CN113604437A - 过表达ccr2的免疫细胞及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种过表达CCR2的免疫细胞及其应用。本发明通过在免疫细胞过表达CCR2，可以与CCL2结合，具有抑制CCL2对肿瘤细胞生长、迁移及浸润的促进作用。经实验验证，通过在免疫细胞过表达CCR2，可使该免疫细胞的迁移能力更强，细胞因子分泌能力也更高，进而提高了免疫细胞对肿瘤微环境的免疫浸润能力以及肿瘤杀伤能力。本发明为细胞免疫治疗提供了一种新的选择，对于肿瘤疾病的预防和治疗具有重要意义。

Description

过表达CCR2的免疫细胞及其应用
技术领域
本发明涉及免疫学领域，尤其涉及一种过表达CCR2的免疫细胞，一种包括该免疫细胞的药物组合物及其在制备免疫治疗产品中的用途。
背景技术
C-C趋化因子受体2(C-C MotifChemokine Receptor 2，CCR2)是人趋化因子受体家族的19个成员之一，位于3号染色体上，编码355个氨基酸残基蛋白，包括CCR2a和CCR2b两个亚型。CCR2属于G蛋白耦联受体，在各种细胞类型上都有发现。
CCL2是趋化因子中CC亚族的重要成员之一，是与CCR2结合的主要配体。CCL2和CCR2结合虽然不具有专一性，但从CCL2-/-、CCR2-/-基因敲除小鼠具有相似的功能表型可以推测CCL2主要通过与CCR2结合发挥其生物学效应。在正常组织细胞中，CCL2可由多种活化的细胞产生，如成纤维细胞、内皮细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞。研究表明乳腺癌、肺癌、前列腺癌以及结直肠癌等多种肿瘤细胞也能产生CCL2。
肿瘤转移是恶性肿瘤的主要特征，大多数肿瘤患者因为发生肿瘤转移死亡。肿瘤细胞转移过程中不仅可以适应新的微环境，还可以改变微环境为转移前微环境。肿瘤微环境是指肿瘤生长及转移肿瘤细胞所处的内外环境，其中包括肿瘤细胞周围的成纤维细胞、免疫和炎性细胞、胶质细胞等。CCL2作为在肿瘤微环境中重要并且研究广泛深入的趋化因子之一，通过自分泌或旁分泌促进肿瘤细胞生长与存活，参与肿瘤免疫耐受调节，诱导肿瘤血管生成，促进肿瘤侵袭和转移。许多研究表明在肿瘤患者的组织或血清中发现CCL2水平升高，且与肿瘤进展分级分期、侵袭转移和患者的预后密切相关。也有研究表明，靶向CCL2-CCR2轴具有显著抗肿瘤生长及抑制转移的作用。
然而，目前针对CCL2-CCR2的临床试验都局限于药物阻断的方案，且所取得的结果并不理想，因此，亟需利用CCL2-CCR2机制，寻求新的肿瘤治疗策略。
发明内容
本发明目的在于提供一种过表达CCR2的免疫细胞，一种包括该免疫细胞的药物组合物及其在制备免疫治疗产品中的用途，旨在发挥CCL2-CCR2对细胞招募的优势，解决现有针对CCL2-CCR2局限于药物阻断的技术问题，为肿瘤疾病的预防或治疗提供了新的方法。
为了实现上述发明目的，本发明一方面，提供了一种免疫细胞，该免疫细胞过表达CCR2。
在一些实施方案中，CCR2为CCR2a和/或CCR2b，优选为CCR2a。进一步地，编码CCR2a的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一些实施方案中，免疫细胞为T细胞、自然杀伤细胞(Natural Killer cell，NK)、巨噬细胞、树突状细胞中的至少一种；其中T细胞优选为肿瘤浸润淋巴细胞(TumorInfiltrating Lymphocyte，TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-InducedKiller，CIK)、嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigen Receptor T cell，CAR-T)或自然杀伤T细胞(Natural KillerT cell，NKT)，更优选TIL。
本发明另一方面，提供了一种药物组合物，其包括上述的免疫细胞。
本发明再一方面，提供了上述的免疫细胞或上述的药物组合物在制备免疫治疗产品中的用途。
在一些实施方案中，该免疫治疗产品为细胞免疫治疗产品。
在一些实施方案中，该免疫治疗产品用于预防或治疗肿瘤。进一步地，该肿瘤表达CCL2，优选高表达CCL2。更进一步地，该肿瘤为高表达CCL2的转移性肿瘤。
在一些实施方案中，该免疫治疗产品用于预防或治疗肺癌、宫颈癌、黑色素瘤、胃癌和/或乳腺癌，优选用于原本低表达或不表达CCR2的肿瘤，如部分肺腺癌病人。
本发明通过在免疫细胞过表达CCR2，可以与CCL2结合，具有抑制肿瘤细胞生长、迁移及浸润的促进作用。经实验验证，通过在免疫细胞过表达CCR2，可使该免疫细胞的迁移能力更强，细胞因子分泌能力也更高，进而提高了免疫细胞对肿瘤微环境的免疫浸润能力以及肿瘤杀伤能力。本发明为细胞免疫治疗提供了一种新的选择，对于肿瘤疾病的预防和治疗具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中，用TIL细胞刺激前后，CCR2+/-细胞表达CD107a+的比例变化结果；
