白加入缓冲液和细菌蛋白酶E423处理，猪皮直接加入细菌蛋白酶E423处理；进一步地，细菌蛋白酶E423是将发酵好的酶液8000-12,000×g,10-20min离心得到。
进一步地，不溶性牛腱I型胶原蛋白膨胀：
称取0.5-2％(w/v)不溶性牛腱I型胶原蛋白加入到PBS缓冲液中，PBS缓冲液浓度20-50mM，pH 7.4，随后加入5-15％的发酵制备的蛋白酶E423酶液，反应总体系中酶活力100-200U/ml，在30-40℃孵育1-5h。
进一步地，猪皮胶原蛋白膨胀：
取猪皮切割为1-2cm×1-2cm的小块，浸泡于发酵制备的蛋白酶E423酶液中，酶活力为100-300U/ml，20-30℃温浴3-7h，用无菌水清洗2-5次。
本发明所述的应用，还包括将所述的细菌蛋白酶E423与胶原蛋白、复合多糖一起反应，制备胶原蛋白-复合多糖复合海绵。
所述的胶原蛋白-复合多糖复合海绵的制备包括以下步骤：
(1)复合多糖原液的配制：蒸馏水配制1.5-2.5％的复合多糖原液；
(2)胶原蛋白原液获得：酸提取猪胶原蛋白得到的胶原液，浓度为20-40g/L；
(3)胶原蛋白-复合多糖复合海绵的制备：取胶原蛋白原液∶复合多糖原液∶10-15％戊二醛溶液＝3-5∶1∶1，然后加入5％-15％发酵制备的蛋白酶E423酶液，反应总体系中酶活力范围100-200U/ml，混合均匀后倒入模具，经过脱泡、固定成模、预冷、冷冻干燥获得改性胶原蛋白-多糖复合海绵。
进一步地，上述步骤(3)胶原蛋白原液、复合多糖原液、10-15％戊二醛溶液和发酵制备的蛋白酶E423酶液混合均匀后倒入塑料模具并置于4-8℃冰箱静置过夜脱泡，-10—-20℃固定成模后转入-80℃超低温冰箱预冷2-3h，然后再放在-50～-40℃冷冻干燥过夜获得改性胶原蛋白-多糖复合海绵。
本发明所述的不溶性牛腱I型胶原蛋白购自Worthington Biochemical Co.美国不溶性牛腱I型胶原蛋白(code:M3809)。
本发明具有以下优点和创新性：
本发明建立了发酵罐生产蛋白酶E423的发酵工艺，是海洋菌高产蛋白酶菌株的发酵应用，具有优异的效果。在发酵罐发酵工艺的基础上，本发明进一步建立了酶法胶原膨胀的处理工艺，利用发酵罐生产的海洋蛋白酶E423的发酵工艺制备的发酵液，处理不溶性牛腱I型胶原蛋白和富含胶原的猪皮等原料，对胶原蛋白进行改性，并在此基础上研发改性胶原蛋白海绵，获得结构较为疏松、孔隙率高、单孔直径较大、孔隙连通理想的改性胶原产品。综上，本发明为实现胶原改性蛋白酶E423的工业化应用奠定了基础，为市售胶原蛋白产品的改性，品质提高提供了新的技术和方法，具有巨大的经济效益和市场价值。
附图说明
图1蛋白酶E423与GST蛋白融合表达的P端结构域的结构模式图和电泳图；
其中：蛋白酶E423(泳道1，2)与GST蛋白融合表达的P结构域(泳道3)结构模式图和电泳图。
图2本发明发酵液对不溶性牛腱I型胶原蛋白膨胀图，以及其他对照处理；
其中：上图：E423作用不同时间，胶原的膨胀情况；下图：不同处理的胶原膨胀比较，1.PBS；2.胰蛋白酶；3.尿素；4.E423；5.P-domain。
图3常见的胶原蛋白酶完全降解不溶性牛腱I型胶原蛋白；
其中包括：市售胶原蛋白酶CollagenaseI，其它细菌发酵产生的胶原蛋白酶JN2,QS2-3。
图4本发明发酵液膨胀不溶性牛腱I型胶原蛋白扫描电镜观察。
图5本发明发酵液和对照处理对猪皮膨胀效果图；
其中EmpA是鳗弧菌所产的胞外蛋白酶。
图6本发明发酵液制备改性胶原蛋白海绵；
其中胶原-复合多糖不同浓度配比1：1-5：1。
图7本发明发酵液和对照处理制备的改性胶原海绵空间结构电镜观察图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1一种胶原蛋白改性蛋白酶降解菌的发酵罐发酵工艺
菌株Pseudoalteromonas sp.CSN423-M利用上述发酵培养基进行发酵罐发酵，具体步骤如下：
(1)斜面培养
采用划线法将Pseudoalteromonas sp.CSN423-M接种到2216E固体斜面培养基上，20℃培养24h得到复壮菌体；
