CN113616593A - 一种纳米靶向聚合物胶束在制备靶向给药系统中的应用 - Google Patents
一种纳米靶向聚合物胶束在制备靶向给药系统中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种纳米靶向聚合物胶束在制备靶向给药系统中的应用。所述纳米靶向聚合物胶束以普朗尼克为载体，以阿仑膦酸盐和DP‑8肽为双配体，所述阿仑膦酸盐和DP‑8肽通过化学键修饰于所述普朗尼克上。本发明所述的纳米靶向聚合物胶束能够增加肿瘤细胞对药物的摄取量，诱导肿瘤细胞发生G2/M期和S期阻滞，抑制了肿瘤细胞的增殖；同时，所述纳米靶向聚合物胶束还能促进细胞凋亡蛋白Caspase‑3的表达，导致细胞凋亡。因此，所述纳米靶向聚合物胶束对于新型靶向给药系统的研发具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，尤其涉及一种纳米靶向聚合物胶束在制备靶向给药系统中的应用。
背景技术
靶向给药系统(targeting drug delivery system，TDDS)，是指借助载体将药物通过一定的给药方式选择性的浓集于病变部位的给药系统。纳米靶向给药系统具有定位浓集、缓释和长效、降低药物的毒性，提高药物的稳定性、给药途径多样性等优点。
恶性肿瘤现严重威胁人类生命健康，在发病率前五的恶性肿瘤中，乳腺癌位居第二，其逐年递增的趋势直逼肺癌。骨转移是恶性肿瘤患者最常见的并发症之一，研究发现，大部分乳腺癌患者后期会发生骨转移的现象。骨是继肺和肝之后第三大转移部分，其转移机制目前尚不清楚，恶性肿瘤一旦发生骨转移，将给患者带来巨大的临床负担，且舒适度和生存率得不到保障。
传统治疗骨转移的方法主要有手术、放疗和化疗。由于骨组织的特殊性，按照传统的治疗方式，很难使得转移灶的药物浓度达到治疗阈值，且治疗骨转移的化疗药物通常具有全身毒性作用。
双膦酸盐(Bisphosphonates，BPs)是一种骨溶解强力抑制剂，对骨组织有超强的亲和力，其进入体内后，快速从血液循环中消除而吸附到暴露的骨矿物区域。阿仑膦酸盐(Alendronate，ALN)属于第三代BPs，是一个含有氨基的双膦酸盐药物，由于其结构相对于其他双磷酸盐简单可修饰，且亲骨性较强，被广泛用作于骨靶向配体。
然而，由于破骨细胞与阿仑膦酸盐的强吸附作用阻碍了纳米粒子从骨基质到肿瘤细胞的进一步递送。因此，如何利用阿仑膦酸盐制备一种主动骨靶向的靶向纳米胶束或者给药系统，对于减少药物的全身毒性作用具有重要意义。
因此，开发主动骨靶向及对肿瘤细胞特异性响应的多功能靶向纳米胶束，减少药物的全身毒性作用具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种纳米靶向聚合物胶束在制备靶向给药系统中的应用。所述纳米靶向聚合物胶束能够增加肿瘤细胞对药物的摄取量，诱导肿瘤细胞发生G2/M期和S期阻滞，促进细胞凋亡蛋白Caspase-3的表达，导致肿瘤细胞凋亡。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种纳米靶向聚合物胶束在制备靶向给药系统中的应用，所述纳米靶向聚合物胶束以普朗尼克为载体；
所述纳米靶向聚合物胶束还包括阿仑膦酸盐和DP-8肽，所述阿仑膦酸盐和DP-8肽通过化学键修饰于所述普朗尼克上。
本发明中，所述纳米靶向聚合物胶束以普朗尼克(Pluronic)为载体，阿仑膦酸盐和DMPGTVLP 8(DP-8)肽为靶向头基，DP-8肽具有肿瘤靶向性，ALN具有骨靶向性，阿仑膦酸盐和DP-8肽在发挥各自靶向作用的同时，还能够协同配合，相互之间不会发生干扰，实现增加靶向效果、诱导细胞凋亡、提高药物的抗肿瘤作用。
