CN113637696A - 一种用于pviii蛋白展示外源肽的噬菌粒载体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体及其构建方法，属于DNA重组技术领域。本发明公开的一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体，通过将丝状噬菌体PVIII基因定向克隆到原核表达载体pKK223‑3的多克隆位点上制备得到。本发明制备的噬菌粒载体pKK8在展示外源肽方面具有操作简单、可用于相对较长外源多肽的展示等优点，降低噬菌体展示技术的操作要求，可进一步推动噬菌体展示技术在医学、生物学、材料学等学科的交叉应用研究。

Description

一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体及其构建方法

技术领域

本发明涉及DNA重组技术领域，更具体的说是涉及一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体及其构建方法。

背景技术

噬菌体展示技术是在基因水平上，以噬菌体载体或噬菌粒载体为模板，将编码外源肽的基因序列定向插入到外壳蛋白基因中，进而使外源多肽展示在噬菌体外壳蛋白上。1985年，Smith首次在Science上报道了将核酸内切酶基因克隆到丝状噬菌体的外壳蛋白基因III中，并成功将酶分子展示在噬菌体的PIII蛋白上，之后该技术迅速发展并广泛应用到各个领域中，并获得2018年诺贝尔化学奖。

丝状噬菌体展示技术主要与两种外壳蛋白有关，一种是由基因III编码的PIII蛋白，位于噬菌体的尾端，5个拷贝，该外壳蛋白最突出的优点是对展示的外源肽的大小无严格限制，但拷贝数相对较少，常用于抗体库的构建等方面；另一种是由基因VIII编码的PVIII蛋白，位于噬菌体的背部，大约有2700个拷贝，该展示系统能够以多价的形式将外源肽展示在噬菌体的表面，在无佐剂辅助的情况下刺激机体针对展示的外源肽产生强烈的免疫应答反应，但该系统对展示的外源肽的大小有限制。

噬菌体载体是直接以噬菌体的基因组为模板而构建的载体，通过将外源肽定向插入到噬菌体的PIII或PVIII基因中，进而使外源肽展示在噬菌体的表面，但噬菌体载体在制备纯化方面相对较繁琐，且产量较低，对操作要求相对较高。同时对于PVIII展示系统，由于VIII蛋白只有50个氨基酸，直接利用噬菌体基因组进行展示通常只能插入较短的肽(一般不宜超过6个氨基酸)，否则会影响噬菌体的组装，降低噬菌体的侵染能力。

因此，提供一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体及其构建方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体及其构建方法，制备的噬菌粒载体pKK8在展示外源肽方面具有操作简单、可用于相对较长外源多肽的展示等优点，能够进一步拓宽噬菌体展示技术应用范围。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体，将丝状噬菌体PVIII基因定向克隆到原核表达载体pKK223-3的多克隆位点上，制备得到噬菌粒载体pKK8。

进一步，一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体的构建方法，具体步骤如下：

(1)将原核表达载体pKK223-3用EcoR I和HindIII进行双酶切，获得酶切后的载体pKK223-3；

(2)以载体fADL-le为模板，利用引物PF1/PR1 PCR扩增PVIII基因；并用EcoR I和HindIII进行双酶切，获得酶切后的PVIII基因目的片段；

(3)将步骤(1)获得的酶切后的载体pKK223-3与步骤(2)获得的酶切后的PVIII基因目的片段进行连接，转化，筛选阳性克隆，获得噬菌粒载体pKK8。

进一步，步骤(2)所述引物PF1/PR1的引物序列如下：

PF1：5’-TTCCGGAATTCGTAGTGGCATTACG-3’；SEQ ID NO.2；

PR1：5’-ACGGCAAGCTTCTGTATGAGGTTTT-3’；SEQ ID NO.3。

进一步，步骤(2)所述PCR扩增的反应体系如下：载体fADL-le 1μl，PF11μl，PR11μl，Premix Ex Taq Hot StartVersion 10μl，灭菌水7μl。

