CN113621690A - 白细胞介素32作为靶点在筛选靶向治疗食管鳞癌药物中的应用 - Google Patents

白细胞介素32作为靶点在筛选靶向治疗食管鳞癌药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医学、细胞生物学、生物化学、分子生物学技术领域，提供了白细胞介素32即IL32作为靶点在筛选靶向治疗食管鳞癌药物中的应用。将白细胞介素32作为靶点筛选抗食管鳞癌药物的活性成分，即特异性的白细胞介素32靶向抑制剂。ESCC肿瘤样本中IL32的表达量显著高于癌旁组织，敲低IL32显著抑制ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而过表达IL32促进ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。蛋白印迹显示IL32促进ESCC细胞发生上皮间质转化。IL32基因可能通过促进ESCC细胞发生上皮间质转化从而发挥促癌作用，抑制IL32可能成为治疗ESCC的一种方法。

Description

白细胞介素32作为靶点在筛选靶向治疗食管鳞癌药物中的 应用
技术领域
本发明属于医学、细胞生物学、生物化学、分子生物学技术领域，具体涉及白细胞介素32作为靶点在筛选靶向治疗食管鳞癌药物中的应用。
背景技术
食管癌是人类常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率居全球第七位，死亡率居全球第六位。我国是食管癌高发国家，发病率和死亡率分别高居所有恶性肿瘤的第六位和第四位，其组织学类型以食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）为主，发病人群主要集中在我国山西、河南、河北交界的太行山区、新疆地区和闽粤一带。由于ESCC早期缺乏特异症状，临床缺乏早期诊断的特异性标志物以及有效的治疗靶点，因此发现晚、疗效差、临床预后极差，5年总体生存率只有30%。因此加强对食管癌尤其是ESCC的癌变机理、转移机制的研究、筛选早期诊断和预后预测标记物、寻找新的治疗靶点有着重要的意义。
白介素32（Interleukin 32，IL32）是一种新近发现的炎症因子。IL-32基因（GeneID: 9235，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/338968905）定位于人16p13.3，1992年Dahl等人首次发现其选择性地表达于IL-2活化的自然杀伤细胞因此命名为自然杀伤因子4（natural killer cell transcript 4，NK4）[1]；进一步研究发现其具有促炎作用，因此更名为IL-32[2-4]。IL-32含有８个外显子，因其pre-mRNA水平的不同剪接，形成９种不同亚型，每个亚型都含有一个与细胞粘附相关的精氨酸(R)-甘氨酸(G)天冬氨酸(D)序列[5]。
作为一种炎性因子，IL32主要在免疫细胞及上皮细胞表达，可诱导IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α等多种炎性因子的表达，在病原微生物感染和炎性疾病包括类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺炎等的发生发展过程中发挥抗炎或促炎作用。此外，IL-32在肿瘤中发挥重要作用，可通过不同信号通路如NF-κB、VEGF-STAT3、MMP-2等影响人类肿瘤如乳腺癌、肺癌、头颈鳞癌、胃癌、肝癌、卵巢癌等的侵袭、转移、增殖以及凋亡。
但目前在食管鳞癌相关的研究报道较少。Nabeki B等发现179例ESCC术后患者中IL32阳性与Treg细胞高浸润均与肿瘤T分期呈正相关，均显示预后差，二者联合可作为食管癌预后因素之一[6]。2020年Diakowska D等研究发现，IL32在ESCC中组织和血清中均高表达，与分期晚及淋巴结转移有关[7]。Yousif NG等人通过65例食管癌样本和35例正常食管组织的免疫组化发现发现食管癌组织中IL32及磷酸化的NF-κB和p38 MAPK表达均显著上调，提示IL32可能激活二者促进食管癌的发生发展[8]。但对IL32在ESCC中的作用和分子机制尚不清楚，能否作为治疗ESCC的靶点尚无报道。
发明内容
