CN113599302A - 红藻多糖作为神经酰胺表达促进剂的用途及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种红藻多糖作为神经酰胺表达促进剂的用途及其制备方法。该红藻多糖的分子量小于等于100kDa。红藻多糖能够诱导神经酰胺合成代谢途径所涉及主要酶的表达作用，从而增加相关酶的活性，达到提高神经酰胺在细胞内的含量的效果。因此，采用红藻多糖制备的具有神经酰胺调控作用的化妆品或者皮肤外用药物涂抹于皮肤，能够促进皮肤屏障修复，抑制皮肤中炎症因子表达。该红藻多糖的制备方法利用亚临界提取联合酶水解处理的工艺，能够精准控制所得红藻多糖的分子量大小。该制备方法相比于传统热水提取或者亚临界提取工艺，能够提高红藻多糖的提取率，能够制备得到分子量小于等于100kDa的红藻多糖，能够提高红藻多糖的重金属脱除率。
Description
技术领域
本发明涉及皮肤修复养护技术领域，特别是涉及红藻多糖作为神经酰胺表达促进剂的用途及其制备方法。
背景技术
神经酰胺是生物膜双层中鞘磷脂分解产物，是公认的第二信使。神经酰胺广泛参与到多种细胞因子、维生素D3、Fas及CD28配体等诱导生物效应中。神经酰胺在细胞内能够诱导细胞凋亡、诱导细胞分化以及抑制细胞增殖，因而能够对起因于细胞的增殖或分化异常的长期炎症、恶性肿瘤等疾病对症治疗。
神经酰胺占皮肤最外侧角质层中脂质的一半以上，对皮肤的屏障结构发挥着重要的保护作用。皮肤角质层缺少神经酰胺，会造成皮肤屏障损伤，引发皮肤干燥、皲裂、特应性皮炎、老年性干燥症、干癣等系列皮肤疾病。
目前，天然的、能够促进神经酰胺表达的物质应用较少，体外从头合成神经酰胺的价格昂贵，再加上外用神经酰胺发挥的效果有限，因此，开发出能够促进人体自身合成神经酰胺的产品是神经酰胺研究的热点之一。开发性能优良的神经酰胺表达促进剂及其制备方法在医学、保健和美容护肤等领域均有迫切需求。
发明内容
本发明的第一个目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种红藻多糖作为神经酰胺表达促进剂的用途。该红藻多糖为小分子量红藻多糖，具有促进神经酰胺表达、提高皮肤细胞中神经酰胺含量的作用，可应用于修复皮肤屏障损伤，使皮肤保持健康。
本发明的上述目的通过以下技术措施实现。
提供一种红藻多糖作为神经酰胺表达促进剂的用途。
进一步的，提供一种上述红藻多糖在制备具有神经酰胺调控作用的化妆品或者皮肤外用药物中的用途。
再进一步的，提供一种上述红藻多糖在制备通过调控神经酰胺促进皮肤屏障修复的化妆品或者皮肤外用药物中的用途；或者上述红藻多糖在制备通过调控神经酰胺实现抑制炎症因子表达的化妆品或者皮肤外用药物中的用途。
优选的，上述红藻多糖的分子量小于等于100kDa。
更优选的，上述红藻多糖的分子量以Z表示，(2.0～5.0)kDa≤Z≤50kDa。
具体的，上述红藻多糖通过亚临界提取结合酶水解方法制备而成。
更具体的，上述红藻多糖的具体制备工艺是：
将红藻匀浆液投入亚临界提取釜中进行亚临界提取，过滤并收集分子量小于等于100kDa的红藻多糖提取液A备用，并将截留得到的分子量大于100kDa的红藻多糖提取液B进行酶水解处理得到分子量小于等于100kDa的红藻多糖提取液C。
再将红藻多糖提取液A和红藻多糖提取液C混合，经吸附、过滤、浓缩、醇沉、干燥处理得到分子量小于等于100kDa的固体粉末状红藻多糖。
优选的，上述红藻多糖通过如下步骤制备：
S1，将红藻干制品粉碎，用乙醇进行脱脂处理，得到脱脂红藻；
S2，向步骤S1制得的脱脂红藻中加入去离子水，经浸泡、研磨工序，制备红藻匀浆液；
S3，将步骤S2制得的红藻匀浆液投入亚临界提取釜中进行亚临界提取；
提取完毕后，过滤并收集分子量小于等于100kDa的红藻多糖提取液A，备用；