进一步，步骤(2)所述PCR扩增的反应程序如下：94℃预变性8min；94℃30s，56℃40s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。

进一步，所述的噬菌粒载体pKK8在展示外源多肽中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体及其构建方法，本发明制备的噬菌粒载体pKK8在展示外源肽方面具有操作简单、可用于相对较长外源多肽的展示等优点，降低噬菌体展示技术的操作要求，可进一步推动噬菌体展示技术在医学、生物学、材料学等学科的交叉应用研究。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明原核表达载体pKK223-3的图谱；

图2附图为本发明载体pKK223-3双酶切结果；

其中，1：Marker；2：pKK223-3；3：经EcoR I和HindIII双酶切的pKK223-3；

图3附图为本发明噬菌体载体fADL-le的图谱；

图4附图为本发明PCR扩增噬菌体PVIII基因结果；

其中，1：Marker；2：含有PVIII基因的目的片段；

图5附图为本发明PCR验证噬菌粒载体pKK8阳性克隆；

其中，1：Marker；2：阳性克隆；

图6附图为本发明噬菌粒载体pKK8的图谱；

图7附图为本发明载体pKK8-MP部分测序峰图；第760-783为编码目标多肽的核苷酸序列；

图8附图为本发明Western-blot分析phage-MP；

其中，1：Marker；2-3：辅助噬菌体M13K07与P53多克隆抗体杂交(阴性对照)；4-5：phage-MP与P53多克隆抗体杂交；

图9附图为本发明AFM观察噬菌体phage-MP。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

将噬菌体载体fADL-1e(购自Antibody Design laboratories，Catalog number：PD020)的PVIII基因定向克隆到原核表达载体pKK223-3多克隆位点EcoR I和HindIII之间，制备出一种可用PVIII蛋白展示外源肽的新型噬菌粒载体pKK8，其核苷酸序列如下：

TTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAATATTTGCCAGAACCGTTATGATGTCGGCGCAAAAAACATTATCCAGAACGGGAGTGCGCCTTGAGCGACACGAATTATGCAGTGATTTACGACCTGCACAGCCATACCACAGCTTCCGATGGCTGCCTGACGCCAGAAGCATTGGTGCACCGTGCAGTCGATAAGCCCGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCACTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAATTGGAGCCAATCAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCATCTCGGGCAGCGTTGGGTCCTGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTTGCCTTACTGGTTAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAAACGTCTGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAAACGCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACCCTGTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATTTTTCTCTGGTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGTTCCAGTAACCGGGCATGTTCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTCATCGGTATCATTACCCCCATGAACAGAAATCCCCCTTACACGGAGGCATCAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTCAGGATGGCCTTCTGCTTAATTTGATGCCTGGCAGTTTATGGCGGGCGTCCTGCCCGCCACCCTCCGGGCCGTTGCTTCGCAACGTTCAAATCCGCTCCCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCATGGGGAGACCCCACACTACCATCGGCGCTACGGCGTTTCACTTCTGAGTTCGGCATGGGGTCAGGTGGGACCACCGCGCTACTGCCGCCAGGCAAATTCTGTTTTATCAGACCGCTTCTGCGTTCTGATTTAATCTGTATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTTCTGTATGAGGTTTTGCTAAACAACTTTCAACAGTTTCGGCTTCTAGAGACAGGCCTCCCGGGCCACTAGTTACATGGCCGGCTGGGCCGCGAGTAATAACAATCCAGCGGCCGCCGTAGGCAATAGGTATTTCATGATTTGCCCTCGTTAGTCGACAAAAAAAAGGCTCCAAAAGGAGCCTTTAATTGTATCGGTTTATCAGCTTGCTTTCGAGGTGAATTTCTTAAACAGCTTGATACCGATAGTTGCGCCGACAATGACAACAACCATCGCCCACGCATAACCGATATATTCGGTCGCTGAGGCTTGCAGGGAGTTAAAGGCCGCTTTTGCGGGATCGTCACCCTCAGCAGCGAAAGACAGCATCGGAACGAG GGTAGCAACGGCTACGGAGGCTTTGAGGACTAAAGACTTTTTCATGAGGAAGTTTCCATTAAACGGGTAAAATACGTAATGCCACTACGAA；SEQIDNO.1。