本发明提供了白细胞介素32即IL32作为靶点在筛选靶向治疗食管鳞癌药物中的应用。通过对TCGA数据的研究发现，IL32在ESCC组织中的表达显著高于其配对的非癌组织，提示其可能在ESCC中发挥癌基因作用。进一步的体外功能学实验结果表明，IL-32敲低后抑制ESCC细胞的增殖、侵袭和迁移能力，过表达则作用相反，提示其可能是个促癌基因。实验发现IL32敲低抑制了上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)标志物N钙黏蛋白（NCAD）、波形蛋白（Vimentin，VIM）和EMT关键转录因子SNAI1的表达，而IL32过表达抑制E钙黏蛋白（ECAD）表达、促进VIM和SNAI1的表达，提示IL32可能通过促进ESCC细胞发生EMT从而促进肿瘤细胞侵袭迁移。
本发明由如下技术方案实现的：白细胞介素32作为靶点在筛选靶向治疗食管鳞癌药物中的应用，将白细胞介素32作为靶点筛选抗食管鳞癌药物的活性成分，即特异性的白细胞介素32靶向抑制剂即IL32靶向抑制剂或ESCC细胞发生上皮间质转化抑制剂。
所述抗食管鳞癌药物的活性成分为靶向IL32的小干扰RNA即siRNA。
进一步的，所述siRNA的序列为如序列表中SEQ ID NO：1所示的siRNA#1及其相应的互补序列，或如序列表中SEQ ID NO：2所示的siRNA#2及其相应的互补序列。
检测IL32干扰效率的寡核苷酸序列为：上游引物：CTTGTAGCAACCACGTGTCC，下游引物：GCTCTTGGGCCCTAGACC；所用内参GAPDH引物为：上游引物：CCAGAACATCATCCCTGCCT，下游引物：CCTGCTTCACCACCTTCTTG。
本发明对TCGA数据的研究发现，IL32在ESCC组织中的表达显著高于其配对的非癌组织，提示其可能在ESCC中发挥癌基因作用。
本发明分析ESCC肿瘤样本和癌旁组织中IL32表达量差异；检测不同ESCC细胞系中IL32表达，在高表达细胞中利用siRNA敲低IL32表达，在低表达细胞系中过表达IL32，通过MTT、Transewell实验等检测IL32对ESCC细胞增殖、侵袭、迁移等恶性表型的影响；Westernblot检测上皮间质转化相关标志物的表达变化。结果：ESCC肿瘤样本中IL32的表达量显著高于癌旁组织，敲低IL32显著抑制ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而过表达IL32促进ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，提示其可能是个促癌基因。
EMT是肿瘤侵袭迁移的重要机制，目前关于IL32与EMT的研究较少，且不同肿瘤中结果不一致。本申请实验发现IL32敲低抑制了EMT标志物NCAD和VIM和EMT关键转录因子SNAI1的表达，而IL32过表达抑制ECAD表达、促进VIM和SNAI1的表达，提示IL32可能通过促进ESCC细胞发生EMT从而促进肿瘤细胞侵袭迁移。
综上，IL32在ESCC组织中表达上调，其可能通过促进ESCC细胞发生EMT从而促进肿瘤细胞的侵袭迁移，靶向IL32可能成为治疗ESCC的一种潜在方法。
附图说明
图1为IL-32在ESCC组织中的表达结果，图中：A：IL32在TCGA数据库中不同肿瘤组织中的表达；B：TCGA数据库ESCC样本（96例）和正常食管组织（11例）中IL32的表达量差异；C：155例ESCC样本及其配对正常组织中IL32表达量差异的非配对t检验；D：155例ESCC样本及其配对正常组织中IL32表达量差异的配对t检验；
图2为IL-32在ESCC细胞系中的干扰和表达结果，图中：A：不同细胞系中IL32 mRNA水平的表达；B：TE9细胞中IL32的过表达效率检测，以空质粒为对照，实验组为IL32野生型的表达质粒；C：TE5和KYSE150细胞中IL32的敲低的结果，以对照siRNA（不针对任何人的RNA）为对照，实验组为针对IL32的siRNA#1和#2；
图3为MTT检测IL-32敲低对ESCC细胞增殖的影响，图中：A：IL32敲低抑制TE5细胞增殖；B：IL32敲低抑制KYSE150细胞增殖；C：IL32过表达促进TE9细胞增殖；(*：P < 0.05；**：P < 0.01；***：P < 0.001)；
图4为transwell实验检测IL-32对ESCC细胞迁移能力即运动能力的影响；图中：A：IL32敲低显著抑制TE5细胞迁移；B：IL32敲低显著抑制KYSE150细胞迁移；C：IL32过表达显著促进TE9细胞迁移。(*：P < 0.05； **：P < 0.01； ***： P < 0.001)；