将截留得到的分子量大于100kDa的红藻多糖提取液B按步骤S4进行处理；
S4，将步骤S3得到的红藻多糖提取液B转移至反应釜中，加入水解酶溶液进行酶解处理；酶解完毕后，进行热水提取；提取完毕后，利用分子筛过滤并收集分子量小于等于100kDa的红藻多糖提取液C，备用；
S5，将红藻多糖提取液A和红藻多糖提取液C混合，加入大孔吸附树脂进行吸附处理，然后过滤，收集滤液，备用；
S6，将步骤S5收集的滤液浓缩至相对密度在1.10g/cm3～1.30g/cm3为止，加入乙醇，搅拌均匀，静置沉淀；
所得红藻多糖沉淀物经干燥处理后，得到分子量小于等于100kDa的固体粉末状红藻多糖。
优选的，上述步骤S3的亚临界提取温度为120℃～170℃，压力为2.5Mpa～3.5Mpa，提取时间为0.5h～1.5h。
优选的，上述步骤S4具体包括：
S41，将步骤S3得到的分子量大于100kDa的红藻多糖提取液转移至反应釜中，按照水解酶的质量是红藻多糖提取液B质量的，并调节反应釜中混合液的pH值范围至4.5～6.0，在50℃～60℃的温度下，水解1h～4h；
S42，将反应釜升温至95℃～105℃，继续提取0.5h～1.5h；
S43，将反应釜中混合液经300目分子筛过滤，收集滤液，备用。
优选的，上述步骤S41中，所述水解酶由纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶、异淀粉酶、β-(1→3)葡聚糖水解酶中的至少三种水解酶组成。
优选的，上述步骤S5中，每100ml混合滤液加入2g～10g大孔吸附树脂，所述大孔吸附树脂的孔径范围在30目～100目，所述大孔吸附树脂为中极性至强极性树脂。
优选的，上述步骤S6中，所述干燥方式为冷冻干燥、真空干燥或者鼓风干燥中的其中一种。
本发明利用分子量小于等于100kDa的红藻多糖作为神经酰胺表达促进剂。分子量小于等于100kDa的红藻多糖能够促进神经酰胺的表达，当以具有该成分的化妆品或者皮肤外用药物涂抹于皮肤，能够诱导神经酰胺合成代谢途径所涉及主要酶的表达，增加相关酶的活性，从而提高神经酰胺在细胞内的含量。
本发明的第二个目的在于提供一种红藻多糖的制备方法。该制备方法利用亚临界提取联合酶水解处理的工艺，对红藻原料的提取率高，能够得到分子量小于等于100kDa的红藻多糖。
本发明的上述目的通过以下技术措施实现。
提供一种红藻多糖的制备方法，具体步骤如下：
S1，将红藻干制品粉碎，用乙醇进行脱脂处理，得到脱脂红藻；
S2，向步骤S1制得的脱脂红藻中加入去离子水，经浸泡、研磨工序，制备红藻匀浆液；
S3，将步骤S2制得的红藻匀浆液投入亚临界提取釜中进行亚临界提取；
提取完毕后，过滤并收集分子量小于等于100kDa的红藻多糖提取液A，备用；
将截留得到的分子量大于100kDa的红藻多糖提取液B按步骤S4进行处理；
S4，将步骤S3得到的红藻多糖提取液B转移至反应釜中，加入水解酶溶液进行酶解处理；酶解完毕后，进行热水提取；提取完毕后，利用分子筛过滤并收集分子量小于等于100kDa的红藻多糖提取液C，备用；
S5，将红藻多糖提取液A和红藻多糖提取液C混合，加入大孔吸附树脂进行吸附处理，然后过滤，收集滤液，备用；
S6，将步骤S5收集的滤液浓缩至相对密度在1.10g/cm3～1.30g/cm3为止，加入乙醇，搅拌均匀，静置沉淀；
所得红藻多糖沉淀物经干燥处理后，得到分子量小于等于100kDa的固体粉末状红藻多糖。
优选的，上述步骤S3的亚临界提取温度为120℃～170℃，压力为2.5Mpa～3.5Mpa，提取时间为0.5h～1.5h。
优选的，上述步骤S4具体包括：
