CN113699127B

CN113699127B - 一种提高染料脱色过氧化物酶的霉菌毒素降解率的方法

Info

Publication number: CN113699127B
Application number: CN202110898384.3A
Authority: CN
Inventors: 秦星; 罗会颖; 王晓璐; 涂涛; 苏小运; 张�杰; 黄火清; 柏映国; 王苑; 王亚茹; 姚斌
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2021-08-05
Filing date: 2021-08-05
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2041-08-05
Also published as: CN113699127A

Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种提高染料脱色过氧化物酶降解霉菌毒素效率的方法。本发明提供了两种可用于霉菌毒素玉米赤霉烯酮降解的高效染料脱色过氧化酶介体。本发明的介体能够协助链霉菌来源染料脱色过氧化物酶有效地降解霉菌毒素玉米赤霉烯酮，广泛用于食品和饲料霉菌毒素脱毒领域。

Description

一种提高染料脱色过氧化物酶的霉菌毒素降解率的方法

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种提高染料脱色过氧化物酶的霉菌毒素降解率的方法。

背景技术

霉菌毒素是由曲霉属、青霉属、镰刀属等真菌产生的有毒次级代谢产物，具有致癌性、致畸性、免疫毒性、神经毒性、生殖和发育毒性等特点，能通过粮食、饲料或食品进入到人和动物的体内，从而严重危害人和动物的健康。目前已报道的真菌毒素有400多种，其中饲料中常见的真菌毒素包括玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇。这些常见的真菌毒素不仅降低了饲料品质，而且还间接影响了畜禽的生产性能，对动物组织机能、健康产生了不利的影响，同时也带来了潜在的食品安全问题。因此，亟需建立高效且环境友好的霉菌毒素脱毒方法。

目前，霉菌毒素脱毒主要有如下三种方法：物理脱毒法、化学脱毒法和生物脱毒法。传统的物理和化学脱毒法存在效果不稳定、营养成分损失大、影响饲料适口性、难以规模化生产等问题，尚未能广泛用到实际生产中；而生物脱毒法具有安全、高效、环保等特点，具有广阔的发展应用前景。其中，霉菌毒素降解酶作为一种环境友好的酶制剂，因其催化反应条件温和、无毒副产物等优势，引起越来越多的研究者重视和关注。

近年来，木质素降解酶如漆酶、锰过氧化物酶作为一类新型的霉菌毒素降解酶逐渐应用到黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的降解当中。据文献报道，漆酶和锰过氧化物酶对霉菌毒素的直接降解普遍较低，往往需要借助介体物质来提升降解效果，不同介体物质的作用效果差异显著，如枯草芽孢杆菌来源的漆酶在介体丁香酸甲酯的添加下，对玉米赤霉烯酮的降解率可达到100.0%，而在介体1-羟基苯并三唑的添加下，对玉米赤霉烯酮的降解率仅为8.2%。由此可见，木质素降解酶对霉菌毒素的降解效果因介体物质而异。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高染料脱色过氧化物酶的霉菌毒素降解率的方法。

根据本发明的提高染料脱色过氧化物酶的霉菌毒素降解率的方法，包括使用二价锰离子或1-羟基苯并三唑作为介体参与染料脱色过氧化物酶降解霉菌毒素的步骤，其中，所述霉菌毒素为玉米赤霉烯酮，所述染料脱色过氧化物酶来自链霉菌，其氨基酸序列如SEQID NO: 1所示。

根据本发明的提高染料脱色过氧化物酶的霉菌毒素降解率的方法，在缓冲溶液中对玉米赤霉烯酮进行高效降解，所述缓冲液为浓度50 mM、pH 4.0的丙二酸-丙二酸钠溶液。

本发明提供了特异性提高染料脱色过氧化物酶StDyP对玉米赤霉烯酮降解率的反应系统，以二价锰离子或1-羟基苯并三唑作为介体参与染料脱色过氧化物酶降解霉菌毒素。本发明的方法能够高效降解霉菌毒素、成本低、适用范围广，可广泛用于食品和饲料霉菌毒素脱毒领域。