作为本发明优选的技术方案，所述靶向给药系统中的药物包括疏水性抗肿瘤药物。
优选地，所述疏水性抗肿瘤药物包括阿霉素、紫杉醇、奥沙利铂、卡铂、奈达铂、阿柔比星、多柔比星、福美坦、卡莫斯丁、罗莫司丁、长春地辛、长春新碱中的任意一种或至少两种的组合。
作为本发明优选的技术方案，所述纳米靶向聚合物胶束包括阿仑膦酸盐修饰的普朗尼克、DP-8肽修饰的普朗尼克和未经修饰的普朗尼克。
本发明中，所述纳米靶向聚合物胶束包含未经修饰的普朗尼克，加入空白载体后，所得聚合物胶束的粒径相比于未添加得到的聚合物粒径较小，更加适用于后续实验操作，且效果明显较好。
优选地，所述阿仑膦酸盐与普朗尼克采用EDC/NHS法连接。
优选地，所述DP-8肽与普朗尼克采用EDC/NHS法连接。
作为本发明优选的技术方案，以所述阿仑膦酸盐修饰的普朗尼克和DMPGTVLP 8肽修饰的普朗尼克为混合载体，以未经修饰的普朗尼克为空白载体，所述纳米靶向聚合物胶束中混合载体与空白载体的质量比为1:(1～2)，优选为1:1。
优选地，所述阿仑膦酸盐修饰的普朗尼克与DMPGTVLP 8肽修饰的普朗尼克的质量比为(0.25～4):1，例如可以是0.25:1、0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1或4:1等，优选为4:1。
作为本发明优选的技术方案，所述纳米靶向聚合物胶束的粒径为100～200nm；例如可以是100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm或200nm等，优选为120～150nm，进一步优选为120～130nm。
优选地，所述纳米靶向聚合物胶束的ζ电位为-14～-10mV；例如可以是-14mV、-13.5mV、-13mV、-12.5mV、-12mV、-11.5mV、-11mV、-10.5mV或-10mV等，优选为-12～-10mV。
优选地，所述纳米靶向聚合物胶束的载药率为3％～5％，例如可以是3％、3.2％、3.5％、3.6％、3.8％、4％、4.2％、4.5％、4.6％、4.8％或5％等。
优选地，所述纳米靶向聚合物胶束的包封率为75％～80％，例如可以是75％、75.5％、76％、76.5％、77％、77.5％、78％、78.5％、79％、79.5％或80％等。
作为本发明优选的技术方案，所述靶向给药系统按照如下方法进行制备，所述方法包括：
将活化后的普朗尼克与阿仑膦酸盐混合，反应，经过纯化和干燥后得到所述阿仑膦酸盐修饰的普朗尼克；
将活化后的普朗尼克与DP-8肽混合，反应，经过纯化和干燥后得到所述DP-8肽修饰的普朗尼克；
再将所述阿仑膦酸盐修饰的普朗尼克、DP-8肽修饰的普朗尼克、未经修饰的普朗尼克和药物混合反应，得到所述靶向给药系统。
作为本发明优选的技术方案，所述混合反应的操作包括：
将所述药物溶于甲醇中，搅拌条件下加入脱盐剂，再加入所述阿仑膦酸盐修饰的普朗尼克、DP-8肽修饰的普朗尼克和未经修饰的普朗尼克，旋蒸、水化，过滤干燥所述纳米靶向聚合物胶束。
优选地，所述脱盐剂包括三乙胺。
优选地，所述药物与三乙胺的摩尔比为1:(2～4)，例如可以是1:2、1:2.2、1:2.5、1:2.6、1:2.8、1:3、1:3.2、1:3.5、1:3.8或1:4等。
优选地，所述水化时间为0.5～2h，例如可以是0.5h、0.8h、0.9h、1h、1.2h、1.5h、1.8h或2h等，优选为0.5h。
本发明中，所述水化的目的为：使两亲性载体在水化作用下将疏水性药物包裹在核内，水化一段时间之后进行冷冻干燥，去除水分，形成冻干粉。
本发明中，所述纳米靶向聚合物胶束可以按照如下方法进行，具体包括如下步骤：