图2为本发明实施例1中，用PBMC细胞刺激前后，CCR2+/-细胞表达CD107a+的比例变化结果；
图3为本发明实施例2中，流式检测过表达细胞的CCR2a过表达蛋白表达水平；
图4和图5为本发明实施例3中，过表达CCR2a和CCR2b后，对肿瘤靶细胞的杀伤能力检测结果；
图6为本发明实施例4中，CD3+细胞CCR2a表达水平的检测结果；
图7为本发明实施例4中，病毒转染后GFP+细胞在各组中占CD3+细胞的百分比结果；
图8为本发明实施例4中，病毒转染后GFP+CCR2a+细胞在各组中占CD3+细胞的百分比结果；
图9为本发明实施例4中，transwell CD3+迁移细胞占活细胞百分比结果；
图10为本发明实施例4中，GFP阳性细胞在transwell活的CD3迁移细胞中所占比例结果；
图11为本发明实施例4中，GFP+CCR2a+阳性细胞在transwell活的CD3迁移细胞中所占比例结果；
图12为本发明实施例4中，GFP+CCR2a+阳性细胞在transwell活的CD3+GFP+细胞中所占比例结果；
图13为本发明实施例5中，PBMC在实验后GFP+CCR2a+阳性细胞在transwell活的CD3+GFP+细胞中所占比例结果；
图14为本发明实施例5中，PBMC在实验后GFP+CCR2a+阳性细胞在transwell活的CD3+GFP+细胞中所占比例结果；
图15为本发明实施例6中，CCR2-TIL细胞过表达CCR2a后在小鼠MC38模型中的肿瘤生长结果；
图16为本发明实施例6中，CCR2-TIL细胞过表达CCR2a后在小鼠MC38模型中浸润到肿瘤部位后，消化后的单细胞悬液流式图；
图17为本发明实施例6中，CCR2-TIL细胞过表达CCR2a后在小鼠MC38模型中浸润到肿瘤部位后，消化后的流式统计图。
具体实施方式
一方面，本发明实施例提供了一种免疫细胞，该免疫细胞过表达CCR2。
具体地，根据CCR2的不同亚型，免疫细胞既可以过表达CCR2a，又可以过表达CCR2b，还可以两种亚型同时表达。其中，尽管CCR2a不是常见的生理性表达CCR2变体，但是本发明实施例优选免疫细胞过表达CCR2a(包括同时过表达CCR2a和CCR2b的情况)，这是因为过表达CCR2a的免疫细胞与过表达CCR2b的免疫细胞相比，对于肿瘤细胞的杀伤效果更好。
过表达，在本发明实施例中是指细胞本身不会表达(或表达水平低)CCR2，通过采用转染外源病毒或药物诱导等方法，使该细胞在现有表达水平基础上额外地表达CCR2基因，从而使该细胞表达CCR2的量超过其原本的表达量。
在一些实施方案中，编码CCR2a的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
编码CCR2a的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)：
atgctgtccacatctcgttctcggtttatcagaaataccaacgagagcggtgaagaagtcaccaccttttttgattatgattacggtgctccctgtcataaatttgacgtgaagcaaattggggcccaactcctgcctccgctctactcgctggtgttcatctttggttttgtgggcaacatgctggtcgtcctcatcttaataaactgcaaaaagctgaagtgcttgactgacatttacctgctcaacctggccatctctgatctgctttttcttattactctcccattgtgggctcactctgctgcaaatgagtgggtctttgggaatgcaatgtgcaaattattcacagggctgtatcacatcggttattttggcggaatcttcttcatcatcctcctgacaatcgatagatacctggctattgtccatgctgtgtttgctttaaaagccaggacggtcacctttggggtggtgacaagtgtgatcacctggttggtggctgtgtttgcttctgtcccaggaatcatctttactaaatgccagaaagaagattctgtttatgtctgtggcccttattttccacgaggatggaataatttccacacaataatgaggaacattttggggctggtcctgccgctgctcatcatggtcatctgctactcgggaatcctgaaaaccctgcttcggtgtcgaaacgagaagaagaggcatagggcagtgagagtcatcttcaccatcatgattgtttactttctcttctggactccctataatattgtcattctcctgaacaccttccaggaattcttcggcctgagtaactgtgaaagcaccagtcaactggaccaagccacgcaggtgacagagactcttgggatgactcactgctgcatcaatcccatcatctatgccttcgttggggagaagttcagaagcctttttcacatagctcttggctgtaggattgccccactccaaaaaccagtgtgtggaggtccaggagtgagaccaggaaagaatgtgaaagtgactacacaaggactcctcgatggtcgtggaaaaggaaagtcaattggcagagcccctgaagccagtcttcaggacaaagaaggagcctag