附图说明

图1显示链霉菌来源染料脱色过氧化物酶-二价锰离子或1-羟基苯并三唑体系对霉菌毒素玉米赤霉烯酮的降解作用。

图2显示重组链霉菌来源染料脱色过氧化物酶-二价锰离子或1-羟基苯并三唑体系降解玉米赤霉烯酮的HPLC分析结果。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、基因及载体：大肠杆菌表达载体pCold I及菌株大肠杆菌pG-Tf2/BL21；

2、酶类及其它生化试剂：内切酶、重组酶、黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮。

3、培养基：大肠杆菌培养基LB (1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl，pH 7.0)。

StDyP的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

实施例1 染料脱色过氧化物酶StDyP编码基因的克隆

本发明的目的基因来源于链霉菌Streptomyces thermocarboxydus的染料脱色过氧化物酶StDyP。序列特异性引物： SEQ ID NO:3； SEQ ID NO:4。

以链霉菌Streptomyces thermocarboxydus的基因组DNA为模板进行PCR扩增。在1%琼脂糖凝胶上电泳，切胶得到目的片段，将该片段回收后与NdeI-XbaI双酶切的pCold I载体通过同源重组的方法相连，转化Trans I克隆宿主，测序验证，得到染料脱色过氧化物酶StDyP编码基因。

实施例2 重组染料脱色过氧化物酶StDyP的制备

将获得的含有染料脱色过氧化物酶基因StDyP的重组大肠杆菌表达质粒pCold I-StDyP转化大肠杆菌pG-Tf2/BL21，获得重组大肠杆菌 pG-Tf2/BL21/StDyP。

取E. coli pG-Tf2/BL21/StDyP菌株，接种于50 mL LB培养液中，37 ℃ 200 rpm振荡培养12 h后，按2%比例转接于300 mL LB培养基中，37 ℃ 200 rpm振荡培养约4 h(OD600≈0.6)，而后加入终浓度1 mM的诱导剂 IPTG和10 μM的Hemin溶液，于16 ℃ 200rpm诱导培养12 h后，离心收集菌体。将菌体重悬于平衡缓冲液（20 mM pH 7.4 Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，500 mM NaCl）中。采取超声破碎法裂解菌体。将破碎后的菌体碎片离心去除，利用Ni亲和层析柱进行纯化，收集电泳纯的洗脱组分并透析至蛋白储存液（20 mM pH 7.4Na₂HPO₄-NaH₂PO₄）中。

实施例3 重组染料脱色过氧化物酶StDyP-介体体系降解玉米赤霉烯酮

将玉米赤霉烯酮溶解到二甲基亚砜中配制成100 mg/L的母液，按如下反应体系：55 μL丙二酸缓冲液（0.2 M，pH 4.0），20 μL玉米赤霉烯酮溶液（100 mg/L），20 μL 10 mM介体，使用的介体为：硫酸锰；1-羟基苯并三唑；香豆酸；羟基苯甲酸；香草醛；香草酸；阿魏酸；丁香酸；丁香醛和乙酰丁香酮，，100 μL染料脱色过氧化酶(1 U/mL)，5 μL过氧化氢(4 mM)。以未加入染料脱色过氧化物酶的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行，48 h后加入等体积的甲醇终止反应，采用高效液相色谱（HPLC）分析玉米赤霉烯酮的降解率。液相色谱为岛津LC-20A高效液相色谱分析系统，色谱分离柱为Waters XBridge C18column (4.6×150 mm, 5 μm)，流动相A（水），流动相B (乙腈)；等梯度洗脱条件45%B洗脱20分钟；采用荧光检测器检测，激发波长274 nm，发射波长440 nm。