S41，将步骤S3得到的分子量大于100kDa的红藻多糖提取液转移至反应釜中，按照水解酶的质量是红藻多糖提取液B质量的，并调节反应釜中混合液的pH值范围至4.5～6.0，在50℃～60℃的温度下，水解1h～4h；
S42，将反应釜升温至95℃～105℃，继续提取0.5h～1.5h；
S43，将反应釜中混合液经300目分子筛过滤，收集滤液，备用。
优选的，上述步骤S41中，所述水解酶由纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶、异淀粉酶、β-(1→3)葡聚糖水解酶中的至少三种水解酶组成。
优选的，上述步骤S5中，每100ml混合滤液加入2g～10g大孔吸附树脂，所述大孔吸附树脂的孔径范围在30目～100目，所述大孔吸附树脂为中极性至强极性树脂。
优选的，上述步骤S6中，所述干燥方式为冷冻干燥、真空干燥或者鼓风干燥中的其中一种。
本发明的红藻多糖制备方法对比传统热水提取工艺或者传统亚临界提取工艺，红藻多糖的提取率更高。提取过程中使用的试剂环保安全，对环境友好，对人体无害。本发明的提取方法利用亚临界提取联合酶水解处理的工艺，能获得分子量小的红藻多糖。经由本发明的方法制得的红藻多糖具有分子量低，可达到小于等于100kDa的水平，相比于大分子量红藻多糖更有利于人体的吸收利用。该红藻多糖生物活性高，相比大分子量红藻多糖能更充分发挥红藻多糖促进神经酰胺表达的作用。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步说明。
[实施例1]
本实施例提供一种红藻多糖作为神经酰胺表达促进剂的用途。该红藻多糖为小分子量红藻多糖，其分子量小于等于100kDa，具有促进神经酰胺表达，提高皮肤细胞中神经酰胺含量的作用，可修复皮肤屏障损伤，保持皮肤健康。优选的，该红藻多糖的分子量为(2.0～5.0)kDa至50kDa。需要说明的是，本发明中所说的分子量均为重均分子量。
本发明的小分子量红藻多糖作为一种促进剂，能够诱导神经酰胺合成代谢途径所涉及主要酶的表达，增加相关酶的活性，从而提高神经酰胺在细胞内的含量。
[实施例2]
本实施例公开了红藻多糖在制备具有神经酰胺调控作用的化妆品或者皮肤外用药物中的用途。本发明的红藻多糖分子量低，分子量小于等于100kDa，优选红藻多糖的分子量小于等于50kDa。该红藻多糖为易溶于水的固体粉末，与各类化妆品或者皮肤外用药物辅料的配伍性好，能够方便地制备各类剂型的化妆品或者皮肤外用药物。其中，化妆品的剂型包括但不限于膏霜乳(膏、霜、蜜、脂、乳、乳液、奶、奶液)、液体(露、液、水、油、油水分离)、凝胶(啫喱、胶)、粉剂(散粉、颗粒)、块状(块状粉、大块固体)、泥(泥状固体)、蜡基、喷雾剂、气雾剂、贴/膜(含基材)、冻干(冻干粉、冻干片)等。皮肤外用药物的剂型包括但不限于外用溶液、洗剂、搽剂、硬膏剂、糊剂、贴剂等。需要说明的是，本发明中所说的分子量均为重均分子量。
本发明中的红藻多糖作为一种促进剂，当以具有该成分的化妆品或者皮肤外用药物涂抹于皮肤，能够诱导神经酰胺合成代谢途径所涉及主要酶的表达，增加相关酶的活性，从而提高神经酰胺在细胞内的含量。
由于神经酰胺是皮肤角质层最外侧皮脂的主要组成部分，补充皮肤细胞中的神经酰胺，能够修复皮肤屏障损伤。将本发明的红藻多糖外用于皮肤，能够明显提高皮肤细胞中神经酰胺含量，从而有效改善皮肤干燥、皲裂、老年性干燥症、干癣等系列皮肤不适。同时，神经酰胺还具有抑制炎症因子分泌的功能，因此，利用本发明的红藻多糖提高皮肤细胞中神经酰胺含量，能够缓解特应性皮炎等皮肤炎症引发的不适。
本实施例的红藻多糖，可用于制备通过调控神经酰胺促进皮肤屏障修复的化妆品或者皮肤外用药物。由于红藻多糖能够增加皮肤中神经酰胺的含量，相应含有本实施例红藻多糖的化妆品或者皮肤外用药物，也具有促进皮肤屏障修复的效果。