本发明实施例中的免疫细胞，是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞。在一些实施方案中，免疫细胞为T细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞中的至少一种。其中，T细胞和NK细胞的CCR2过表达在本发明实施例中均可以起到良好的抑制肿瘤细胞生长、侵袭和转移的作用，并且具有体外扩增容易的优势。巨噬细胞和树突状细胞的CCR2过表达也能起到积极的抑制肿瘤细胞生长、侵袭和转移的作用，但是巨噬细胞和树突状细胞在体外无法扩增，因此其利用受到了一定程度的限制。
具体地，T细胞优选肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte，TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)、嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigen Receptor T cell，CAR-T)或自然杀伤T细胞(Natural Killer T cell，NKT)(NKT细胞同时具有NK细胞和T细胞的特征)，更优选TIL。由于CCL2可以促进肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-Associated Macrophages,TAMs)的募集和浸润，且TAM类似于M2型巨噬细胞，在肿瘤微环境的作用下分化成熟，促进肿瘤细胞的生长、侵袭和转移。肿瘤微环境是指肿瘤局部浸润的免疫细胞、间质细胞及所分泌的活性介质等与肿瘤细胞所构成的局部内环境。因此，通过在免疫细胞过表达CCR2，通常认为CCR2与CCL2结合，介导免疫细胞向高趋化因子环境(如CCL2)的迁移，从而达到抑制肿瘤细胞的生长、侵袭和转移的作用；进一步地，当过表达CCR2的免疫细胞为TIL时，还可以进一步提升对TIL对肿瘤微环境的免疫浸润能力以及肿瘤杀伤能力，从而更好地发挥免疫细胞的治疗效果。
在免疫细胞表面过表达CCR2的方法，可采用本领域的常规方法。在一些实施方案中，可通过构建包括CCR2的表达载体，再将该表达载体转导至免疫细胞中，使免疫细胞过表达CCR2。表达载体包括足以用于表达的顺式作用元件，用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供，包括但不限于黏粒、质粒、病毒。其中，病毒包括但不限于慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等。
在一些优选实施方案中，表达载体为慢病毒载体。慢病毒为逆转录病毒科的一个属，慢病毒在逆转录病毒中是独特的，其能够感染非分裂细胞，可以将大量遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体中最有效的方法之一，如HIV、SIV、FIV等均属于慢病毒。通过采用慢病毒作为表达载体，其转染效率优于转座子系统，且外源基因插入基因组是稳定转化系统，免疫原性比腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体更低，具有更小的副作用和不良反应以及更高的有效性和安全性。
另一方面，本发明实施例提供了一种药物组合物，其包括本发明实施例提供的上述免疫细胞。
在一些实施方案中，除了包括本发明实施例提供的免疫细胞作为有效成分之外，该药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
再一方面，本发明实施例还提供了上述免疫细胞或上述药物组合物在制备免疫治疗产品中的用途。
在一些实施方案中，免疫治疗产品包括抗体产品和细胞免疫治疗产品，优选将本发明实施例提供的免疫细胞或药物组合物用于制备细胞免疫治疗产品。
本发明实施例提供的免疫细胞或药物组合物在制备免疫治疗产品时，该产品适用于制备预防或治疗任何肿瘤的药物。