其中，加粗部分(核苷酸序列4558-5020)是载体fADL-1e克隆到pKK223-3的序列，加粗加下划线部分(核苷酸序列4909-4977)是编码PVIII蛋白的信号肽的反向互补序列，加粗斜体部分(核苷酸序列4759-4908)是编码PVIII蛋白的反向互补核苷酸序列。

噬菌粒载体pKK8的制备步骤如下：

(一)原核表达载体pKK223-3的提取、酶切及回收

1)原核表达载体pKK223-3(载体图谱见图1)的提取

利用Axygen的质粒小量提取试剂盒提取质粒，商业化的原核表达载体pKK223-3(购自武汉淼灵生物科技有限公司，产品号：P0084)，具体步骤如下：

(1)取5ml在LB培养基中过夜培养的转化有载体pKK223-3的菌液DH5α，12000×g离心1min，弃尽上清；

(2)加250μl Buffer S1，悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；

(3)加250μl Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液；

(4)加350μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转6-8次，12000×g离心10min；

(5)吸取步骤(4)中离心后的上清，并转移到制备管中，12000×g离心1min，弃滤液；

(6)将制备管放回离心管，加500μl BufferW1，12000×g离心1min，弃滤液；

(7)将制备管放回离心管，加700μl BufferW2，12000×g离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700μl BufferW2洗涤一次，弃滤液；

(8)将制备管放回2ml离心管，12000×g离心1min；

(9)将制备管移入到新的1.5ml离心管中，在制备管的膜中央加50μlEluent溶液，室温静置1min，12000×g离心1min。

2)酶切pKK223-3

用EcoR I(Takara，货号：1611)和HindIII(Takara，货号：1615)双酶切载体pKK223-3，具体酶切反应体系如下：

酶切反应条件为37℃水浴2h。载体pKK223-3双酶切结果见图2；pKK223-3载体主要以环状和线状的形式存在，酶切后均变为线性，初步证明酶切成功。

3)酶切载体的回收

对琼脂糖凝胶电泳证明酶切完全的载体进行切胶回收，按照DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN，Cat.No.AP-GX-50)的说明进行操作，具体如下：

(1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积；

(2)加入3个凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合，直至凝胶完全融化；

(3)加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B，混合均匀；

(4)吸取步骤(3)中的混合液，转移到DNA制备管中，12000×g离心1min，弃滤液；

(5)将制备管放回2ml离心管，加入500μl BufferW1，12000×g离心1min，弃滤液；

(6)将制备管放回离心管，加700μl BufferW2，12000×g离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700μl BufferW2洗涤一次，弃滤液；

(7)将制备管放回2ml离心管，12000×g离心1min；

(8)将制备管移入到新的1.5ml离心管中，在制备管的膜中央加10μlEluent溶液，室温静置1min，12000×g离心1min。

(二)PVIII基因的扩增、酶切及回收

(1)PCR扩增含有PVIII基因的目的片段

根据载体fADL-le(载体图谱见图3)上PVIII基因上下游序列，设计5’端含有EcoRI酶切位点(斜体加下划线表示)的上游引物(PF1)及5’端含有HindIII酶切位点(斜体加下划线表示)的下游引物(PR1)，具体引物序列如下：

上游引物(PF1)：5’-TTCCGGAATTCGTAGTGGCATTACG-3’；SEQ ID NO.2；

下游引物(PR1)：5’-ACGGCAAGCTTCTGTATGAGGTTTT-3’；SEQ ID NO.3；

PCR反应体系如下：

PCR反应程序为：94℃预变性8min；94℃30s，56℃40s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。