结果如图1、图2所示，可见部分玉米赤霉烯酮已被降解，当体系中未加入介体物质时，降解率仅为8.17%，而当加入介体物质二价锰离子时，降解率为27.49%；加入介体物质1-羟基苯并三唑时，降解率为98.84%；加入其它介体物质如香豆酸，羟基苯甲酸，香草醛，香草酸，阿魏酸，丁香酸，丁香醛和乙酰丁香酮对链霉菌来源的染料过氧化物酶降解霉菌毒素玉米赤霉烯酮无促进效果。由此可知，当降解体系中加入介体二价锰离子，玉米赤霉烯酮的降解率提高了3.36倍；加入介体1-羟基苯并三唑，玉米赤霉烯酮的降解率提高了12.10倍；介体物质二价锰离子或1-羟基苯并三唑的加入显著提高了染料脱色过氧化物酶对玉米赤霉烯酮的降解率。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种提高染料脱色过氧化物酶的霉菌毒素降解率的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 425

<212> PRT

<213> Streptomyces thermocarboxydus

<400> 1

Met Ala Asp Pro Ser Leu Ser Gln Thr Arg Thr Pro Glu Lys Glu Pro

1 5 10 15

Gln Ala Glu Ala Ala Ala Ser Gly Ile Ser Arg Arg Arg Leu Leu Gly

20 25 30

Thr Ala Gly Ala Thr Gly Leu Val Leu Gly Ala Ala Gly Gly Ala Val

35 40 45

Gly Tyr Ala Ser Ala Pro Thr Gly Ala Thr Pro Leu Thr Ser Val Gly

50 55 60

Ala Thr Lys Val Pro Phe His Val Lys His Gln Pro Gly Ile Thr Asp

65 70 75 80

Pro Leu Gln Ser Arg Gly His Leu Leu Ala Phe Asp Leu Arg Pro Gly

85 90 95

Ala Gly Arg Lys Glu Ala Ala Ala Leu Leu Arg Arg Trp Ser Asp Thr

100 105 110

Ala Arg Arg Leu Met Asp Gly Thr Phe Asp Ala Glu Gly Asp Ser Asp

115 120 125

Val Ala Arg Asp Ala Gly Pro Ser Ser Leu Thr Leu Thr Phe Gly Phe

130 135 140

Gly His Ser Phe Phe Ala Arg Thr Gly Leu Glu Arg Gln Arg Pro Ala

145 150 155 160

Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ala Phe Ser Ser Asp Arg Leu Asp Arg Ala