(1)使用N-羟基琥珀酰亚胺活化普朗尼克P123，得到P123-NHS，再将所述P123-NHS与阿仑膦酸钠反应，而后，用分子截留量为3000～4000的透析袋纯化，冷冻干燥，得到阿仑膦酸钠修饰的普朗尼克；
使用N-羟基琥珀酰亚胺活化普朗尼克P123，活化后得到P123-NHS，再将所述P123-NHS与DP-8肽反应，而后，用分子截留量为3000～4000的透析袋纯化，冷冻干燥，得到DP-8肽修饰的普朗尼克；
(2)将药物溶于甲醇溶液中，所得溶液中所述药物的浓度为0.5～1g/mL，磁力搅拌下加入三乙胺，继续搅拌8～12h，再加入未经修饰的普朗尼克、阿仑膦酸钠修饰的普朗尼克与DP-8肽修饰的普朗尼克；
以所述阿仑膦酸盐修饰的普朗尼克和DP-8肽修饰的普朗尼克为混合载体，所述未经修饰的普朗尼克为空白载体，所述纳米靶向聚合物胶束中混合载体与空白载体的质量比为1:(1～2)；
所述阿仑膦酸钠修饰的普朗尼克与DP-8肽修饰的普朗尼克的质量比为(0.25～4):1，再经旋转蒸发去除溶剂；
再加入灭菌注射用水水化0.5～2h，再使用微孔滤膜过滤，冷冻干燥，制得所述纳米靶向聚合物胶束。
作为本发明优选的技术方案，所述靶向给药系统中还包括药学上可接受的辅料。
优选地，所述药学上可接受的辅料包括赋形剂、稀释剂、调味剂、粘合剂或填充剂中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述药学上可接受的辅料包括淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、乳糖、甘露醇、共聚维酮、交联羧甲基纤维素钠或硬脂酸镁中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供一种以普朗尼克为载体且所述普朗尼克上通过化学键修饰有阿仑膦酸盐和DP-8肽的纳米靶向聚合物胶束在制备细胞分裂周期阻滞剂中的应用；
优选地，所述细胞分裂周期阻滞剂作用的有丝分裂周期为G2/M期。
第三方面，本发明提供一种以普朗尼克为载体且所述普朗尼克上通过化学键修饰有阿仑膦酸盐和DP-8肽的纳米靶向聚合物胶束在制备细胞凋亡蛋白Caspase-3表达促进剂中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供一种纳米靶向聚合物胶束在制备靶向给药系统中的应用，所述纳米靶向聚合物胶束以普朗尼克为载体，以ALN和DP-8肽为双配体，DP-8肽具有肿瘤靶向性，ALN具有骨靶向性，阿仑膦酸盐和DP-8肽在发挥各自靶向作用的同时，相互之间不会发生干扰；
本发明通过MTT、CLSM、FCM和western blot等多种实验方法证明了P123-ALN/P123-DP-8@DOX相比于单独的药物和空白载体负载的药物，对MDA-MB-231细胞具有较强的细胞毒性作用，增强了肿瘤细胞对胶束的摄取，显著的抑制了肿瘤细胞的增殖，引起细胞发生凋亡作用；
因此，本发明所述的纳米靶向聚合物胶束制备得到的靶向给药系统能够增加肿瘤细胞对药物的摄取量，诱导肿瘤细胞发生G2/M期和S期阻滞，抑制了肿瘤细胞的增殖；同时，所述靶向给药系统还能促进细胞凋亡蛋白Caspase-3的表达，导致细胞凋亡。
附图说明
图1为实施例2中各实验组的细胞存活率柱状图。
图2为实施例3中Free DOX组在0.5h和2h时的激光共聚焦观察结果图。
图3为实施例3中P123@DOX组在0.5h和2h时的激光共聚焦观察结果图。
图4为实施例3中P123-ALN/P123-DP-8@DOX组在0.5h和2h时的激光共聚焦观察结果图。
图5为实施例3中阴性对照组的流式检测结果图。
图6为实施例3中Free DOX组、P123@DOX组和P123-ALN/P123-DP-8@DOX组的流式检测结果图。