反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增噬菌体PVIII基因结果见图4。PCR结果显示，在约500bp处出现一条特异性目的条带，初步证明含有PVIII基因的目的片段扩增成功。

利用DNA凝胶回收试剂盒对目的片段进行回收。

(2)双酶切目的片段

用EcoR I(Takara，货号：1611)和HindIII(Takara，货号：1615)双酶切目的片段，具体酶切反应体系如下：

酶切反应条件为37℃水浴2h，反应结束后再次对经过酶切后的目的片段进行琼脂糖凝胶回收。

(三)噬菌粒载体pKK8的构建

1)目的片段与酶切载体的连接

将步骤(二)回收的目的片段与步骤(一)回收的pKK223-3载体连接，16℃反应过夜，连接反应体系如下：

2)重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞

(1)在大肠杆菌DH5α感受态细胞中加入10μl的连接产物，混匀，冰浴30min；

(2)42℃，热击90s；

(3)立即放置到冰上，冰浴10min；

(4)加入800μl LB培养基，37℃，100rpm，45min；

(5)将转化产物均匀涂在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上面，完全吸收后，倒置于37℃培养箱中，过夜培养12h。

3)菌液PCR鉴定

挑单克隆，转入5ml含有卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm，8h，分别吸取1μl菌液作为模板进行菌液PCR鉴定，引物和扩增条件与步骤(二)中的步骤(1)一致。

反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图5；PCR结果显示，在约500bp处出现一条特异性目的条带，表明含有PVIII基因的目的片段成功克隆到pKK223-3载体中。

将筛选到的阳性克隆送到上海生工生物技术服务有限公司进行测序，噬菌粒载体pKK8的测序结果如下：

TCGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCTGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGAATTCGTAGTGGCATTACGTATTTTACCCGTTTAATGGAAACTTCCTCAT GAAAAAGTCTTTAGTCCTCAAAGCCTCCGTAGCCGTTGCTACCCTCGTTCCGATGCTGTCTTTCGCTGCTGAGGGTGACGATCCCGCAAAAGCGGCCTTTAACTCCCTGCAAGCCTCAGCGACCGAATATATCGGTTATGCGTGGGCGATGGTTGTTGTCATTGTCGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTGTTTAAGAAATTCACCTCGAAAGCAAGCTGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTGTCGACTAACGAGGGCAAATCATGAAATACCTATTGCCTACGGCGGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGTAACTAGTGGCCCGGGAGGCCTGTCTCTAGAAGCCGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCTCATACAGAAGCTT；SEQIDNO.4；

其中，斜体部分分别为EcoR I(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)的酶切位点，两个酶切位点之间的加粗部分为含有PVIII基因的目的片段，其中加粗加下划线部分是PVIII蛋白的信号肽，加粗斜体部分是编码PVIII蛋白的结构基因。

测序结果表明，含有PVIII基因的目的片段被成功克隆到原核表达载体pKK223-3中，表明噬菌粒载体pKK8(载体图谱见图6)构建成功。

实施例2噬菌粒载体pKK8功能验证

为了验证构建的噬菌粒载体pKK8是否具有展示外源肽的功能，本发明将P53蛋白一个关键表位(MEEPQSDP；SEQ ID NO.5；简称肽MP)定向克隆到pKK8的PVIII基因中，形成重组噬菌粒pKK8-MP。利用辅助噬菌体侵染的方式将外源肽MP展示在噬菌体的PVIII蛋白上，并对展示该外源肽的噬菌体进行Westernblot验证及原子力显微镜观察分析。