2216E固体斜面培养基(按质量百分数计)：蛋白胨5g，酵母1g，Fe2(PO4)3 0.01g，人工海水1000mL，pH8.0，琼脂粉15g，高压蒸汽灭菌；
(2)种子培养
将步骤(1)中的复壮菌体接种到人工海水LB液体种子培养基中，20℃，200rpm培养20h，得到发酵种子；
人工海水LB液体种子培养基：蛋白胨1％、酵母粉0.5％、NaCl 1％，人工海水补足1000mL，NaOH调pH为8.0。
人工海水配方：NaCl 28.15g,MgSO4·7H2O 6.92g,KCl 0.67g,MgCl·6H2O 5.51g,CaCl·H2O 1.45g,加ddH2O至1000ml。
(3)发酵罐发酵
将步骤(2)获得的发酵种子按发酵培养基体积的6％接入5L发酵罐中，发酵罐参数：罐温20℃、罐压0.04MPa，搅拌速率300-400rpm，通气比为1:1.0，发酵时间为72h。
发酵培养基(按质量百分数计)为：
玉米粉1.41％、豆粉3.62％、酪素2％、CaCl2 0.16％、K2HPO4 0.3％、KH2PO4 0.1％，水补足1000mL，NaOH调pH为8.0。
实施例2获得的胶原改性蛋白酶发酵液在不溶性牛腱I型胶原蛋白膨胀中的应用。
本发明发酵液酶法膨胀胶原蛋白及对照检测条件如下：
(1)菌CSN423-M发酵的蛋白酶液及对照对不溶性牛腱I型胶原蛋白的膨胀检测：
使用数码相机(Canon)拍摄。根据图片中胶原蛋白的膨胀面积，使用ImageJ 1.46软件(NIH，美国)确定胶原蛋白膨胀度。
称取1％(w/v)不溶性牛腱I型胶原蛋白加入到PBS缓冲液(20mM，pH 7.4)中，随后加入10％的发酵制备的蛋白酶E423酶液(总体系中酶活力150U/ml)；同时设置以下三组对照实验：
A、37℃孵育1-5h后，观察不同实验组的胶原蛋白体积变化，单独的PBS缓冲液为空白对照。实验发现随着时间的延长，蛋白酶E423的胶原膨胀能力越强(图2)。
B、以单独的PBS缓冲液为空白对照，其它对照组分别加入10％的异源表达纯化的蛋白酶的P端结构域(0.15μM)(利用pGEX4T-1载体进行异源表达)(图1)，6M尿素(已知的胶原膨胀剂，膨胀对照实验组)，胰蛋白酶(酶活力150U/ml)，
实验发现，本发明胶原改性蛋白酶E423具有明显的胶原膨胀作用，膨胀程度是尿素处理的3-7倍，PBS缓冲液或胰蛋白酶对胶原蛋白无膨胀作用(图2)。
C、加入市售I型胶原蛋白酶(体系中酶活力150U/ml)，或加入其它细菌发酵产生的胶原蛋白酶JN2或QS2-3(体系中酶活力150U/ml)，
实验发现，常见的胶原蛋白酶如来源于梭菌属的I型胶原蛋白酶、来源于海洋弧菌的胶原蛋白酶JN2和QS2-3均能将胶原完全降解，而不会发生膨胀胶原的现象(图3)。
通过扫描电子显微镜SEM观察了由蛋白酶E423及其P端结构域膨胀引起的胶原纤维结构变化。SEM结果表明，经蛋白酶E423膨胀处理的胶原蛋白排列成松散的网状结构(图4)。
实施例3发酵的胶原改性蛋白酶液及P端结构域在猪皮的膨胀中的应用
猪皮富含胶原蛋白，发酵的胶原改性蛋白酶液同样对猪皮有较好的膨胀作用，取猪皮切割为1.5cm×1.5cm小块，分别浸泡于胶原改性蛋白酶E423溶液(酶活为200U/ml)、异源表达纯化的E423的P端结构域(P-domain)溶液(0.15μM)和来自于鳗弧菌的蛋白酶EmpA中(酶活为300U/ml),25℃温浴5h，用无菌水清洗3-5次。对照组使用PBS缓冲液代替蛋白酶溶液，其他步骤相同。
与PBS对照组相比，经蛋白酶E423、E423的P-domain和EmpA处理的新鲜猪皮具有较为明显的膨胀现象以及更加松软的结构质地(图5)，将处理后的猪皮自然干燥3-5h，观察发现，对照组PBS处理的猪皮出现明显干燥变硬、边缘透明，而经胶原改性蛋白酶E423、P端结构域及鳗弧菌蛋白酶EmpA处理的猪皮颜色和质地均明显优于对照组，其中蛋白酶E423处理的猪皮效果最好，表明经蛋白酶E423处理的猪皮其保湿保水性能明显提升(图5)。
实施例4改性胶原蛋白复合海绵的制备