在一些实施方案中，该肿瘤表达CCL2，更优选高表达CCL2或过表达CCL2。CCL2的表达量越高，则可以进一步发挥CCL2-CCR2对细胞招募的优势，使过表达CCR2的免疫细胞可以更好地浸润肿瘤。进一步地，由于过表达CCR2的免疫细胞的迁移能力更强，细胞因子分泌能力也更高，因此作用于转移性肿瘤时，可以达到更佳的抑制肿瘤转移效果。
在本技术领域中，“高表达”与“过表达”具有相似之处。在本发明实施例中，“高表达”除了包括“细胞本身不会表达(或表达水平低)某基因(如CCL2)，通过采用转染外源病毒或药物诱导等方法，使该细胞在现有基因组的基础上额外地表达该基因，从而使该细胞表达该基因的量超过其原本的表达量”的情况之外，还包括细胞内源性的表达(即天然表达)水平相对于其它细胞的表达水平更高的情况。
在一些实施方案中，该免疫治疗产品预防或治疗肺癌、宫颈癌、黑色素瘤、胃癌和/或乳腺癌，优选用于原本低表达或不表达CCR2的肿瘤，如部分肺腺癌病人。
为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例蛋白复合物及其应用的进步性能显著的体现，以下通过多个实施例来举例说明上述技术方案。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
流式检测TIL细胞和PBMC采用anti-CD3/CD28磁珠激活后CCR2+/-细胞群的CD107a差异，步骤如下：
1.1 PBMC细胞悬液离心计数，用AIM-V+10％AB血清+双抗完全培养基重悬并调整细胞密度为1×106/mL，于24孔板每孔铺1mL细胞悬液，添加CD3单抗100ng/mL、IL-21000U/mL过夜。
1.2原代培养TIL细胞3×106细胞，过夜。
1.3以上细胞按表1所示进行分组，每组3个重复，并采用美天旎anti-CD3/CD28磁珠激活处理过夜。
表1
组1 组2 组3 组4
细胞 TIL TIL PBMC PBMC
刺激 + - + -
1.4处理18小时后，流式检测流式分析：CCR2、CD3、CD4、CD8、CD107a、7-AAD各群细胞的比例和数量，结果如图1和图2所示。
结果表明，TIL细胞或PBMC采用anti-CD3/CD28磁珠激活后，CCR2被显著上调，同时CCR2的上调与杀伤的标志物CD107a具有显著正相关。表明CCR2在T细胞表面的表达除了发挥趋化作用，也是细胞活化的重要标志物，与T细胞活化和杀伤提高具有相关性。同时，虽然TIL或PBMC在活化后CCR2+细胞比例显著高于活化前，但是始终存在有一群CCR2-细胞，结果表明CCR2-细胞其CD107a表达也是低的，表明其杀伤能力显著低于CCR2+细胞。
实施例2
CCR2过表达慢病毒包装及CCR2过表达TIL细胞的制备，步骤如下：
2.1慢病毒包装和收获
第一天：
1)转染前将培养的293FT(采购自ATCC)换用9mL无抗生素DMEM+10％FBS；
2)设置1组EP管；
3)2个EP管A:OPTi-MEM 1.5ml+主质粒20μg+pMDLg.PRRE 10μg+PRSV-Rev5μg+PMD2.G 5μg。质粒共40μg比例(4:2:1:1)；以及对应的2个EP管B:OPti-MEM1.5ml+lipo300041μL。本步骤的质粒均采购自Addgene，且第一个EP管A的主质粒为空载质粒，第二个EP管A的主质粒为多克隆位点插入CCR2aDNA片段的主质粒。
4)2个EP管B分别混匀后室温静止5min；
5)将2个EP管B分别缓慢滴入对应的2个EP管A中，移液枪吹匀混合，避免产生气泡，然后室温静置20min；
6)每个EP管A和B的3mL混合液，分别缓慢滴加入10cm培养皿中的293FT细胞中，终体积12ml，摇8字混匀；
7)12-16h后分别用12mLDMEM+10％FBS的含抗生素新鲜复温的培养基换液。沿培养皿壁缓慢加入。放入培养箱中继续培养。此时开始计算时间。
第三天：
1)48h后分别进行第一次收集，小心收集上清12ml，并换上12mLDMEM+10％FBS的含抗生素新鲜复温的培养基换液。沿培养皿壁缓慢加入。放入培养箱中继续培养；
2)收集的上清1500g离心30min，取上清，用0.45μm滤器过滤后4℃待用。
第四天：
1)72h后分别进行第二次收集，小心收集上清12ml，并换上12mLDMEM+10％FBS的含抗生素新鲜复温的培养基换液。沿培养皿壁缓慢加入。放入培养箱中继续培养；
2)收集的上清1500g离心30min，取上清，用0.45μm滤器过滤后4℃待用。
3)合并第一、二次收集的上清，Amicon Ultra-15100k超滤管超滤浓缩，5000g 1h。收集慢病毒浓缩液(根据第一天步骤3)中的2个EP管A，本步骤所获得的慢病毒浓缩液相应分为2种，分别为空载慢病毒浓缩液以及CCR2a慢病毒浓缩液。小量分装后-80℃保存。
2.2 TIL细胞慢病毒感染
1)将2种慢病毒浓缩液从-80℃冰箱拿出，放在冰上使其缓慢融化；
2)将肺癌、黑色素瘤、宫颈癌病人的肿瘤组织块酶解分离，并采用IL-2进行初培扩增放大，初培后获得的TIL细胞离心计数，用AIM-V+10％AB血清+双抗的完全培养基重悬并调整细胞密度为1×106/mL，于24孔板每孔铺1mL细胞悬液；