1)重组噬菌粒pKK8-MP的构建

利用点突变试剂盒(Vazyme，货号：C215)来构建重组噬菌粒pKK8-MP，具体步骤如下：

(1)载体pKK8的扩增

利用试剂盒自带试剂进行PCR扩增，反应体系如下：

扩增反应所用引物PF2、PR2的序列如下：

上游引物(PF2)：5’-atggaggagccgcagtcagatcccGCAAAAGCGGCC-3’；SEQ IDNO.6；

下游引物(PR2)：5’-gggatctgactgcggctcctccatAGCGAAAGACAGCATCGGAA-3’；SEQIDNO.7；

其中，小写字母为编码外源肽的序列，并用于后期同源重组形成环状重组噬菌粒pKK8-MP，大写字母用于扩增载体pKK8序列。

(2)扩增产物Dpn I消化

因上一步的扩增产物中包含原始模板质粒，为防止其在转化后形成假阳性转化子，PCR扩增反应结束后加入1μlDpn I，37℃消化2h，去除甲基化模板质粒。

(3)重组反应形成pKK8-MP(采用点突变试剂盒，购自Vazyme，货号：C215)

重组反应体系如下(37℃反应30min)：

2)pKK8-MP转化大肠杆菌JM109感受态细胞

(1)在大肠杆菌JM109感受态细胞中加入10μl的重组产物，混匀，冰浴30min；

(2)42℃，热击90s；

(3)立即放置到冰上，冰浴10min；

(4)加入800μl LB培养基，37℃，100rpm，45min；

(5)将转化产物均匀涂在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上面，完全吸收后，倒置于37℃培养箱中，过夜培养12h；

(6)挑取阳性克隆，将筛选到的阳性克隆送到上海生工生物技术服务有限公司进行测序。

测序结果如下：

TTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGAATTCGTAGTGGCATTACGTATTTTACCCGTTTAATGGAAACTTCCTCATGAAAAAGTCTTTAGTCCTCAAAGCCTCCGTAGCCGTTGCTACCCTCGTTCCGATGCTGTCTTTCGCTATGGAGGAGCCGCAGTCAGA TCCCGCAAAAGCGGCCTTTAACTCCCTGCAAGCCTCAGCGACCGAATATATCGGTTATGCGTGGGCGATGGTTGTTGTCATTGTCGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTGTTTAAGAAATTCACCTCGAAAGCAAGCTGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTGTCGACTAACGAGG；SEQIDNO.8；

其中，加下划线部分为编码肽MP的目的片段，加粗部分为编码PVIII蛋白的信号肽，斜体部分为编码PVIII蛋白的结构基因。

测序结果表明，编码肽MP的目的片段(黑色加粗加下划线部分和图7)被成功克隆到噬菌粒载体pKK8的PVIII基因中，且与连接的原始序列完全一致，表明重组噬菌粒pKK8-MP构建成功，可用于下一步噬菌体的制备。

3)噬菌体phage-MP的制备(注：phage-MP代表PVIII蛋白展示外源肽MP的噬菌体)

(1)将50μl转化pKK9-MP的JM109接种到含有5ml LB液体培养基(100μg/ml Amp⁺)的试管中，37℃剧烈震荡10h；

(2)将1ml过夜培养的菌液加入到100ml LB培养基(100μg/ml Amp⁺)中，同时加入2μl辅助噬菌体M13K07，37℃剧烈震荡2h；

(3)6000rpm离心10min，弃上清，同时用100ml LB新鲜培养基(100μg/ml Amp⁺)吹打沉淀，37℃剧烈震荡6h；

(4)7000rpm离心10mim，加入六分之一体积的PEG/NaCl溶液，4℃过夜；

(5)8000rpm离心30min，弃上清，控干后用TBS溶液溶解沉淀；

(6)将溶液转移至1.5ml EP管中，14000rpm离心1min，小心将上清转移至1.5ml EP管中，每个EP管中加入150μl PEG/NaCl，混匀后4℃过夜；