蒸馏水配制2％的复合多糖原液。胶原蛋白原液采用酸提取猪胶原蛋白得到的胶原液，30g/L猪胶原蛋白溶液；取猪胶原蛋白原液∶复合多糖原液∶15％戊二醛溶液等于1～5∶1∶1，然后加入10％本发明制备的蛋白酶液E423(活力为150U/ml，加入体系后)，在漩涡振荡器上混合均匀后倒入塑料模具(液面高4mm)并置于4℃冰箱静置过夜脱泡，-20℃固定成模后转入-80℃超低温冰箱预冷2h，然后再放在冻干机中在-50～-40℃冷冻干燥，冷冻干燥过夜获得不同原料比例的改性胶原蛋白-多糖复合海绵。
结合改性胶原海绵实物性状(图6)，胶原-复合多糖不同浓度配比，所获得的胶原海绵性状有所不同(胶原原液与复合多糖原液的比例)。经过胶原改性蛋白酶E423、P端结构域处理的胶原海绵在保水率上有较大提升。通过电镜观察改性胶原海绵空间结构，可以发现经过蛋白酶E423或P端结构域处理的改性胶原海绵相较于PBS对照组的海绵具有更多的孔隙和更大的空间接触面积(图7)，预计当将其应用到临床之后，可以显著提升胶原海绵的药物承载力，并为细胞生长提供大量的附着点，从而提升创口愈合效果。
本发明实施例中所有的蛋白酶酶活均是以常规的水解酪蛋白法进行测定。
序列表
<110> 中南大学
<120> 一种细菌蛋白酶及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 730
<212> PRT
<213> 假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)
<400> 1
Met Asn Leu Ser Lys Ile Thr Ile Ala Thr Leu Ala Ala Phe Thr Leu
1 5 10 15
Val Gln Ala Thr Ser Ala Val Ala Ala Asn Lys Lys Tyr Leu Asn Gln
20 25 30
Gln Ala Asn Ile Asn Asn Ser Ala Gln Asn Gly Val Ser Ser Val Leu
35 40 45
Met Val Ser Pro Asp Gln Leu Val Gly Leu Glu Ala Gly Asn Glu Leu
50 55 60
Val Val Leu Lys Glu Ile Lys Ser Asn Asn Gly Asp Thr Thr Arg Arg
65 70 75 80
Tyr Gln Gln Val Tyr Asn Gly Leu Pro Val Ile Gly Asp Thr Val Ser
85 90 95
Leu Thr Phe Asn Asn Asn Gly Gln Leu Lys Arg Ala His Gly Ala Ala
100 105 110
Val Tyr Asp Ile Ser Ser Asp Ile Glu Thr Val Thr Pro Lys Leu Asn
115 120 125
Gln Lys Leu Ala Val Ala Lys Gly Leu Gln Lys Ser Ser Ala Ala Ile
130 135 140
Lys Ser Val Gly Leu Glu Lys His Asn Glu Lys Ser Gln Leu Ala Ile
145 150 155 160
Trp Val Asp Glu Gln Gly Glu Ala His Leu Val Tyr Glu Val Ser Tyr
165 170 175
Val Thr Tyr Gly Ser Asn Pro Ser Arg Pro Tyr Gln Ile Ile Asp Ala
180 185 190
Asn Ser Gly Asp Val Leu Phe Ser Phe Asp Asn Leu Gln His Ala Asp
195 200 205
Ala Thr Gly Pro Gly Gly Asn Leu Lys Thr Gly Lys Tyr Ile Tyr Gly
210 215 220
Thr Asp Phe Asp Ser Leu Asn Val Ser Gln Thr Gly Asn Asn Cys Ser
225 230 235 240
Met Asn Thr Thr Asn Val Lys Thr Ile Asn Leu Asn Gly Gly Thr Ser
245 250 255