本实施例的红藻多糖，可用于制备通过调控神经酰胺实现抑制炎症因子表达的化妆品或者皮肤外用药物。由于红藻多糖能够增加皮肤中神经酰胺的含量，相应含有本实施例红藻多糖的化妆品或者皮肤外用药物，也具有抑制炎症因子表达的效果。
[实施例3]
本实施例提供一种制备分子量小于等于100kDa的小分子量红藻多糖的方法，可用来制备具有如实施例1或2的用途的小分子量红藻多糖，包括以下步骤：
S1，将红藻干制品粉碎，用乙醇进行脱脂处理，得到脱脂红藻。
具体过程是，将红藻干制品粉碎成60目～100目的细粉。取红藻细粉，加入5～10倍量无水乙醇萃取4h～12h，过滤并挥去多余乙醇，所得滤渣备用。
在本实施例中，所使用的红藻干制品是产自中国山东荣成的江蓠。需要说明的是，本发明的红藻干制品除了本实施例的山东荣成出产的江蓠外，还可为市售石花菜、紫菜、红毛藻、粘管藻、海萝、海头红、多管藻、蜈蚣藻、鹧鸪菜、海索面、鸡毛藻中的一种或多种。本领域技术人员可以根据实际需要选用其它红藻干制品，此处不再一一举例。需要说明的是，红藻干制品的使用量要视乎实际生产规模而定，此处不作限制。
S2，将步骤S1制得的脱脂红藻加入去离子水，经浸泡、研磨工序，制备得到红藻匀浆液。
具体过程是，将步骤S1制得的脱脂红藻按料液比为1:20～1:40的比例加入去离子水，浸泡15min～40min，然后过胶体磨研磨处理10min，即得到红藻匀浆液，备用。
S3，将步骤S2制得的红藻匀浆液投入亚临界提取釜中进行亚临界提取。提取完毕后，利用分子筛过滤并收集分子量小于等于100kDa的红藻多糖提取液A，备用。将截留得到的分子量大于100kDa的红藻多糖提取液B按步骤S4进行处理。
亚临界提取的具体参数是，提取温度为120℃～170℃，压力为2.5Mpa～3.5Mpa，提取时间为0.5h～1.5h。亚临界提取能够充分破坏红藻植物体结构，使红藻多糖更多地溶出到提取液中。
截留分子量大于100kDa的红藻多糖提取液B是为了进一步分解红藻植物体，使红藻多糖更多地溶出到提取液中，提高红藻植物体的利用率。
S4，将步骤S3得到的红藻多糖提取液B转移至反应釜中，加入水解酶溶液进行酶解处理。酶解完毕后，进行热水提取。提取完毕后，利用分子筛过滤并收集分子量小于等于100kDa的红藻多糖提取液C，备用。
具体过程是：
S41，将步骤S3得到的分子量大于100kDa的红藻多糖提取液转移至反应釜中，按照水解酶的质量是红藻多糖提取液B质量的，并调节反应釜中混合液的pH值范围至4.5～6.0，在50℃～60℃的温度下，水解1h～4h。
S42，将反应釜升温至95℃～105℃，继续提取0.5h～1.5h。
S43，将反应釜中混合液经300目分子筛过滤，收集滤液，备用。
红藻植物体的细胞壁分两层，内层由纤维素组成，外层由果胶质组成。贮藏养分为红藻淀粉(floridean starch)或红藻糖(floridose)。因此，针对红藻植物体的结构和组分，步骤S41使用的水解酶由纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶、异淀粉酶、β-(1→3)葡聚糖水解酶中的至少三种水解酶组成。优选复配的水解酶中各种酶的质量相同。复配的水解酶能够有效水解红藻植物体中的纤维素、果胶、蛋白质和淀粉等组分，使大分子量的红藻多糖提取液进一步分解，达到充分利用红藻植物体的目的，提高小分子量红藻多糖的提取率。本实施例可以使用安徽沐康品牌的纤维素酶(食品级，有效物质含量98％，酶活力2万～10万，酶活力保存率99％)，安徽沐康品牌的果胶酶(食品级，有效物质含量98％，酶活力3万，酶活力保存率99％)，杭州科田品牌的胰蛋白酶(食品级，有效物质含量99％，酶活力4000U/g，酶活力保存率99％)，安徽沐康品牌的木瓜蛋白酶(食品级，有效物质含量99％，酶活力2万～20万，酶活力保存率99％)，南宁庞博品牌的α-淀粉酶(食品级，有效物质含量99％，酶活力1万U/g，酶活力保存率99％)，湖南世纪华星品牌的异淀粉酶(食品级，有效物质含量99％，酶活力10万U/g，酶活力保存率99％)，南宁庞博品牌的β-(1→3)葡聚糖水解酶(食品级，有效物质含量99％，酶活力5000U/g，酶活力保存率99％)。本领域技术人员也可以根据实际需要选用市售的酶制剂，此处不再一一举例。