3)2种慢病毒分别以MOI＝10的比例感染TIL细胞，即每个细胞对应10个慢病毒，则每孔慢病毒需要1×107IU。根据病毒滴度计算出每种病毒所需要的体积，分别加到TIL细胞中，留出一孔不加病毒的TIL细胞作为对照，然后每孔加入1μLpolybrene(10mg/mL)储存液(polybrene终浓度为10μg/mL)，吹打混匀；
4)用封口膜将24孔板封口，置于水平离心机中，32℃1800rpm离心1h，以促进感染效率。离心后撕掉封口膜，在37℃细胞培养箱培养；
5)24h后进行换液，收集细胞离心，病毒上清可回收再次使用，使用1mL的AIM-V+10％AB血清+双抗完全培养基重悬细胞，放置24孔板中继续培养；
6)感染48h后取少量细胞，流式检测感染效率，其余细胞可用于后继实验。
2.3转病毒后的TIL细胞的扩增及培养
1)TIL细胞完成慢病毒转导后，分别于第3、5天更换含有IL-23000U/mL的新鲜培养基，扩大培养调整细胞浓度为1×106/mL，分别培养转入病毒的TIL及对照TIL细胞；
2)第6天时，更换为新鲜AIM-V+10％AB血清+双抗的完全培养基，使T细胞静息24h；
3)第7天时，流式检测过表达细胞的过表达蛋白表达水平，以及转导效率，结果如图3所示。
通过图3可以看出，通过转导慢病毒，使TIL在原有基础上进一步提升了其CCR2的外源性表达，从而相对于对照组而言，具有更高的CCR2表达量，即实现了TIL的CCR2过表达。
2.4按照2.1-2.3同样的步骤，制备CCR2b慢病毒浓缩液。
实施例3
CCR2a与CCR2b过表达杀伤效果验证实验，步骤如下：
3.1代号NL供者的HLA-A，分型结果为A*11:01/A*33:03，HCC827为HLA*A位点A*11:01/A*11:01纯合子；NL外周血分离获得的PBMC，磁珠分选CD8+细胞，并将分选细胞悬液离心计数，用AIM-V+10％AB血清+双抗完全培养基重悬并调整细胞密度为1×106/mL，于24孔板每孔铺1mL细胞悬液，添加OKT3 anti-CD3单抗100ng/mL，IL-21000U/mL过夜。
3.2将实施例2制备得到的CCR2a慢病毒浓缩液和CCR2b慢病毒浓缩液从-80℃冰箱拿出，放在冰上使其缓慢融化。
3.3慢病毒以MOI＝10的比例感染PBMC细胞，即每个细胞对应10个病毒，则每孔病毒需要1×107个。根据病毒滴度计算出每种病毒所需要的体积，分别加到PBMC细胞中，留出一孔不加病毒的T细胞作为对照，用1640+10％AB血清+双抗完全培养基补至1mL，然后每孔加入1μLpolybrene(8mg/mL)储存液，吹打混匀；在37℃细胞培养箱培养，实验分组和病毒感染复数情况如表2所示。
表2
组1 组2 组3 组4
病毒 CCR2a CCR2b 空载病毒 无
MOI 10 10 10 0
3.4感染48h后取少量细胞，流式检测GFP表达评价感染效率，其余细胞可用于后继实验。
3.5 HCC827细胞按1×105/mL的浓度铺种6孔板，HCC827细胞与NL CD8+细胞混合前，弃去上清，再加入1mL 1640培养基、10％FBS、双抗、1×谷氨酰胺。HCC827细胞消化一孔计数，即为起始的HCC827细胞数。
3.6 CCR2a、CCR2b过表达的CD8+T细胞或空载细胞(组1-组4)，与处理过的HCC827肿瘤细胞系按1:1效靶比加入，培养基采用1640培养基、10％FBS、双抗、1×谷氨酰胺，终体积2mL。再加入IL-21000U/mL。然后置于37℃、5％CO2浓度的培养箱内培养处理48h。
3.7流式分析CD45、CD3在不同类群细胞上的表达情况，重点分析CD45-HCC827肿瘤细胞杀伤情况。收集上清ELISA检测IFN-γ浓度，结果如图4和图5所示。
图4和图5的结果显示，CCR2a比较CCR2b过表达后显著提高了对肿瘤靶细胞的杀伤能力，具有最高的杀伤率以及IFN-γ释放水平，具有最高的IFN-γ浓度。表明CCR2a虽然不是常见的生理性表达CCR2变体，但比较常见的CCR2b其过表达后抗肿瘤效果会更好。因此以下均选用CCR2a进行过表达，并开展相关验证实验(实施例4-6中的CCR2均指的是CCR2a)。
实施例4
CCR2过表达添加重组CCL2效果验证迁移效果验证，步骤如下：
4.1将PBMC细胞悬液细胞离心计数，用AIM-V+10％AB血清+双抗完全培养基重悬并调整细胞密度为1×106/mL，于24孔板每孔铺1mL细胞悬液，添加CD3单抗100ng/mL，IL-21000U/mL过夜。
4.2将实施例2制备得到的CCR2a慢病毒浓缩液从-80℃冰箱拿出，放在冰上使其缓慢融化。
4.3慢病毒以MOI＝10的比例感染PBMC细胞，即每个细胞对应10个病毒，则每孔病毒需要1×107个。根据病毒滴度计算出每种病毒所需要的体积，分别加到PBMC细胞中，留出一孔不加病毒的T细胞作为对照，用1640+10％AB血清+双抗完全培养基补至1mL，然后每孔加入1μLpolybrene(10mg/mL)储存液，吹打混匀；在37℃细胞培养箱培养，实验分组和病毒感染复数情况如表3所示。