图7为实施例6中western blot中内参蛋白β-actin和Caspase3蛋白的电泳条带图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
统计学方法：本实验数据表示为平均值±标准差
使用SPSS 20.0或GraphPad Prism5进行数处理，组间差异t检验确定显著性，P＜0.05具有统计学意义。
实施例1制备P123-ALN/P123-DP-8@DOX纳米靶向聚合物胶束
本实施例通过薄膜水化法成功制备出P123-ALN/P123-DP-8@DOX纳米靶向聚合物胶束。具体步骤如下：
(1)活化普朗尼克
精密称取普朗尼克P123 3.468g，加入普朗尼克P123两倍摩尔量的三光气，溶于30mL无水甲苯和无水二氯甲烷(无水甲苯和无水二氯甲烷的体积比为2:1)中，磁力搅拌过夜；
将反应液旋转蒸发除去溶剂，将所得产物重新溶解于20mL无水甲苯和无水二氯甲烷(无水甲苯和无水二氯甲烷的体积比为3:1)的混合溶液中，加入NHS 0.137g(约1.2mmol)；
取无水三乙胺0.2mL用无水二氯甲烷稀释，逐滴加入反应液中，继续搅拌反应约4h。
反应完成后再一次旋转蒸发除去溶剂，并在50℃乙酸乙酯中进行纯化，保存于-20℃干燥条件下，并命名该化合物为P123-NHS。
(2)制备P123-ALN和P123-DP-8
将活化后的P123溶解于10mL PBS(pH7.4)中，称取0.390g ALN(约1.2mmol)加入溶液中，氮气保护搅拌24h。
反应结束后，将反应液置于分子截留量为3000的透析袋内纯化72h，每隔12h换一次蒸馏水。冷冻干燥，-20℃保存，并命名为P123-ALN。
同法合成P123-DP-8；
采用红外光谱鉴定，根据谱图的特征峰的峰形变化判断出P123-ALN和P123-DP-8成功合成；
(3)制备复合胶束
将6mg DOX溶于甲醇溶液中，磁力搅拌下加入三乙胺，继续搅拌12h，再加入未经修饰的普朗尼克、阿仑膦酸钠修饰的普朗尼克与DMPGTVLP 8肽修饰的普朗尼克，再经旋转蒸发去除溶剂；
加入灭菌注射用水水化1h，水化量8.58mL，再使用微孔滤膜过滤，冷冻干燥，制得所述纳米靶向聚合物胶束。
最终，所制P123-ALN/P123-DP-8@DOX纳米靶向聚合物胶束包封率为76.97％，载药率为3.7％
对比例1制备P123@DOX胶束
本对比例中采用薄膜水化法制备纳米胶束，具体方法为：
将6mg DOX溶于甲醇溶液中，磁力搅拌下加入三倍摩尔比的三乙胺过夜，随后加入100mg的P123聚合物材料，旋转蒸发去除溶剂，加入灭菌注射用水水化30min，0.22μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥，制得P123@DOX纳米胶束，冷冻保存备用。
实施例2纳米靶向聚合物胶束的体外细胞毒性
本实施例中以MDA-MB-231细胞为模型，通过MTT实验考察P123-ALN/P123-DP-8@DOX胶束的细胞毒性。
将培养4代的MDA-MB-231细胞以每孔细胞密度1×105/mL，体积100μL接种到96孔板中，待细胞长至80％；
将不同浓度的Free DOX(组1)、P123@DOX(组2)和P123-ALN/P123-DP-8@DOX(组3)胶束加入到96孔板；其中，Free DOX表示单独给药；
进一步孵育48h后，添加MTT溶液，再次孵育4小时；
将培养基替换为300μL DMSO，在490nm下测量每个孔的吸光度值(OD)。
计算细胞的生存率：
细胞生存率％＝OD给药后的吸光度值/OD对照孔的吸光度值×100％。