S5，将红藻多糖提取液A和红藻多糖提取液C混合，按每100ml混合滤液加入2g～10g大孔吸附树脂进行吸附处理8h～24h，然后过滤，收集滤液，备用。
本发明使用大孔吸附树脂能够吸附混合滤液中的大分子杂质，使小分子量红藻多糖能够保留在溶液中，达到良好的分离效果，提高小分子量红藻多糖获得率。本发明选用孔径范围在30目～100目，极性为中极性至强极性的大孔吸附树脂。需要说明的是，大孔吸附树脂应根据杂质和目标产物分子量的不同选择型号使用。本发明可以选用D101型、D401型、D402型、D001型或者AB-8型中的其中一种大孔吸附树脂。本领域技术人员也可以根据实际需要选用其它型号的大孔吸附树脂，此处不再一一举例。
S6，将步骤S5收集的滤液以65℃真空减压浓缩至相对密度在1.10g/cm3～1.30g/cm3为止。再往滤液中加入无水乙醇，使混合溶液中的乙醇含量达到80％，搅拌均匀后，静置沉淀8h～24h后除去乙醇水。所得红藻多糖沉淀物经冷冻干燥、真空干燥或者鼓风干燥中的一种干燥处理后，得到分子量小于等于100kDa的固体粉末状红藻多糖。
本发明的红藻多糖制备方法对比传统热水提取工艺或者传统亚临界提取工艺，红藻多糖的提取率更高。提取过程中使用的试剂环保安全，对环境友好，对人体无害。本发明的提取方法利用亚临界提取联合酶水解处理的工艺，能够精准控制所得红藻多糖的分子量大小。经由本发明的红藻多糖制备方法制得的红藻多糖具有分子量低，可达到小于等于100kDa的水平，相比于大分子量红藻多糖更有利于人体吸收利用。该红藻多糖生物活性高，相比大分子量红藻多糖更加充分发挥红藻多糖促进神经酰胺表达的作用。该红藻多糖具有重金属含量低、产品质量好的优势。
此外，红藻多糖的制备原料海洋红藻种类繁多，资源丰富，因此使用海洋红藻制备红藻多糖原料成本低，经济效益好，能够大幅降低应用神经酰胺药理作用制剂的生产成本。
[实施例4]
一种制备分子量小于等于100kDa的小分子量红藻多糖的方法，其它步骤等特征与实施例3相同，不同之处在于，本实施例具体采用如下参数制备：
S1，将红藻干制品粉碎成100目的细粉。取红藻细粉，加入8倍量无水乙醇萃取10h，过滤并挥去多余乙醇，所得滤渣备用。
S2，将步骤S1制得的脱脂红藻按料液比为1:30的比例加入去离子水，浸泡30min，然后过胶体磨研磨处理10min，即得到红藻匀浆液，备用。
S3，将步骤S2制得的红藻匀浆液投入亚临界提取釜中，设置提取温度为130℃，压力为3Mpa，提取时间为1h，进行亚临界提取。提取完毕后，利用分子筛过滤并收集分子量小于等于100kDa的红藻多糖提取液A，备用。将截留得到的分子量大于100kDa的红藻多糖提取液B按步骤S4进行处理。
S4的具体过程是：
S41，将步骤S3得到的分子量大于100kDa的红藻多糖提取液转移至反应釜中，按照水解酶的质量是红藻多糖提取液B质量的2％的比例加入水解酶溶液，并调节反应釜中混合液的pH值范围至5.0，在55℃的温度下，水解3h。
S42，将反应釜升温至100℃，继续提取1h。
S43，将反应釜中混合液经300目分子筛过滤，收集滤液，备用。
其中，步骤S41使用的水解酶由纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和α-淀粉酶组成。纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和α-淀粉酶的质量比为1:1:1:1:1。