表3
组1 组2 组3
病毒 CCR2a 空载病毒 无
MOI 10 10 0
4.4感染48h后取少量细胞，流式检测GFP表达评价感染效率，其余细胞可用于后继实验。
4.5采用Costar Transwell培养板(孔直径6.5mm,孔尺寸5μm,聚碳酸酯膜)，慢病毒感染后细胞以5×105每孔加入上层小室，下层AIM-V+10％AB血清+双抗完全培养基添加重组CCL2蛋白100ng/mL。在培养4h后收集下层细胞。流式检测流式分析：GFP、CCR2、CD3、CD4、CD8、7-AAD各群细胞的比例和数量，结果如图6-12所示。
其中，通过图6可以看出，PBMC在添加CD3单抗和IL-2刺激后，CD3+细胞CCR2a表达水平显著提高。但是CCR2a慢病毒过表达进一步显著提高了PBMC中CD3+细胞CCR2a的表达水平，并显著提高了其迁移能力。
图7示出了慢病毒转染后GFP+细胞在各组中占CD3+细胞的百分比。过表达组显著高于其他各组。
图8示出了慢病毒转染后GFP+CCR2a+细胞在各组中占CD3+细胞的百分比。过表达组显著高于其他各组。
图9示出了transwell CD3+迁移细胞占活细胞百分比，可以看出，CCR2a过表达组显著高于其他各组。
图10示出了GFP阳性细胞在transwell活的CD3+迁移细胞中所占比例，可以看出，CCR2a过表达组显著高于空载组。
图11示出了GFP+CCR2+阳性细胞在transwell活的CD3+迁移细胞中所占比例，CCR2a过表达组显著高于空载组。
图12示出了GFP+CCR2+阳性细胞在transwell活的CD3+GFP+细胞中所占比例，CCR2a过表达组高达92％，也显著高于空载组。
实施例5
CCR2过表达添加重组CCL2蛋白效果验证迁移效果验证，步骤如下：
5.1将2个不同批次的PBMC细胞悬液细胞离心计数，用AIM-V+10％AB血清+双抗完全培养基重悬并调整细胞密度为1×106/mL，于24孔板每孔铺1mL细胞悬液，添加CD3单抗100ng/mL，IL-21000U/mL过夜。
5.2将实施例2制备得到的CCR2a慢病毒浓缩液从-80℃冰箱拿出，放在冰上使其缓慢融化。
5.3病毒以MOI＝10的比例感染PBMC细胞，即每个细胞对应10个病毒，则每孔病毒需要1×107个。根据病毒滴度计算出每种病毒所需要的体积，分别加到PBMC细胞中，留出一孔不加病毒的T细胞作为对照，用AIM-V+10％AB血清+双抗完全培养基补至1mL，然后每孔加入1μLpolybrene(8mg/mL)储存液，吹打混匀；在37℃细胞培养箱培养，实验分组和病毒感染复数情况如表4所示。
表4
组1 组2 组3
病毒 CCR2a 空载病毒 无
MOI 10 10 0
5.4感染48h后取少量细胞，流式检测GFP表达评价感染效率，其余细胞可用于后继实验。
5.5采用CostarTranswell培养板(孔直径6.5mm,孔尺寸5μm,聚碳酸酯膜)，慢病毒感染后细胞以5×105每孔加入上层小室，下层AIM-V+10％AB血清+双抗完全培养基添加重组CCL2蛋白100ng/mL。在培养4h后收集下层细胞。流式检测流式分析：GFP、CCR2、CD3、CD4、CD8、7-AAD各群细胞的比例和数量，结果如图13和14所示。
图13示出了其中一个批次的PBMC，实验后GFP+CCR2a+阳性细胞在transwell活的CD3+GFP+细胞中所占比例，CCR2a过表达组高达87.2％，显著高于空载组和对照组。
图14示出了另一个批次的PBMC，实验后GFP+CCR2a+阳性细胞在transwell活的CD3+GFP+细胞中所占比例，CCR2a过表达组高达95％，也显著高于空载组。因此，结果表明，不同批次的PBMC中的T细胞CCR2a过表达后，均显著提高了其迁移能力，在添加了CCL2的微环境中更为明显。
实施例6
小鼠模型上进一步验证TIL细胞CCR2a过表达后的效果，步骤如下：
6.1 MC38小鼠模型
小鼠结肠癌细胞系MC38可在DMEM全培养基中贴壁生长，每隔2-3天按1:6传代。接种肿瘤前，用0.05％Trypsin/EDTA于37℃消化处于指数生长期的MC38约5分钟，加入全培养基终止消化，用移液枪上下吹打使其成为单细胞悬液，1500rpm离心5分钟后，移除上清并加入10mLPBS溶液，如此重复两次后，将MC38重悬于适量PBS溶液，取10μL稀释并与台盼蓝混合进行活细胞计数，根据计数结果用PBS将MC38稀释至3×106/mL。取8-12周龄野生型C57BL/6雌鼠，剃去小鼠背部右上侧的毛发，用酒精棉球擦拭暴露的皮肤，皮下注射3×105的MC38细胞100μL。注射肿瘤细胞5天后每2-3天测量肿瘤的长度和宽度并计算肿瘤的体积(肿瘤体积＝长×宽2/2)。
6.2小鼠TIL的分离