如图1所示，MTT实验可以看出P123-ALN/P123-DP-8@DOX对MDA-MB-231细胞的细胞毒性随着DOX浓度的增加而具有明显的浓度依赖性；
当DOX浓度为0.08μg/mL时，组1、组2和组3的细胞存活率无明显差异；
随着浓度的增加，组2和组3的细胞存活率明显低于组1，当最大给药浓度为40μg/mL时，组1、组2和组3的细胞存活率分别31.32％，17.07％和19.52％。
根据GraphPad Prism5计算Free DOX，P123@DOX和P123-ALN/P123-DP-8@DOX的IC50；
所得IC50分别为4.69μg/mL，0.839μg/mL和0.989μg/mL。
说明PluronicP123包裹DOX制成的纳米靶向给药系统，增加了对细胞的毒性作用，而连接的靶向配体并未明显的增加载体材料对细胞的毒性作用。
本实施例的结果表明Free DOX、P123@DOX、P123-ALN/P123-DP-8@DOX对MDA-MB-231细胞的细胞毒性具有明显的浓度依赖性关系，且P123@DOX、P123-ALN/P123-DP-8@DOX的毒性均强于Free DOX。分析其原因可能为：Free DOX通过被动扩散的转运方式进入细胞内，而包裹DOX的胶束需要胞吞作用进入细胞内，速度相对缓慢，胶束在细胞体内需要经过一系列降解才能释放出DOX，最终聚集于核内。
而本发明中，连接的双靶向配体并未明显增加载体的细胞毒性，因此，P123@DOX和P123-ALN/P123-DP-8@DOX的IC50并未有明显差异。
实施例3 MDA-MB-231细胞对纳米靶向聚合物胶束的摄取
本实施例中以MDA-MB-231细胞为模型，以激光共聚焦和流式细胞术观察MDA-MB-231细胞对P123-ALN/P123-DP-8@DOX胶束的摄取情况。
(1)激光共聚焦显微镜(CLSM)观察
将培养4代的MDA-MB-231细胞接以细胞密度1×105/mL，体积500μL接种于四宫格共聚焦小皿内，置于37℃、5％CO2培养箱中，待细胞长至80％；
分别将含有DOX浓度为10μg/mL的Free DOX(组1)、P123@DOX(组2)和P123-ALN/P123-DP-8@DOX(组3)的培养基加入到共聚焦小皿内培养0.5h和2h，按照DAPI试剂盒的操作说明书进行操作，于CLSM下观察MDA-MB-231细胞对P123-ALN/P123-DP-8@DOX胶束的摄取情况。
如图2、图3和图4所示，图2为组1的激光共聚焦显微镜观察结果(包括DAPI通道、DOX通道和融合通道)，图3为组2的激光共聚焦显微镜观察结果(包括DAPI通道、DOX通道和融合通道)，图4为组3的激光共聚焦显微镜观察结果(包括DAPI通道、DOX通道和融合通道)。
MDA-MB-231细胞对三种不同胶束的摄取具有明显的时间依赖性，即时间增加细胞核内的DOX荧光强度逐渐增强；
在孵育0.5h时，MDA-MB-231细胞对药物的摄取主要集中在细胞质内，且少量的荧光聚集在细胞核内；
孵育2h后，P123-ALN/P123-DP-8@DOX胶束大量聚集在细胞核内，而Free DOX、P123@DOX两组细胞核内未见荧光。
上述结果表明，特异性靶向DP-8肽增加了肿瘤细胞对胶束的摄取，而DOX组与P123/DOX未有明显差别。
(2)流式细胞术(FCM)观察
将培养4代的MDA-MB-231细胞以细胞密度1×105/mL，体积2mL接种于六孔板内，待细胞长至80％；
分别将含有DOX浓度为10μg/mL的Free DOX(组1)、P123@DOX(组2)和P123-ALN/P123-DP-8@DOX(组3)的培养基加入到六孔板内；
以不加任何药物的处理组为阴性对照组；