S5，将红藻多糖提取液A和红藻多糖提取液C混合，按每100ml混合滤液加入5gD401型大孔吸附树脂进行吸附处理12h，然后过滤，收集滤液，备用。
S6，将步骤S5收集的滤液以65℃真空减压浓缩至相对密度在1.20g/cm3为止。再往滤液中加入无水乙醇，使混合溶液中的乙醇含量达到80％，搅拌均匀后，静置沉淀24h后除去乙醇水。所得红藻多糖沉淀物经冷冻干燥处理后，得到分子量小于等于100kDa的固体粉末状红藻多糖。
[实施例5]
一种制备分子量小于等于100kDa的小分子量红藻多糖的方法，其它步骤等特征与实施例3相同，不同之处在于，本实施例具体采用如下参数制备：
S1，将红藻干制品粉碎成60目的细粉。取红藻细粉，加入8倍量无水乙醇萃取6h，过滤并挥去多余乙醇，所得滤渣备用。
S2，将步骤S1制得的脱脂红藻按料液比为1:20的比例加入去离子水，浸泡15min，然后过胶体磨研磨处理10min，即得到红藻匀浆液，备用。
S3，将步骤S2制得的红藻匀浆液投入亚临界提取釜中，设置提取温度为120℃，压力为3Mpa，提取时间为1h，进行亚临界提取。提取完毕后，利用分子筛过滤并收集分子量小于等于100kDa的红藻多糖提取液A，备用。将截留得到的分子量大于100kDa的红藻多糖提取液B按步骤S4进行处理。
S4的具体过程是：
S41，将步骤S3得到的分子量大于100kDa的红藻多糖提取液转移至反应釜中，按照水解酶的质量是红藻多糖提取液B质量的1％的比例加入水解酶溶液，并调节反应釜中混合液的pH值范围至6.0，在55℃的温度下，水解2h。
S42，将反应釜升温至105℃，继续提取0.5h。
S43，将反应釜中混合液经300目分子筛过滤，收集滤液，备用。
其中，步骤S41使用的水解酶由纤维素酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶、异淀粉酶和β-(1→3)葡聚糖水解酶组成。纤维素酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶、异淀粉酶和β-(1→3)葡聚糖水解酶的质量比为1:1:1:1:1。
S5，将红藻多糖提取液A和红藻多糖提取液C混合，按每100ml混合滤液加入2g AB-8型大孔吸附树脂进行吸附处理8h，然后过滤，收集滤液，备用。
S6，将步骤S5收集的滤液以65℃真空减压浓缩至相对密度在1.20g/cm3为止。再往滤液中加入无水乙醇，使混合溶液中的乙醇含量达到80％，搅拌均匀后，静置沉淀8h后除去乙醇水。所得红藻多糖沉淀物经真空干燥处理后，得到分子量小于等于100kDa的固体粉末状红藻多糖。
[实施例6]
一种制备分子量小于等于100kDa的小分子量红藻多糖的方法，其它步骤等特征与实施例3相同，不同之处在于，本实施例具体采用如下参数制备：
S1，将红藻干制品粉碎成80目的细粉。取红藻细粉，加入10倍量无水乙醇萃取12h，过滤并挥去多余乙醇，所得滤渣备用。
S2，将步骤S1制得的脱脂红藻按料液比为1:40的比例加入去离子水，浸泡40min，然后过胶体磨研磨处理10min，即得到红藻匀浆液，备用。
S3，将步骤S2制得的红藻匀浆液投入亚临界提取釜中，设置提取温度为150℃，压力为3Mpa，提取时间为1.5h，进行亚临界提取。提取完毕后，利用分子筛过滤并收集分子量小于等于100kDa的红藻多糖提取液A，备用。将截留得到的分子量大于100kDa的红藻多糖提取液B按步骤S4进行处理。
S4的具体过程是：