(7)14000rpm离心15min，用100μl TBS溶解噬菌体沉，4℃冰箱保存。

4)Western-blot分析phage-MP

(1)SDS-PAGE后，将分离胶切下，放置于转移缓冲液中；

(2)将PVDF膜和滤纸按照胶的大小进行裁剪，滤纸浸泡在转移缓存液中，PVDF膜用甲醇浸泡1min后再放置到转移缓存液中；

(3)80V恒压电转2h；

(4)将膜放入封闭液中封闭1h；

(5)PBST洗三次，每次间隔5min；

(6)加入按照1：500稀释的P53多克隆抗体(上海生工生物工程股份有限公司，货号：D220082)，37℃，1h；

(7)PBST洗三次，每次间隔5min；

(8)羊抗兔IgG二抗稀释至工作浓度后，将膜条放入其中，37℃，45min；

(9)PBST洗三次，每次间隔5min；

(10)将ECL发光液稀释到工作浓度后，滴加在PVDF膜上，曝光30s。

为了验证外源肽MP与PVIII融合表达并成功的展示在噬菌体的表面，将制备的phage-MP与P53多克隆抗体杂交，结果如图8所示。噬菌体phage-MP能与P53多克隆抗体反应，且在PVIII蛋白的位置出现特异性条带，而辅助噬菌体M13K07与P53多克隆抗体无任何交叉反应，表明外源肽MP被成功的展示在丝状噬菌体PVIII蛋白上。

5)原子力显微镜(AFM)观察phage-MP

为了直观明了观察利用噬菌粒载体pKK8-MP制备的噬菌体phage-MP的形态特征，本发明用AFM对制备的phage-MP进行观察分析。

将噬菌体phage-MP用PBS缓冲液稀释到10⁷/ml，吸取20μl滴加到云母片上，低速旋涂1min，然后用AFM进行观察。结果如图9所示，制备的噬菌体phage-MP大约长900nm、宽7nm，具有相对柔软的结构。

Western-blot和AFM观察的结果均证实了本发明构建的噬菌粒载体pKK8具有PVIII蛋白展示外源肽，并正确组装形成丝状噬菌体的功能。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 新乡学院

<120> 一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体及其构建方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5023

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ttctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacattata cgagccgatg 60