图5为transwell实验检测IL-32对ESCC细胞侵袭能力即消化基质能力的影响；图中：A：IL32敲低显著抑制TE5细胞侵袭；B：IL32敲低显著抑制KYSE150细胞侵袭；C：IL32过表达显著促进TE9细胞侵袭；(*：P < 0.05； **：P < 0.01； ***： P < 0.001)；
图6为IL-32对ESCC细胞EMT标志物蛋白表达水平变化的影响；图中：A：TE5细胞敲低IL-32后间质标志物NCAD、VIM和SNAI1蛋白表达水平显著降低；B：TE9过表达IL-32（HA）后上皮标志物ECAD蛋白水平显著降低、间质标志物VIM和SNAI1蛋白表达水平显著升高；C：TCGA中ESCC数据显示IL32表达量与ECAD量负相关（R=-0.4866，P < 0.0001），而与NCAD（R=0.3081，P < 0.0023）、VIM（R=0.4545，P < 0.0001）、SNAI1（R=0.4610，P < 0.0001）正相关。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
本领域技术人员意识到的通过常规实验就能了解到的描述的特定实施方案的等同技术，都将包含在本申请中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为由常规生化试剂商店购买得到的。
一、材料和方法
1、细胞及样本
Het-1A食管上皮永生化细胞系和KYSE150、KYSE180、KYSE450、TE1、TE5、TE6、TE9、TE14、TE15食管鳞癌细胞系由本实验室保存。细胞于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液、5%CO2、37℃培养。
样本 ESCC样本基因表达量数据来自于美国癌症基因组图谱（The cancer genomeatlas，TCGA）计划ESCC转录组测序数据，由UCSC Xena 网站（https://xenabrowser.net/heatmap/）下载获得。
2、常用试剂：Opti-MEM培养基和lipofectamin 2000转染试剂购自Thermofisher公司。MTT试剂购自Sigma公司。RNA提取试剂RNAiso plus、反转录试剂、qPCR试剂TB Green® Premix Ex Taq™ II购自宝生物公司。兔抗HA、E钙黏素（E-Cadherin/Cadherin 1，ECAD/CDH1）、N钙黏素（N-Cadherin/Cadherin 2，NCAD/CDH2）、波形蛋白（Vimentin，VIM）、Snail家族转录抑制因子1（Snail Family Transcriptional Repressor 1，SNAI1）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase，GAPDH）抗体购自武汉三鹰公司。IRDye 800CW 标记的二抗购自美国基因公司。IL32过表达质粒pcDNA3.0-HA-IL32wt由本实验室构建保存,带有HA标签。IL32及对照小干扰RNA（siRNA）由广州锐博生物有限公司合成，IL32及内参GAPDH引物由上海生工合成，序列如表1。
表1：IL32及内参GAPDH引物
Figure 302120DEST_PATH_IMAGE001
3、细胞转染：ESCC细胞接种于6孔板，待细胞融合度达60%—70%时，分别进行siRNA和质粒转染：向250μl Opti-MEM培养基中加入100 pmol/4.0μg siRNA或2μg重组载体，向250μl Opti-MEM培养基中加入5μl Lipofectamine 2000，室温静置5分钟；将二者轻柔混匀，室温静置20分钟；弃去旧细胞培养液，逐滴加入混合液，新鲜的完全培养基补齐至2ml，37℃、5% CO2培养48小时。
4、RNA提取及检测：Trizol法提取总RNA。6孔板每孔中加入1ml RNAiso，室温裂解5分钟，吸取裂解液至1.5ml EP管中；向其中加入200μl三氯甲烷，颠倒混匀4-6次，冰上静置5分钟，12000rpm、4℃离心15分钟；小心吸上清置于新的洁净的1.5ml EP管中，加入等量异丙醇混合均匀，-20℃静置10分钟，12000rpm、4℃离心10分钟；弃上清，加入1ml 70%乙醇，12000rpm、4℃离心5分钟；弃洗液，开盖室温干燥沉淀5-8分钟；加入30-50μl RNase free水溶解沉淀；Nanodrop检测RNA的纯度及浓度，按说明书进行反转录和荧光定量PCR。以对照组的管家基因为内参，采用ΔΔCt法计算相对表达量。