培养0.5h和2h后，低速离心，弃上清，加入500μL PBS悬浮细胞，于FCM下进行检测。
所得结果如图5和图6所示，其中图5为阴性对照组的流式检测结果，图6分别为组1、组2和组3的检测结果。
0.5h后，MDA-MB-231细胞对P123-ALN/P123-DP-8@DOX摄取量明显高于DOX和P123@DOX两组；随着孵育时间的延长，P123-ALN/P123-DP-8@DOX摄取量也在明显增加，且高于DOX和P123@DOX两组的摄取量，说明P123-ALN/P123-DP-8@DOX对肿瘤细胞具有靶向作用，这种靶向作用是由乳腺癌特异性靶向肽DP-8所介导的，此结果与激光共聚焦结果相一致。
本实施例中，定性和定量结果均表明：P123-ALN/P123-DP-8@DOX胶束相对于FreeDOX和P123@DOX胶束有更多的DOX进入细胞内，且呈现明显的时间依赖性关系，并且，P123-ALN/P123-DP-8@DOX胶束较P123@DOX胶束从溶酶体逃逸能力强，使得更多的DOX容易进入到细胞核内，使得细胞核内的荧光强度增强。因此，本发明中，DP-8肽和ALN修饰的纳米胶束更有利于肿瘤细胞对药物的摄取。
实施例4纳米靶向聚合物胶束对细胞的凋亡诱导作用
本实施例中，利用流式细胞仪Annexin V/PI双染色法测定P123-ALN/P123-DP-8@DOX对MDA-MB-231细胞凋亡作用的影响。
将培养3代的MDA-MB-231细胞以细胞密度1×105/mL，体积2mL接种于六孔板内，待细胞长至80％；
分别将含有DOX 10μg/mL的Free DOX(组1)、P123@DOX(组2)和P123-ALN/P123-DP-8@DOX(组3)的培养基加入到六孔板内；
以不加任何药物的处理组为阴性对照组；
培养48h后，按照Annexinv-FITC/PI试剂盒的操作步骤进行实验，FCM下检测P123-ALN/P123-DP-8@DOX对MDA-MB-231细胞的凋亡诱导作用。
当DOX给药浓度为10μg/mL时，组2和组3的细胞的早期凋亡率与晚期凋亡率均明显高于组1；
组1、组2和组3的细胞存活率分别为86.6％、61.6％和44.0％，上述结果表明引起细胞存活率差异的主要原因可能在于特异性靶向肽DP-8诱导了细胞凋亡。
实施例5纳米靶向聚合物胶束对细胞周期的影响
本实施例用于检测P123-ALN/P123-DP-8@DOX对MDA-MB-231细胞凋亡作用的影响。
DOX是临床常用的蒽环类周期非特异性抗肿瘤抗生素，主要是在细胞分裂间期插入于DNA或RNA的碱基对，从而干扰细胞的增殖，故本实施例中采用FCM进一步研究胶束对肿瘤细胞分裂间期不同阶段的影响作用。
将培养3代的MDA-MB-231细胞以细胞密度1×105/mL、体积2mL接种于六孔板内，待细胞长至80％；
分别将含有DOX 10μg/mL的Free DOX(组1)、P123@DOX(组2)和P123-ALN/P123-DP-8@DOX(组3)的培养基加入到六孔板内；
以不加任何药物的处理组为阴性对照组；
孵育24h和48h后，低速离心收集细胞，70％乙醇悬浮细胞，-20℃固定过夜后，低速离心去除乙醇，加入200μL PI/R Nase Staining Buffer染液重悬细胞，室温避光放置15min；
采用FCM观察P123-ALN/P123-DP-8@DOX对MDA-MB-231细胞周期的影响。
结果显示P123@DOX、P123-ALN/P123-DP-8@DOX组细胞凋亡率较Free DOX组高，且细胞整体水平上调，P123-ALN/P123-DP-8@DOX组的总凋亡率较P123@DOX组略低，原因在于后期细胞凋亡有一部分出现在Q1区，降低了总体凋亡率，但从结果来看，P123-ALN/P123-DP-8@DOX促进细胞凋亡的作用明显强于Free DOX和P123@DOX组，表明DP-8肽修饰的纳米胶束增加了肿瘤细胞对药物的摄取。