165 170 175

Arg Ser Asp Gly Asp Leu Trp Val Gln Ile Gly Ala Asp Asp Ala Leu

180 185 190

Val Ala Phe His Ala Leu Arg Ala Val Gln Lys Asp Ala Gly Ala Ala

195 200 205

Ala Arg Val Arg Trp Gln Met Asn Gly Phe Asn Arg Ser Pro Gly Ala

210 215 220

Thr Ala Arg Pro Met Thr Thr Arg Asn Leu Met Gly Gln Val Asp Gly

225 230 235 240

Thr Arg Asn Pro Lys Pro Asp Glu Pro Asp Phe Asp Gln Arg Ile Phe

245 250 255

Val Ala Glu Gln Gly Glu Pro Ala Trp Met Ala Asn Gly Ser Tyr Val

260 265 270

Val Val Arg Arg Ile Arg Met Leu Leu Asp Asp Trp Glu Lys Leu Ser

275 280 285

Leu Arg Glu Gln Glu Gly Val Ile Gly Arg Arg Lys Ala Asp Gly Ala

290 295 300

Pro Leu Ser Gly Gly Asp Glu Thr Thr Glu Met Asp Leu Glu Lys Thr

305 310 315 320

Asp Ala Gln Gly Asn Leu Val Val Pro Phe Asn Ala His Ala Arg Ile

325 330 335

Thr Arg Pro Asp Gln Asn Gly Gly Ala Ala Met Leu Arg Arg Pro Phe

340 345 350

Ser Tyr His Asp Gly Ile Asp Ala Asp Gly Thr Pro Asp Ala Gly Leu

355 360 365

Leu Phe Ile Cys Trp Gln Ala Asp Pro Leu Arg Gly Phe Val Pro Val

370 375 380

Gln Arg Lys Leu Asp Arg Gly Asp Ala Leu Thr Pro Phe Ile Arg His

385 390 395 400

Glu Ala Ser Gly Leu Phe Ala Val Pro Gly Gly Ala Ala Glu Gly Glu

405 410 415

Tyr Val Gly Gln Ala Leu Leu Glu Gly

420 425

<210> 2

<211> 1278

<212> DNA

<213> Streptomyces thermocarboxydus

<400> 2

atggctgacc cttccctgtc gcagacccgc acccccgaga aggagcccca ggcggaagcc 60

gccgcctccg gcatctcgcg gcggcgcctg ctcggcacgg ccggcgccac cgggctcgtg 120

ctcggggcgg ccggcggtgc cgtcgggtac gcgtcggcgc ccaccggagc cactccgctc 180

acctcggtcg gcgccacaaa agtcccgttt cacgtgaaac atcagccggg catcaccgac 240

ccgctccagt cgcgtggcca tctcctcgcc ttcgacctga ggcccggcgc cggacgcaag 300

gaggcggctg cgctgctgcg ccgctggtcc gacaccgccc ggcggctgat ggacgggacg 360

ttcgacgccg agggcgacag tgacgtggcc cgtgacgcgg ggccctcctc gctgaccctg 420

accttcggtt ttgggcacag cttcttcgcg cgcaccgggc tggagaggca gcgtccggcc 480

gccctggagc cgctgcccgc cttctcctcc gaccgcctcg accgggcccg cagcgacggg 540

gacctgtggg tgcagattgg cgccgacgac gccctcgtcg cgttccatgc cctgcgcgcg 600

gtgcagaagg acgcgggcgc ggcggcccgg gtgcgctggc agatgaacgg cttcaaccgg 660

tcgccgggcg ccaccgcccg cccgatgacc acccgcaatc tgatgggcca ggtcgacggc 720

acccgcaacc cgaaacccga cgagcccgac ttcgaccagc ggatcttcgt ggcggagcag 780

ggcgagcccg cctggatggc gaacggctcc tatgtggtcg tccgccggat ccgcatgctg 840

ctggacgact gggagaagct gtcgctcagg gagcaggagg gtgtcatcgg gcggcgcaag 900

gcggacggcg ccccgctctc cgggggcgac gagacgaccg agatggacct ggagaagacc 960

gacgcccagg gcaatctggt cgtcccgttc aacgcgcacg cacgcatcac ccggcccgac 1020

cagaacggcg gggcggcgat gctgcgccgg ccgttctcgt accacgacgg catcgacgcg 1080

gacgggacgc cggacgcggg gctgctgttc atctgctggc aggccgatcc gctgcgcggc 1140

ttcgtgccgg tgcagcgcaa gctcgaccgg ggcgacgccc tgacgccgtt catccgtcac 1200

gaggcgagcg ggctgttcgc cgtcccgggc ggggcggcgg agggtgagta tgtgggccag 1260

gcgctgctgg aggggtga 1278

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcatcatat cgaaggtagg catatggctg acccttccct gtcgcagac 49

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttttaagcag agattaccta tctagacccc tccagcagcg cctggccc 48

Claims

1.一种提高染料脱色过氧化物酶的霉菌毒素降解率的方法，其特征在于，所述方法包括使用二价锰离子参与染料脱色过氧化物酶降解霉菌毒素的步骤，其中，所述霉菌毒素为玉米赤霉烯酮，所述染料脱色过氧化物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

2.根据权利要求1所述的提高染料脱色过氧化物酶的霉菌毒素降解率的方法，其特征在于，在缓冲溶液中对玉米赤霉烯酮进行降解，所述缓冲液为浓度50 mM、pH 4.0的丙二酸-丙二酸钠溶液。

3.根据权利要求1所述的提高染料脱色过氧化物酶的霉菌毒素降解率的方法，其特征在于，所述二价锰离子为硫酸锰或氯化锰。