CN113604447B - 锰过氧化物酶用于降解桔霉素的应用及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，锰过氧化物酶用于降解桔霉素的应用及方法。本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的锰过氧化物酶用于降解桔霉素的应用。Moniliophthora roreri来源的锰过氧化物酶高效地降解真菌毒素桔霉素，该方法成本低、适用范围广，可广泛用于食品毒素降解酶领域。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，锰过氧化物酶用于降解桔霉素的应用及方法。
背景技术
真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物，主要污染储存的粮油食品和饲料，严重危害人畜健康。桔霉素是具有肾毒性的真菌毒素，它对哺乳动物的肾脏有显著的肾脏毒性。
红曲红色素是红曲霉在生长代谢过程中生成的一种次级代谢产物，作为可食用的天然色素，红曲红色素与化学合成色素相比具有来源天然、安全性能可靠、无毒副作用、营养丰富、色调鲜艳等优点。但是在红曲霉次级代谢过程中，桔霉素总是伴随着红曲红色素的生成而产生。
控制真菌毒素的传统方法包括物理方法、化学方法和生物方法。目前已有酶可以降解真菌毒素的报道，例如，染料脱色过氧化物酶降解玉米赤霉烯酮。不同的过氧化物酶可降解的真菌毒素不同。已有关于锰过氧化物酶降解黄曲霉素的报道，但是未有报道锰过氧化物酶降解其它真菌毒素的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供锰过氧化物酶用于降解桔霉素的应用。
本发明的再一目为提供降解食品添加剂中桔霉素的方法。
根据本发明的锰过氧化物酶用于降解桔霉素的应用，所述锰过氧化物酶为Moniliophthora roreri来源的MrMnP，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
根据本发明的降解食品添加剂中的桔霉素的方法，包括以氨基酸序列如SEQ IDNO: 1所示的锰过氧化物酶降解桔霉素的步骤。
根据本发明的降解食品添加剂中的桔霉素的方法，其中，所述食品添加剂是红曲红色素。
本发明的实施例表明，本发明使用可可灰色果腐病菌Moniliophthora roreri来源的锰过氧化物酶对桔霉素的降解率达100%，但是不能降解真菌毒素赭曲霉毒素，因此该酶高效特异性地降解真菌毒素桔霉素，本发明的方法成本低、适用范围广，可广泛用于食品毒素降解酶领域。
附图说明
图1显示锰过氧化物酶降解桔霉素纯品的HPLC分析结果；
图2显示锰过氧化物酶在红曲红色素中降解桔霉素的HPLC分析结果；
图3显示锰过氧化物酶降解赭曲霉毒素纯品的HPLC分析结果。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株：产Moniliophthora roreri来源锰过氧化物酶MrMnP的毕赤酵母工程菌株。
2、生化试剂：桔霉素；色谱纯乙腈。
3、培养基：酵母培养基YPD (2%蛋白胨、1%酵母提取物、1%葡萄糖)；培养基BMGY（2%蛋白胨、1%酵母提取物、1%甘油、10%YNB溶液、1‰生物素溶液）；培养基BMMY（2%蛋白胨、1%酵母提取物、1%甲醇、10%YNB溶液、1‰生物素溶液）。
实施例1 重组锰过氧化物酶MrMnP的制备
从金唯智公司全合成Moniliophthora roreri来源的MrMnP基因序列。取含有重组质粒的X33/MrMnP毕赤酵母工程菌株，接种于50 mL YPD培养液中，30 ℃、220 rpm振荡培养48 h后，按2%比例转接于300 mL BMGY培养基中，30 ℃、220 rpm振荡培养48 h，将BMGY酵母培养菌液5,500 rpm离心5 min，弃上清。向发酵瓶中加入200 mLBMMY培养基（添加终浓度为100 μM的血红素）。30℃，200 rpm摇床培养48h，5,500 rpm离心5 min，收集发酵液，获得重组锰过氧化物酶MrMnP。
实施例2 锰过氧化物酶对桔霉素的降解
将桔霉素溶解到甲醇中配制成5 g/L的母液，按如下反应体系：250 μL丙二酸缓冲液（0.2 M，pH 5.0），100 μL桔霉素溶液（100 mg/L），250 μL硫酸锰(40 mM)，250 μL实施例1制备的锰过氧化酶(5000 U/L)，200μL过氧化氢( 5 mM)。以未加入锰过氧化物酶的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行，96 h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱（HPLC）分析桔霉素的降解率。液相色谱为岛津Nexera UHPLC高效液相色谱分析系统，色谱分离柱为Zorbax SB-C18 (4.6×250 mm, 5 μm)，流动相A（0.1%乙酸的水），流动相B (乙腈)；洗脱条件65% B洗脱20分钟；激发波长331nm，发射波长500nm。结果如图1所示，桔霉素全部被降解，降解率为100 %。
实施例3 锰过氧化物酶降解红曲红色素中的桔霉素
将桔霉素溶解到甲醇中配制成5g/L的母液，按如下反应体系：250 μL丙二酸缓冲液（0.2 M，pH 5.0），25 μL桔霉素溶液（400 mg/L），250 μL硫酸锰(40 mM，苹果汁为溶剂)，125 μL实施例1制备的锰过氧化酶(10000 U/L)，100μL过氧化氢(10 mM)，250μL 8mg/mL红曲红色素。以未加入锰过氧化物酶的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行，96 h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱（HPLC）分析桔霉素的降解率。液相色谱为岛津Nexera UHPLC高效液相色谱分析系统，色谱分离柱为Zorbax SB-C18 (4.6×250 mm, 5 μm)，流动相A（0.1%乙酸的水），流动相B (乙腈)；洗脱条件65% B洗脱20分钟；激发波长331nm，发射波长500nm。结果如图2所示，桔霉素全部被降解，降解率为100 %。