Gly Ser Ser Ala Tyr Ser Phe Thr Cys Pro Glu Asn Thr Phe Lys Glu
260 265 270
Ile Asn Gly Ala Tyr Ser Pro Leu Asn Asp Ala His Tyr Phe Gly Asn
275 280 285
Val Ile Phe Asn Met Tyr Asn Asp Trp Ile Gly Thr Pro Pro Leu Ser
290 295 300
Phe Gln Leu Gln Met Arg Val His Tyr Ser Ser Asn Tyr Glu Asn Ala
305 310 315 320
Phe Trp Asp Gly Ser Ala Met Thr Phe Gly Asp Gly Gln Asn Thr Phe
325 330 335
Tyr Pro Leu Val Ser Leu Asp Val Ser Ala His Glu Val Ser His Gly
340 345 350
Phe Thr Glu Gln Asn Ser Gly Leu Val Tyr Ser Gly Lys Ser Gly Gly
355 360 365
Leu Asn Glu Ala Phe Ser Asp Met Ala Gly Glu Ala Ala Glu Phe Tyr
370 375 380
Met Lys Gly Thr Asn Asp Trp Leu Val Gly Lys Asp Ile Phe Lys Gly
385 390 395 400
Asn Gly Ala Leu Arg Tyr Met Asn Asn Pro Thr Gln Asp Gly Arg Ser
405 410 415
Ile Asp Asn Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Gly Met Asp Val His Tyr Ser
420 425 430
Ser Gly Val Phe Asn Lys Ala Phe Tyr Asn Leu Ala Thr Thr Ser Gly
435 440 445
Trp Asp Thr Glu Lys Ala Phe Lys Val Met Ala Arg Ala Asn Gln Leu
450 455 460
Tyr Trp Thr Ala Ser Thr Asn Trp Asp Leu Ala Gly Asn Gly Val Met
465 470 475 480
Asp Ala Ala Cys Asp Leu Asn Tyr Asp Pro Ser Ala Val Lys Ala Ala
485 490 495
Leu Ser Ala Val Gly Val Asn Ser Asn Leu Ser Ser Gly Ser Ser Cys
500 505 510
Gly Thr Thr Thr Pro Pro Ala Glu Asp Glu Ala Leu Ser Asn Gly Val
515 520 525
Thr Arg Thr Gly Ile Ser Gly Ser Ala Lys Glu Gln Leu Phe Phe Thr
530 535 540
Leu Asp Val Pro Ala Gly Ala Ser Asn Leu Val Phe Asn Thr Asn Gly
545 550 555 560
Gly Ser Gly Asp Ala Asp Leu Tyr Val Arg Phe Gly Ser Lys Pro Thr
565 570 575
Leu Ser Thr Tyr Asp Cys Asn Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Glu Ser
580 585 590
Cys Ser Ile Gly Ser Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Tyr Val Met Val Glu
595 600 605
Ala Trp Gln Ala Ile Ser Gly Val Ser Leu Thr Gly Ser Tyr Asp Gly