attaattgtc aacagctcat ttcagaatat ttgccagaac cgttatgatg tcggcgcaaa 120

aaacattatc cagaacggga gtgcgccttg agcgacacga attatgcagt gatttacgac 180

ctgcacagcc ataccacagc ttccgatggc tgcctgacgc cagaagcatt ggtgcaccgt 240

gcagtcgata agcccggatc ctctacgccg gacgcatcgt ggccggcatc accggcgcca 300

caggtgcggt tgctggcgcc tatatcgccg acatcaccga tggggaagat cgggctcgcc 360

acttcgggct catgagcgct tgtttcggcg tgggtatggt ggcaggcccc gtggccgggg 420

gactgttggg cgccatctcc ttgcatgcac cattccttgc ggcggcggtg ctcaacggcc 480

tcaacctact actgggctgc ttcctaatgc aggagtcgca taagggagag cgtcgaccga 540

tgcccttgag agccttcaac ccagtcagct ccttccggtg ggcgcggggc atgactatcg 600

tcgccgcact tatgactgtc ttctttatca tgcaactcgt aggacaggtg ccggcagcgc 660

tctgggtcat tttcggcgag gaccgctttc gctggagcgc gacgatgatc ggcctgtcgc 720

ttgcggtatt cggaatcttg cacgccctcg ctcaagcctt cgtcactggt cccgccacca 780

aacgtttcgg cgagaagcag gccattatcg ccggcatggc ggccgacgcg ctgggctacg 840

tcttgctggc gttcgcgacg cgaggctgga tggccttccc cattatgatt cttctcgctt 900

ccggcggcat cgggatgccc gcgttgcagg ccatgctgtc caggcaggta gatgacgacc 960

atcagggaca gcttcaagga tcgctcgcgg ctcttaccag cctaacttcg atcactggac 1020

cgctgatcgt cacggcgatt tatgccgcct cggcgagcac atggaacggg ttggcatgga 1080

ttgtaggcgc cgccctatac cttgtctgcc tccccgcgtt gcgtcgcggt gcatggagcc 1140

gggccacctc gacctgaatg gaagccggcg gcacctcgct aacggattca ccactccaag 1200

aattggagcc aatcaattct tgcggagaac tgtgaatgcg caaaccaacc cttggcagaa 1260

catatccatc gcgtccgcca tctccagcag ccgcacgcgg cgcatctcgg gcagcgttgg 1320

gtcctggcca cgggtgcgca tgatcgtgct cctgtcgttg aggacccggc taggctggcg 1380

gggttgcctt actggttagc agaatgaatc accgatacgc gagcgaacgt gaagcgactg 1440

ctgctgcaaa acgtctgcga cctgagcaac aacatgaatg gtcttcggtt tccgtgtttc 1500

gtaaagtctg gaaacgcgga agtcagcgcc ctgcaccatt atgttccgga tctgcatcgc 1560

aggatgctgc tggctaccct gtggaacacc tacatctgta ttaacgaagc gctggcattg 1620

accctgagtg atttttctct ggtcccgccg catccatacc gccagttgtt taccctcaca 1680

acgttccagt aaccgggcat gttcatcatc agtaacccgt atcgtgagca tcctctctcg 1740

tttcatcggt atcattaccc ccatgaacag aaatccccct tacacggagg catcagtgac 1800

caaacaggaa aaaaccgccc ttaacatggc ccgctttatc agaagccaga cattaacgct 1860

tctggagaaa ctcaacgagc tggacgcgga tgaacaggca gacatctgtg aatcgcttca 1920

cgaccacgct gatgagcttt accgcagctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa 1980

cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag 2040

cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac 2100

ccagtcacgt agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt 2160

gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac 2220

cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 2280

cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 2340

aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 2400

gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 2460

tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 2520

agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 2580

ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 2640

taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 2700

gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 2760

gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 2820

ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg 2880

ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 2940

gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 3000

caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 3060

taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 3120

aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 3180

tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 3240

tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 3300

gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 3360

gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 3420

aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 3480

gccattgcta cagcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg 3540

gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct 3600

ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta 3660

tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg 3720

gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc 3780

cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg 3840

gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga 3900

tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg 3960

ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat 4020

gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc 4080

tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaaagagt ttgtagaaac 4140

gcaaaaaggc catccgtcag gatggccttc tgcttaattt gatgcctggc agtttatggc 4200

gggcgtcctg cccgccaccc tccgggccgt tgcttcgcaa cgttcaaatc cgctcccggc 4260

ggatttgtcc tactcaggag agcgttcacc gacaaacaac agataaaacg aaaggcccag 4320

tctttcgact gagcctttcg ttttatttga tgcctggcag ttccctactc tcgcatgggg 4380

agaccccaca ctaccatcgg cgctacggcg tttcacttct gagttcggca tggggtcagg 4440

tgggaccacc gcgctactgc cgccaggcaa attctgtttt atcagaccgc ttctgcgttc 4500

tgatttaatc tgtatcaggc tgaaaatctt ctctcatccg ccaaaacagc caagcttctg 4560

tatgaggttt tgctaaacaa ctttcaacag tttcggcttc tagagacagg cctcccgggc 4620

cactagttac atggccggct gggccgcgag taataacaat ccagcggccg ccgtaggcaa 4680

taggtatttc atgatttgcc ctcgttagtc gacaaaaaaa aggctccaaa aggagccttt 4740

aattgtatcg gtttatcagc ttgctttcga ggtgaatttc ttaaacagct tgataccgat 4800

agttgcgccg acaatgacaa caaccatcgc ccacgcataa ccgatatatt cggtcgctga 4860

ggcttgcagg gagttaaagg ccgcttttgc gggatcgtca ccctcagcag cgaaagacag 4920

catcggaacg agggtagcaa cggctacgga ggctttgagg actaaagact ttttcatgag 4980

gaagtttcca ttaaacgggt aaaatacgta atgccactac gaa 5023

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ttccggaatt cgtagtggca ttacg 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