实验结果表明，P123-ALN/P123-DP-8@DOX相比于Free DOX更多的诱导MDA-MB-231细胞发生G2/M期和S期阻滞，可能原因是特异性靶向配体在细胞有丝分裂G2/M期大量表达的结果。
实施例6纳米靶向聚合物胶束对细胞凋亡蛋白Caspase-3表达的影响
本实施例中，采用western blot检测P123-ALN/P123-DP-8@DOX对MDA-MB-231细胞凋亡蛋白Caspase-3表达的影响。
将培养4代的MDA-MB-231细胞以细胞密度1×105/mL，体积2mL接种于六孔板内，待细胞长至80％；
分别将含有DOX 10μg/mL的Free DOX(组1)、P123@DOX(组2)和P123-ALN/P123-DP-8@DOX(组3)的培养基加入到六孔板内；以不加任何药物的处理组为阴性对照组；培养48h后，按照碧云天RIPA细胞裂解液试剂盒提取细胞蛋白，超微量分析仪测定总蛋白含量；
根据10％SDS-PAGE胶上样要求上样10μL蛋白样品，不同电压下电泳分离，冰浴状态下将PAGE胶上的蛋白样品转移至PVDF膜，快速封闭液封闭10min，加入Caspase-3一抗孵育液，4℃晃动过夜；
次日换为HRP标记的二抗孵育液，室温下孵育1h，ECL化学发光显影。
western blot目的蛋白条带的亮度强弱直接反映出细胞内目的蛋白表达水平的强弱。
如图7中Western blot结果显示，经过Free DOX、P123@DOX和P123-ALN/P123-DP-8@DOX处理过的MDA-MB-231细胞，内参蛋白β-actin的蛋白条带的亮度基本一致。
经Free DOX，P123@DOX和P123-ALN/P123-DP-8@DOX胶束处理的MDA-MB-231细胞内的Caspase3蛋白的含量具有显著差异；
Free DOX和P123@DOX组仅有少量的Caspase-3蛋白，而P123-ALN/P123-DP-8@DOX组Caspase-3蛋白水平显著上调。
以上结果表明，P123-ALN/P123-DP-8@DOX能够激活Caspase-3蛋白表达，促进MDA-MB-231细胞的凋亡。
引起细胞凋亡的凋亡蛋白众多，Caspase家族在凋亡执行过程中有着举足轻重的地位，而Caspase-3却是众多凋亡蛋白中最受关注的一类凋亡蛋白。本实施例中发现，P123-ALN/P123-DP-8@DOX可以激活MDA-MB-231细胞内Caspase-3的大量表达，最终导致细胞凋亡。
综上所述，本实验通过MTT、CLSM、FCM和western blot等多种实验方法证明了P123-ALN/P123-DP-8@DOX对MDA-MB-231细胞具有较强的细胞毒性作用，增强了肿瘤细胞对胶束的摄取，显著的抑制了肿瘤细胞的增殖，引起细胞发生凋亡作用。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种纳米靶向聚合物胶束在制备靶向给药系统中的应用，其特征在于，所述纳米靶向聚合物胶束以普朗尼克为载体；
所述纳米靶向聚合物胶束还包括阿仑膦酸盐和DP-8肽，所述阿仑膦酸盐和DP-8肽通过化学键修饰于所述普朗尼克上。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述靶向给药系统中的药物包括疏水性抗肿瘤药物；
优选地，所述疏水性抗肿瘤药物包括阿霉素、紫杉醇、奥沙利铂、卡铂、奈达铂、阿柔比星、多柔比星、福美坦、卡莫斯丁、罗莫司丁、长春地辛、长春新碱中的任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述纳米靶向聚合物胶束包括阿仑膦酸盐修饰的普朗尼克、DP-8肽修饰的普朗尼克和未经修饰的普朗尼克；