610 615 620
Ser Thr Gly Gly Gly Val Ser Pro Ile Asn Arg Thr Glu Ser Asn Val
625 630 635 640
Ser Val Ala Ser Gly Gly Trp Thr Arg Phe Thr Gln Asn Leu Asp Ala
645 650 655
Gly Tyr Ser Ser Leu Asp Ile Ser Met Ala Gly Gly Ser Gly Asp Ala
660 665 670
Asp Leu Tyr Val Asn Phe Gly Ser Ala Ser Ser Thr Ser Ser Tyr Glu
675 680 685
Cys Arg Pro Tyr Lys Asn Gly Asn Val Glu Thr Cys Thr Ile Glu Asn
690 695 700
Pro Gln Ala Gly Thr Trp Tyr Ile Asp Leu Gln Gly Tyr Ser Ala Ala
705 710 715 720
Ser Gly Ile Thr Leu Ser Ile Ser Ala Asn
725 730
<210> 2
<211> 189
<212> PRT
<213> 假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)
<400> 2
Phe Phe Thr Leu Asp Val Pro Ala Gly Ala Ser Asn Leu Val Phe Asn
1 5 10 15
Thr Asn Gly Gly Ser Gly Asp Ala Asp Leu Tyr Val Arg Phe Gly Ser
20 25 30
Lys Pro Thr Leu Ser Thr Tyr Asp Cys Asn Ser Thr Thr Ser Thr Ser
35 40 45
Thr Glu Ser Cys Ser Ile Gly Ser Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Tyr Val
50 55 60
Met Val Glu Ala Trp Gln Ala Ile Ser Gly Val Ser Leu Thr Gly Ser
65 70 75 80
Tyr Asp Gly Ser Thr Gly Gly Gly Val Ser Pro Ile Asn Arg Thr Glu
85 90 95
Ser Asn Val Ser Val Ala Ser Gly Gly Trp Thr Arg Phe Thr Gln Asn
100 105 110
Leu Asp Ala Gly Tyr Ser Ser Leu Asp Ile Ser Met Ala Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Asp Ala Asp Leu Tyr Val Asn Phe Gly Ser Ala Ser Ser Thr Ser
130 135 140
Ser Tyr Glu Cys Arg Pro Tyr Lys Asn Gly Asn Val Glu Thr Cys Thr
145 150 155 160
Ile Glu Asn Pro Gln Ala Gly Thr Trp Tyr Ile Asp Leu Gln Gly Tyr
165 170 175
Ser Ala Ala Ser Gly Ile Thr Leu Ser Ile Ser Ala Asn
180 185

Claims (10)

1.一种细菌蛋白酶E423，其特征在于，所述的细菌蛋白酶为保藏编号CCTCCNo.M2015024的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)CSN423-M所产的胞外蛋白酶E423。