颈脱臼处死MC38荷瘤小鼠后，用剪刀和镊子取皮下肿瘤，将肿瘤剪碎后于含1mg/mL胶原酶I、10U/mLDNase I的全培养基中消化40分钟(25℃，200rpm)，加入低温全培养基终止消化，转移到孔径为100μm的细胞筛网(BD)上研磨，制备成单细胞悬液，转移到15mL离心管中，1700rpm离心5分钟，弃上清，重悬于5mL40％Percoll，用移液枪吸取5.5mL70％Percoll，将移液管伸至离心管底部，缓慢加入5mL70％Percoll，注意不要扰乱40％Percoll和70％Percoll之间的界面，2500rpm离心30分钟(升速0，降速0)，移除顶部细胞碎片或死细胞，将中间层细胞转移到新离心管中，用PBS洗两次，重悬于PBS中并进行细胞计数。
6.3小鼠TIL细胞的培养扩增
TIL起始量：1×106cell/ml，24孔板中每个孔添加1ml，并添加3000U/mLmIL-2，50ng抗-mCD3单抗，0.5μg/mL 4-1BB单抗(R&DAF937)。在第四天第一次补液，后期每2-3天，补液调整细胞密度至1×106个/ml。扩增1-2周至细胞数达到45×106，活率95％以上停止进行培养。
6.4治疗分组及疗效观察
CD45.1 MC38肺癌小鼠模型构建：将MC38重悬于适量PBS溶液，取10μL稀释并与台盼蓝混合进行活细胞计数，根据计数结果用PBS将MC38稀释至3×106/mL。取8-12周龄CD45.1 C57BL/6雌鼠，剃去小鼠背部右上侧的毛发，用酒精棉球擦拭暴露的皮肤，皮下注射3×106的MC38细胞100μL。注射肿瘤细胞5天后每2-3天测量肿瘤的长度和宽度并计算肿瘤的体积(肿瘤体积＝长×宽2/2)。
6.5治疗分组
CD45.1 MC38肺癌小鼠模型于注射肿瘤细胞4天后，治疗前24h 5Gy亚致死剂量辐照进行清淋，并喂饲酸水(PH3.0)，SPF动物房饲养。小鼠TIL细胞采用流式分选CCR2a-细胞，其中CCR2a-采用慢病毒进行过表达，构建CCR2OE TIL细胞，实验分组情况如表5所示。
表5
组别 条件 小鼠
PBS对照组 100μl/只 CD45.2MC38结肠癌小鼠模型
CCR2a<sup>-</sup>TIL组 1×10<sup>6</sup>细胞/100μl/只 CD45.2MC38结肠癌小鼠模型
CCR2a<sup>OE</sup>TIL组 1×10<sup>6</sup>细胞/100μl/只 CD45.2MC38结肠癌小鼠模型
治疗采用从尾静脉注射CD45.2来源的TIL细胞，细胞数量为1×106/只，对照组小鼠从尾静脉注射等体积的溶媒PBS。随后立即对小鼠腹腔注射第一剂IL-2，1.5×105IU/只。之后每12小时注射等剂量的IL-2，共6次。
6.6肿瘤体内疗效观察
治疗试验过程中，每隔一天用游标卡尺测量荷瘤小鼠的肿瘤的长径和短径以计算荷瘤小鼠的肿瘤体积；治疗2周之后，每隔一周游标卡尺记录小鼠的肿瘤长径和短径以计算小鼠肿瘤体积大小。共记录4周的数据值。整个试验结束之后，绘制肿瘤增长曲线图以及小鼠生存曲线图，评价疗效，以确定疗效标准。
6.7TIL流式分析检测
分别于TIL细胞注射后的(1天、4天、7天、14天)采集小鼠外周血，流式检测CD45.2阳性的细胞数量，研究TIL细胞在小鼠血液中的增殖与存续。在TIL细胞注射后的(4天、7天、14天)每组取3只，动物颈脱臼处死后取脾脏、淋巴结、胸腺、肝脏、肾脏、肺和肿瘤组织，消化后制成单细胞悬液流式分析细胞表型：CD45.2-PE、CD45.1-FITC、CD3-PE-Cy5、CD8-APC-Cy7、CD4-Pacific Blue。评价CD45.2回输细胞免疫浸润情况。
6.8.结果
CCR2-TIL细胞过表达CCR2a后在小鼠MC38模型中显著抑制了肿瘤的生长。皮下注射MC38细胞成瘤，并尾静脉注射相应细胞，每2天监测肿瘤生长。每组包含3只小鼠，**P<0.01；数据表示为：平均数±方差。结果如图15-17所示。
图15示出了小鼠不同类型TIL细胞对小鼠MC38肿瘤成瘤的抑制效果。表明CCR2-TIL细胞过表达CCR2后在小鼠MC38模型中进一步显著抑制了肿瘤的生长。
图16示出了小鼠MC38肿瘤消化成单细胞悬液后的流式分析结果。表明CCR2-TIL细胞过表达CCR2后在小鼠MC38肿瘤组织中其CD3+细胞比例明显高于未过表达的对照。
图17示出了小鼠MC38肿瘤消化成单细胞悬液后的流式分析结果的统计图。表明CCR2-TIL细胞过表达CCR2后在小鼠MC38肿瘤组织中其CD3+细胞比例显著高于未过表达的对照。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 青岛华赛伯曼医学细胞生物有限公司
<120> 过表达CCR2的免疫细胞及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1125
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgctgtcca catctcgttc tcggtttatc agaaatacca acgagagcgg tgaagaagtc 60