优选地，所述阿仑膦酸盐与普朗尼克采用EDC/NHS法连接；
优选地，所述DP-8肽与普朗尼克采用EDC/NHS法连接。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述纳米靶向聚合物胶束以所述阿仑膦酸盐修饰的普朗尼克和DMPGTVLP 8肽修饰的普朗尼克为混合载体，以未经修饰的普朗尼克为空白载体，所述纳米靶向聚合物胶束中混合载体与空白载体的质量比为1:(1～2)，优选为1:1；
优选地，所述阿仑膦酸盐修饰的普朗尼克与DMPGTVLP 8肽修饰的普朗尼克的质量比为(0.25～4):1，优选为4:1。
5.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述纳米靶向聚合物胶束的粒径为100～200nm；
优选地，所述纳米靶向聚合物胶束的ζ电位为-14～-10mV；
优选地，所述纳米靶向聚合物胶束的载药率为3％～5％；
优选地，所述纳米靶向聚合物胶束的包封率为75％～80％。
6.根据权利要求1～5任一项所述的应用，其特征在于，所述靶向给药系统按照如下方法进行制备，所述方法包括：
将活化后的普朗尼克与活化后的阿仑膦酸盐混合，反应，经过纯化和干燥后得到所述阿仑膦酸盐修饰的普朗尼克；
将活化后的普朗尼克与DP-8肽混合，反应，经过纯化和干燥后得到所述DP-8肽修饰的普朗尼克；
再将所述阿仑膦酸盐修饰的普朗尼克、DP-8肽修饰的普朗尼克、未经修饰的普朗尼克和药物混合，进行自组装，得到所述靶向给药系统。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述阿仑膦酸盐修饰的普朗尼克、DP-8肽修饰的普朗尼克、未经修饰的普朗尼克和药物混合的具体操作包括：
将所述药物溶于甲醇中，搅拌条件下加入脱盐剂，再加入所述阿仑膦酸盐修饰的普朗尼克、DP-8肽修饰的普朗尼克和未经修饰的普朗尼克，旋蒸、水化，过滤干燥得到所述纳米靶向聚合物胶束；
优选地，所述脱盐剂包括三乙胺；
优选地，所述药物与三乙胺的摩尔比为1:(2～4)；
优选地，所述水化时间为0.5～2h。
8.根据权利要求1～7任一项所述的应用，其特征在于，所述靶向给药系统中还包括药学上可接受的辅料；
优选地，所述药学上可接受的辅料包括赋形剂、稀释剂、调味剂、粘合剂或填充剂中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述药学上可接受的辅料包括淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、乳糖、甘露醇、共聚维酮、交联羧甲基纤维素钠或硬脂酸镁中的任意一种或至少两种的组合。
9.一种纳米靶向聚合物胶束在制备细胞分裂周期阻滞剂中的应用，其特征在于，所述纳米靶向聚合物胶束以普朗尼克为载体，所述普朗尼克上通过化学键修饰有阿仑膦酸盐和DP-8肽的纳米靶向聚合物胶束；
优选地，所述细胞分裂周期阻滞剂作用的有丝分裂周期为G2/M期。
10.一种纳米靶向聚合物胶束在制备细胞凋亡蛋白Caspase-3表达促进剂中的应用，其特征在于，所述纳米靶向聚合物胶束以普朗尼克为载体，所述普朗尼克上通过化学键修饰有阿仑膦酸盐和DP-8肽的纳米靶向聚合物胶束。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20211109 |
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