2.权利要求1所述的细菌蛋白酶E423的制备方法，其特征在于，所述的细菌蛋白酶E423采用假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)CSN423-M发酵制备；优选：发酵培养基按质量百分数计包含以下组分组成：玉米粉1.40-1.45％、豆粉3.60-3.65％、酪素1.8-2.1％、CaCl2 0.13-0.18％、K2HPO4 0.2-0.4％、KH2PO4 0.08-0.14％，水补足，NaOH调pH为7.5-8.0；
进一步优选：玉米粉1.41％、豆粉3.62％、酪素2％、CaCl2 0.16％、K2HPO4 0.3％、KH2PO40.1％，水补足，NaOH调pH为8.0。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将发酵种子按发酵培养基体积的4-10％接入发酵罐中，发酵罐参数：罐温15-25℃、罐压0.03-0.05MPa，搅拌速率380-420rpm，通气比为1：1.0-1：1.5，发酵时间为72-96h；优选：罐温18-22℃、罐压0.04MPa，搅拌速率400rpm，通气比为1:1.0，发酵时间为72h。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，先采用人工海水代替蒸馏水配制的培养基进行斜面培养和种子培养，最后采用发酵罐培养；优选：
(1)斜面培养
采用划线法将CSN423-M接种到2216E固体斜面培养基上，16～22℃培养24-48h得到复壮菌体；2216E固体斜面培养基：蛋白胨5g，酵母粉1g，Fe2(PO4)30.01g，加人工海水至1000ml，pH 8.0，琼脂粉15g，高压蒸汽灭菌；
(2)种子培养
将步骤(1)中的复壮菌体接种到人工海水LB液体种子培养基中，16～22℃，160-200rpm培养16-20h，得到发酵种子；
人工海水LB液体种子培养基：蛋白胨1％、酵母粉0.5％、NaCl 1％，人工海水补足，NaOH调pH为8.0。
5.权利要求1所述的细菌蛋白酶E423，或者权利要求2-4任一项制备方法制备的细菌蛋白酶E423在胶原蛋白膨胀中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的胶原蛋白包括：不溶性牛腱I型胶原蛋白或者猪皮胶原蛋白。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，胶原蛋白膨胀时，将不溶性牛腱I型胶原蛋白加入缓冲液和细菌蛋白酶E423处理，猪皮直接加入细菌蛋白酶E423处理；进一步地，细菌蛋白酶E423是将发酵好的酶液8000-12,000×g,10-20min离心得到。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，
不溶性牛腱I型胶原蛋白膨胀：
称取0.5-2％(w/v)不溶性牛腱I型胶原蛋白加入到PBS缓冲液中，PBS缓冲液浓度20-50mM，pH 7.4，随后加入5-15％的发酵制备的蛋白酶E423酶液，反应总体系中酶活力100-200U/ml，在30-40℃孵育1-5h。
猪皮胶原蛋白膨胀：
取猪皮切割为1-2cm×1-2cm的小块，浸泡于发酵制备的蛋白酶E423酶液中，酶活力为100-300U/ml，20-30℃温浴3-7h，用无菌水清洗2-5次。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，还包括将所述的细菌蛋白酶E423与胶原蛋白、复合多糖一起反应，制备胶原蛋白-复合多糖复合海绵。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，胶原蛋白-复合多糖复合海绵的制备包括以下步骤：
(1)复合多糖原液的配制：蒸馏水配制1.5-2.5％的复合多糖原液；
(2)胶原蛋白原液获得：酸提取猪胶原蛋白得到的胶原液，浓度为20-40g/L；
(3)胶原蛋白-复合多糖复合海绵的制备：取胶原蛋白原液∶复合多糖原液∶10-15％戊二醛溶液＝3-5∶1∶1，然后加入5％-15％发酵制备的蛋白酶E423酶液，反应总体系中酶活力范围100-200U/ml，混合均匀后倒入模具，经过脱泡、固定成模、预冷、冷冻干燥获得改性胶原蛋白-多糖复合海绵。
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