acggcaagct tctgtatgag gtttt 25

<210> 4

<211> 720

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tcgactgcac ggtgcaccaa tgcttctggc gtcaggcagc catcggaagc tgtggtatgg 60

ctgtgcaggt cgtaaatcac tgcataattc gtgtcgctca aggcgcactc ccgttctgga 120

taatgttttt tgcgccgaca tcataacggt tctggcaaat attctgaaat gagctgttga 180

caattaatca tcggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 240

aaacagaatt cgtagtggca ttacgtattt tacccgttta atggaaactt cctcatgaaa 300

aagtctttag tcctcaaagc ctccgtagcc gttgctaccc tcgttccgat gctgtctttc 360

gctgctgagg gtgacgatcc cgcaaaagcg gcctttaact ccctgcaagc ctcagcgacc 420

gaatatatcg gttatgcgtg ggcgatggtt gttgtcattg tcggcgcaac tatcggtatc 480

aagctgttta agaaattcac ctcgaaagca agctgataaa ccgatacaat taaaggctcc 540

ttttggagcc ttttttttgt cgactaacga gggcaaatca tgaaatacct attgcctacg 600

gcggccgctg gattgttatt actcgcggcc cagccggcca tgtaactagt ggcccgggag 660

gcctgtctct agaagccgaa actgttgaaa gttgtttagc aaaacctcat acagaagctt 720

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 5

Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro

1 5

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

atggaggagc cgcagtcaga tcccgcaaaa gcggcc 36

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gggatctgac tgcggctcct ccatagcgaa agacagcatc ggaa 44

<210> 8

<211> 491

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac 60

ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcggctc gtataatgtg 120

tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacaga attcgtagtg gcattacgta 180

ttttacccgt ttaatggaaa cttcctcatg aaaaagtctt tagtcctcaa agcctccgta 240

gccgttgcta ccctcgttcc gatgctgtct ttcgctatgg aggagccgca gtcagatccc 300

gcaaaagcgg cctttaactc cctgcaagcc tcagcgaccg aatatatcgg ttatgcgtgg 360

gcgatggttg ttgtcattgt cggcgcaact atcggtatca agctgtttaa gaaattcacc 420

tcgaaagcaa gctgataaac cgatacaatt aaaggctcct tttggagcct tttttttgtc 480

gactaacgag g 491

Claims (6)

1.一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体，其特征在于，将丝状噬菌体PVIII基因定向克隆到原核表达载体pKK223-3的多克隆位点上，制备得到噬菌粒载体pKK8。

2.根据权利要求1所述的一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)将原核表达载体pKK223-3用EcoR I和HindIII进行双酶切，获得酶切后的载体pKK223-3；

(2)以载体fADL-le为模板，利用引物PF1/PR1 PCR扩增PVIII基因；并用EcoR I和HindIII进行双酶切，获得酶切后的PVIII基因目的片段；

(3)将步骤(1)获得的酶切后的载体pKK223-3与步骤(2)获得的酶切后的PVIII基因目的片段进行连接，转化，筛选阳性克隆，获得噬菌粒载体pKK8。

3.根据权利要求2所述的一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述引物PF1/PR1的引物序列如下：

PF1：5’-TTCCGGAATTCGTAGTGGCATTACG-3’；SEQ ID NO.2；

PR1：5’-ACGGCAAGCTTCTGTATGAGGTTTT-3’；SEQ ID NO.3。

4.根据权利要求2所述的一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增的反应体系如下：载体fADL-le 1μl，PF11μl，PR11μl，Premix Ex Taq Hot StartVersion 10μl，灭菌水7μl。

5.根据权利要求2所述的一种用于PVIII蛋白展示外源肽的噬菌粒载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增的反应程序如下：94℃预变性8min；94℃30s，56℃40s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。

6.权利要求1-5任一项所述的噬菌粒载体pKK8在展示外源多肽中的应用。

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