5、MTT：将各组细胞以103浓度/孔的浓度接种于96孔板，每个组5个复孔，共接种4个板子，分别在24、48、72、96小时检测细胞活力。检测前4小时每孔加入20μl 5 mg/ml的MTT溶液，放置于37℃、5% CO2继续培养4小时后，弃掉培养上清，每孔加入200μl DMSO，摇床室温避光振荡15分钟，当紫红色络合物完全溶解后，酶标仪检测激发光490纳米波长下的吸光度值，连续检测4天。根据4天检测的吸光度值，以吸光度为纵坐标，时间点为横坐标绘制细胞生长曲线。
6、Transewell侵袭和迁移实验：
侵袭实验：细胞转染48小时后，以每孔105的细胞密度接种于铺胶的Transwell小室（聚碳酸酯膜孔径8μm）中，向下室加入600μl完全培养基，继续培养24小时，取出小室，用棉签轻轻擦掉小室内侧膜未发生侵袭的细胞，将小室放入盛有4%多聚甲醛的孔中室温固定15分钟，1×PBS缓冲液清洗4次；结晶紫染色20分钟，1×PBS缓冲液清洗4次；待小室干燥后显微镜下观察，随机选取5个视野计数侵袭细胞数。
Transwell迁移实验与侵袭操作流程大致相同，Transwell小室未铺胶。
7、Western blot：用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解各组细胞，将细胞沉淀置于冰上充分裂解，12000 rpm，4℃，离心20min；吸取上清于新的1.5mL EP 管中，用 BCA 法测定蛋白浓度；10% SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭2小时，加入合适比例一抗，4℃孵育过夜，荧光标记二抗室温孵育1.5小时，Odyssey近红外双荧光扫描系统成像。
8、统计学方法：分别用配对和非配对t检验分析ESCC组织和癌旁组织中IL32表达量差异；两个基因间的相关性采用spearman分析；计数资料均数的比较应用t检验；单因素ANOVA方差分析用于多个样本间的均数的比较；统计软件使用Graphpad Prism 8.0进行；P值小于0.05被认为有统计学意义。
二、结果
11、IL-32在ESCC组织中的表达：通过gepia网站分析了IL32在TCGA数据库中不同肿瘤组织及其对应器官的正常组织中的表达。结果表明，在多数肿瘤中，IL32在肿瘤组织的表达显著高于其对应的正常组织（图1A）。
由于TCGA数据中的食管癌数据包括食管腺癌和食管鳞癌，我们进一步对ESCC样本转录组数据中IL32的表达进行了分析。结果表明，IL32在ESCC肿瘤组织的表达显著高于正常组织（图1B，P < 0.001）。155例ESCC样本及其配对正常组织中IL32表达量差异的非配对t检验和配对t检验也显示IL32在ESCC肿瘤组织的表达显著高于正常组织（图1C和D，P <0.001）。
2、IL32在不同食管鳞癌细胞系中的表达：用qRT-PCR对不同细胞系中IL32 mRNA水平的表达进行了检测，结果如图2所示，结果表明，在永生化的食管上皮细胞系Het-1A中IL32的表达显著低于ESCC细胞系（图2A）。我们选择TE5和KYSE150细胞进行了IL32的敲低，选择TE9细胞进行野生型IL32质粒的过表达（图2B和C）。结果表明TE5细胞中siRNA#1和siRNA#2的干扰效率在50%左右，KYSE150细胞中siRNA#1和siRNA#2的干扰效率在70%以上，同时野生型IL32质粒可有效的过表达，其表达量在内源性表达量的300倍以上。
3、IL32对ESCC细胞增殖能力的影响：通过MTT法检测了IL32敲低和过表达对ESCC细胞增殖能力的影响。结果如图3所示，结果表明与对照组相比，IL32敲低显著抑制了TE5和KYSE150细胞的增殖（图3A、B，P < 0.05），而IL32过表达显著促进了TE9细胞的增殖（图3C，P< 0.001）。
4、IL32对ESCC细胞迁移运动能力的影响：通过transwell实验检测了IL32对ESCC细胞迁移运动能力的影响。结果如图4所示，结果表明，与对照组相比，IL32敲低显著抑制了TE5和KYSE150细胞的迁移能力，穿过transwell小孔的ESCC细胞明显减少（图4A、B，P <0.05），而IL32过表达显著促进了TE9细胞的迁移，穿过transwell小孔的ESCC细胞明显增多（图4C，P < 0.001）。