实施例4 锰过氧化物酶降解赭曲霉毒素
将1 mg赭曲霉毒素A粉末溶解到1 mL DMSO中配制成1 mg/mL的母液。按如下反应体系：250 μL丙二酸缓冲液（0.2 M，pH 5.0），100 μL赭曲霉毒素溶液（500 mg/L），250 μL硫酸锰(40 mM)，250 μL实施例1制备的锰过氧化酶(5000 U/L)，200μL过氧化氢( 5 mM)。以未加入锰过氧化物酶的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行，12 h后加入三倍体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱（HPLC）分析棒曲霉素的降解率。液相色谱为岛津Nexera UHPLC高效液相色谱分析系统，色谱分离柱为Zorbax SB-C18 (4.6×250 mm,5 μm)，流动相A（0.1 %乙酸的水），流动相B (乙腈)；洗脱条件48 % B洗脱20分钟；激发波长333nm，发射波长460nm。结果如图3所示，实施例1制备的锰过氧化物酶MrMnP对赭曲霉毒素无明显降解效果。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 锰过氧化物酶用于降解桔霉素的应用及方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 344
<212> PRT
<213> 可可链疫孢荚腐病菌(Moniliophthora roreri)
<400> 1
Met Ala Val Pro Gln Arg Val Ala Cys Ala Asp Gly Val His Thr Ala
1 5 10 15
Ser Asn Ala Ala Cys Cys Ala Leu Phe Pro Ile Val Asp Val Leu Gln
20 25 30
Ser Asp Phe Phe Asp Gly Gly Glu Cys Gly Glu Glu Ala His Glu Ser
35 40 45
Leu Arg Leu Thr Phe His Asp Ala Ile Gly Phe Ser Pro Thr Leu Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Ala Asp Gly Ser Ile His Val Phe Ser Asp Ile Glu Thr
65 70 75 80
Ala Phe His Ala Asn Gly Gly Ile Asp Glu Ile Val Asp Ala Gln Lys
85 90 95
Ala Phe Ile Ala Gln His Asn Ile Thr Ile Ser Pro Gly Asp Phe Ile
100 105 110
Gln Leu Ala Gly Ala Val Gly Leu Ser Asn Cys Pro Gly Ala Pro Arg
115 120 125
Leu Asn Phe Phe Phe Gly Arg Pro Pro Pro Lys Ala Ala Ala Pro Asp
130 135 140
Gly Leu Ile Pro Glu Pro Phe Asp Ser Val Thr Lys Ile Leu Asn Arg
145 150 155 160
Phe Ala Asp Ala Gly Phe Asn Ser Lys Glu Val Ile Ala Leu Leu Ala
165 170 175
Ser His Ser Val Ala Ala Ala Asp Lys Val Asp Pro Ser Ile Pro Gly
180 185 190
Thr Pro Phe Asp Ser Thr Pro Gly Ile Phe Asp Ser Gln Phe Phe Ile
195 200 205
Glu Val Gln Leu Arg Gly Thr Ala Phe Pro Gly Pro Asn Ser Thr Ala
210 215 220
Pro Ala Thr Asp Gly Glu Ala Glu Ser Pro Leu Arg Gly Glu Met Arg
225 230 235 240
Ile Ser Ser Asp Glu Asp Leu Ala Arg Asp Pro Arg Thr Ala Cys Glu
245 250 255
Trp Gln Ser Phe Val Asn Asn Gln Ala Lys Met Gln Thr Ala Phe Lys
260 265 270
Ala Ala Met Asn Lys Leu Ala Val Leu Gly Gln Asp Arg Arg Arg Leu
275 280 285
Ile Asp Cys Ser Glu Val Ile Pro Thr Thr Lys Pro Val Val Gly Arg
290 295 300
Ala His Leu Pro Ala Gly Ala Ser Arg Ala Asp Val Gln Gln Ala Cys
305 310 315 320
Ala Thr Ser Pro Phe Pro Ala Leu Thr Ala Asp Pro Gly Pro Val Thr
325 330 335
Ser Val Pro Ala Val Pro Pro Ser
340
Claims (3)
1.锰过氧化物酶用于降解桔霉素的应用，其中，所述锰过氧化物酶的氨基酸序列如SEQID NO: 1所示。
2.一种降解食品添加剂中的桔霉素的方法，其特征在于，所述方法包括以氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的锰过氧化物酶降解桔霉素的步骤。
3.根据权利要求2所述的降解食品添加剂中的桔霉素的方法，其特征在于，所述食品添加剂是红曲红色素。
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