accacctttt ttgattatga ttacggtgct ccctgtcata aatttgacgt gaagcaaatt 120
ggggcccaac tcctgcctcc gctctactcg ctggtgttca tctttggttt tgtgggcaac 180
atgctggtcg tcctcatctt aataaactgc aaaaagctga agtgcttgac tgacatttac 240
ctgctcaacc tggccatctc tgatctgctt tttcttatta ctctcccatt gtgggctcac 300
tctgctgcaa atgagtgggt ctttgggaat gcaatgtgca aattattcac agggctgtat 360
cacatcggtt attttggcgg aatcttcttc atcatcctcc tgacaatcga tagatacctg 420
gctattgtcc atgctgtgtt tgctttaaaa gccaggacgg tcacctttgg ggtggtgaca 480
agtgtgatca cctggttggt ggctgtgttt gcttctgtcc caggaatcat ctttactaaa 540
tgccagaaag aagattctgt ttatgtctgt ggcccttatt ttccacgagg atggaataat 600
ttccacacaa taatgaggaa cattttgggg ctggtcctgc cgctgctcat catggtcatc 660
tgctactcgg gaatcctgaa aaccctgctt cggtgtcgaa acgagaagaa gaggcatagg 720
gcagtgagag tcatcttcac catcatgatt gtttactttc tcttctggac tccctataat 780
attgtcattc tcctgaacac cttccaggaa ttcttcggcc tgagtaactg tgaaagcacc 840
agtcaactgg accaagccac gcaggtgaca gagactcttg ggatgactca ctgctgcatc 900
aatcccatca tctatgcctt cgttggggag aagttcagaa gcctttttca catagctctt 960
ggctgtagga ttgccccact ccaaaaacca gtgtgtggag gtccaggagt gagaccagga 1020
aagaatgtga aagtgactac acaaggactc ctcgatggtc gtggaaaagg aaagtcaatt 1080
ggcagagccc ctgaagccag tcttcaggac aaagaaggag cctag 1125

Claims (10)

1.一种免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞过表达CCR2。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述CCR2为CCR2a和/或CCR2b。
3.根据权利要求2所述的免疫细胞，其特征在于，编码所述CCR2a的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞为T细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、树突状细胞中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的免疫细胞，其特征在于，所述T细胞为肿瘤浸润淋巴细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、嵌合抗原受体T细胞或自然杀伤T细胞。
6.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1-5任一项所述的免疫细胞。
7.权利要求1-5任一项所述的免疫细胞或权利要求6所述的药物组合物在制备免疫治疗产品中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述免疫治疗产品用于预防或治疗肿瘤。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述肿瘤表达CCL2。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为肺癌、宫颈癌、黑色素瘤、胃癌和/或乳腺癌。
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