5、IL32对ESCC细胞侵袭能力的影响：通过transwell实验检测了IL32对ESCC细胞侵袭能力的影响。结果如图5所示，结果表明，与对照组相比，IL32敲低显著抑制了TE5和KYSE150细胞的侵袭，穿过基质胶和transwell小孔的ESCC细胞明显减少（图5A、B，P <0.001），而IL32过表达显著促进了TE9细胞的侵袭，穿过基质胶和transwell小孔的ESCC细胞明显增多（图5C，P < 0.001）。
6、IL32对ESCC细胞EMT的影响：通过对IL-32敲低或者过表达的ESCC细胞进行western blot分析，结果如图6所示，结果发现TE5细胞敲低IL-32后，间质标志物NCAD、VIM、SNAI1蛋白水平显著降低（图6A）。相反，TE9细胞过表达IL-32后，上皮标志物ECAD显著降低，而间质标志物VIM和SNAI1则显著升高（图6B）。TCGA中ESCC数据也显示IL32表达量与ECAD量负相关（R=-0.4866，P < 0.0001），而与NCAD（R=0.3081，P < 0.0023）、VIM（R=0.4545，P <0.0001）、SNAI1（R=0.4610，P < 0.0001）正相关（图6C）。提示IL-32可能促进ESCC发生EMT。
作为一种炎性因子，IL32主要在免疫细胞及上皮细胞表达，可诱导IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α等多种炎性因子的表达，在病原微生物感染和炎性疾病包括类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺炎的发生发展过程中发挥抗炎或促炎作用。此外，IL-32在肿瘤中发挥重要作用，可通过不同信号通路如NF-κB、VEGF-STAT3、MMP-2等影响人类肿瘤如乳腺癌、肺癌、头颈鳞癌、胃癌、肝癌、卵巢癌等的侵袭、转移、增殖以及凋亡。
但目前在食管鳞癌相关的研究报道较少。Nabeki B等发现179例ESCC术后患者中IL32阳性与Treg细胞高浸润均与肿瘤T分期呈正相关，均显示预后差，二者联合可作为食管癌预后因素之一[6]。2020年Diakowska D等研究发现，IL32在ESCC中组织和血清中均高表达，与分期晚及淋巴结转移有关[7]。Yousif NG等人通过65例食管癌样本和35例正常食管组织的免疫组化发现发现食管癌组织中IL32及磷酸化的NF-κB和p38 MAPK表达均显著上调，提示IL32可能激活二者促进食管癌的发生发展[8]。但对IL32在ESCC中的作用和机制尚不清楚。
本发明对TCGA数据的研究发现，IL32在ESCC组织中的表达显著高于非癌组织，155对ESCC组织和配对非癌组织的结果也显示IL32在ESCC组织中的表达显著高于其配对的非癌组织，提示IL32可能在ESCC中发挥癌基因作用。进一步的体外功能学实验结果表明，IL-32敲低后抑制ESCC细胞的增殖、侵袭和迁移能力，过表达则相反，进一步验证了其促癌基因功能，使用siRNA靶向IL32则可以显著抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等恶性表型。。
EMT是肿瘤侵袭迁移的重要机制，目前关于IL32与EMT的研究较少，且不同肿瘤中结果不一致。Ling Gong等人研究发现IL32能够诱导肺癌细胞A549发生EMT[9]。Siyang Wen等人的研究也发现肿瘤相关成纤维细胞分泌的IL32能够激活integrin β3-p38 MAPK通路促进乳腺癌细胞发生EMT[10]。胰腺癌中的研究则显示IL32α可失活JAK2/STAT3信号通路抑制肿瘤细胞的EMT[11]。本申请实验发现IL32敲低抑制了EMT间质标志物NCAD和VIM和EMT关键转录因子SNAI1的表达，而IL32过表达抑制上皮标志物ECAD表达、促进间质标志物VIM和SNAI1的表达，提示IL32可能通过促进ESCC细胞发生EMT从而促进肿瘤细胞侵袭迁移。
综上，发现IL32在ESCC组织中表达显著上调，使用siRNA靶向IL32则可以显著抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等恶性表型，其可能通过促进ESCC细胞发生EMT从而促进肿瘤细胞的侵袭迁移，靶向IL32可能成为治疗ESCC的一种潜在方法。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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6、Nabeki B., S. Ishigami, Y. Uchikado, et al. Interleukin-32expression and Treg infiltration in esophageal squamous cell carcinoma.Anticancer Res, 2015, 35(5):2941-2947.
7、Diakowska D.,M. Krzystek-Korpacka. Local and Systemic Interleukin-32 in Esophageal, Gastric, and Colorectal Cancers: Clinical and DiagnosticSignificance. Diagnostics (Basel), 2020, 10(10).
8、Yousif N. G., F. G. Al-Amran, N. Hadi, et al. Expression of IL-32modulates NF-kappaB and p38 MAP kinase pathways in human esophageal cancer.Cytokine, 2013, 61(1):223-227.
9、Gong L., G. Liu, H. Zhu, et al. IL-32 induces epithelial-mesenchymal transition by triggering endoplasmic reticulum stress in A549cells. BMC Pulm Med, 2020, 20(1):278.
10、Wen S., Y. Hou, L. Fu, et al. Cancer-associated fibroblast (CAF)-derived IL32 promotes breast cancer cell invasion and metastasis via integrinbeta3-p38 MAPK signalling. Cancer Lett, 2019, 442:320-332.
11、Chen J., S. Wang, J. Su, et al. Interleukin-32alpha inactivatesJAK2/STAT3 signaling and reverses interleukin-6-induced epithelial-mesenchymal transition, invasion, and metastasis in pancreatic cancer cells.Onco Targets Ther, 2016, 9:4225-4237。
序列表
<110> 山西医科大学
<120> 白细胞介素32作为靶点在筛选靶向治疗食管鳞癌药物中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggagagctt ttgtgacaa 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggcttatta tgaggagca 19

Claims (4)

1.白细胞介素32作为靶点在筛选靶向治疗食管鳞癌药物中的应用，其特征在于：将白细胞介素32作为靶点筛选抗食管鳞癌药物的活性成分，即特异性的白细胞介素32靶向抑制剂即IL32靶向抑制剂或ESCC细胞发生上皮间质转化抑制剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述IL32靶向抑制剂为靶向IL32的小干扰RNA即siRNA。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述siRNA的序列为如序列表中SEQ IDNO：1所示的siRNA#1及其相应的互补序列，或如序列表中SEQ ID NO：2所示的siRNA#2及其相应的互补序列。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：检测IL32干扰效率的寡核苷酸序列为：上游引物：CTTGTAGCAACCACGTGTCC，下游引物：GCTCTTGGGCCCTAGACC；所用内参GAPDH引物为：上游引物：CCAGAACATCATCCCTGCCT，下游引物：CCTGCTTCACCACCTTCTTG。
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