S41，将步骤S3得到的分子量大于100kDa的红藻多糖提取液转移至反应釜中，按照水解酶的质量是红藻多糖提取液B质量的3％的比例加入水解酶溶液，并调节反应釜中混合液的pH值范围至4.5，在55℃的温度下，水解4h。
S42，将反应釜升温至95℃，继续提取1.5h。
S43，将反应釜中混合液经300目分子筛过滤，收集滤液，备用。
其中，步骤S41使用的水解酶由纤维素酶、果胶酶、α-淀粉酶、异淀粉酶和β-(1→3)葡聚糖水解酶组成。纤维素酶、果胶酶、α-淀粉酶、异淀粉酶和β-(1→3)葡聚糖水解酶的质量比为1:1:1:1:1。
S5，将红藻多糖提取液A和红藻多糖提取液C混合，按每100ml混合滤液加入10gD101型大孔吸附树脂进行吸附处理12h，然后过滤，收集滤液，备用。
S6，将步骤S5收集的滤液以65℃真空减压浓缩至相对密度在1.20g/cm3为止。再往滤液中加入无水乙醇，使混合溶液中的乙醇含量达到80％，搅拌均匀后，静置沉淀12h后除去乙醇水。所得红藻多糖沉淀物经鼓风干燥处理后，得到分子量小于等于100kDa的固体粉末状红藻多糖。
[实施例7]
一种制备分子量小于等于100kDa的小分子量红藻多糖的方法，其它步骤等特征与实施例3相同，不同之处在于，本实施例具体采用如下参数制备：
S1，将红藻干制品粉碎成60目的细粉。取红藻细粉，加入5倍量无水乙醇萃取4h，过滤并挥去多余乙醇，所得滤渣备用。
S2，将步骤S1制得的脱脂红藻按料液比为1:20的比例加入去离子水，浸泡15min，然后过胶体磨研磨处理10min，即得到红藻匀浆液，备用。
S3，将步骤S2制得的红藻匀浆液投入亚临界提取釜中，设置提取温度为120℃，压力为2.5Mpa，提取时间为0.5h，进行亚临界提取。提取完毕后，利用分子筛过滤并收集分子量小于等于100kDa的红藻多糖提取液A，备用。将截留得到的分子量大于100kDa的红藻多糖提取液B按步骤S4进行处理。
S4的具体过程是：
S41，将步骤S3得到的分子量大于100kDa的红藻多糖提取液转移至反应釜中，按照水解酶的质量是红藻多糖提取液B质量的1％的比例加入水解酶溶液，并调节反应釜中混合液的pH值范围至4.5，在50℃的温度下，水解1h。
S42，将反应釜升温至95℃，继续提取0.5h。
S43，将反应釜中混合液经300目分子筛过滤，收集滤液，备用。
其中，步骤S41使用的水解酶由纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和异淀粉酶组成。纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和异淀粉酶的质量比为1:1:1:1:1。
S5，将红藻多糖提取液A和红藻多糖提取液C混合，按每100ml混合滤液加入2gD401型大孔吸附树脂进行吸附处理8h，然后过滤，收集滤液，备用。
S6，将步骤S5收集的滤液以65℃真空减压浓缩至相对密度在1.10g/cm3为止。再往滤液中加入无水乙醇，使混合溶液中的乙醇含量达到80％，搅拌均匀后，静置沉淀8h后除去乙醇水。所得红藻多糖沉淀物经冷冻干燥处理后，得到分子量小于等于100kDa的固体粉末状红藻多糖。
[实施例8]
一种制备分子量小于等于100kDa的小分子量红藻多糖的方法，其它步骤等特征与实施例3相同，不同之处在于，本实施例具体采用如下参数制备：
S1，将红藻干制品粉碎成100目的细粉。取红藻细粉，加入10倍量无水乙醇萃取12h，过滤并挥去多余乙醇，所得滤渣备用。
S2，将步骤S1制得的脱脂红藻按料液比为1:40的比例加入去离子水，浸泡40min，然后过胶体磨研磨处理10min，即得到红藻匀浆液，备用。
S3，将步骤S2制得的红藻匀浆液投入亚临界提取釜中，设置提取温度为170℃，压力为3.5Mpa，提取时间为1.5h，进行亚临界提取。提取完毕后，利用分子筛过滤并收集分子量小于等于100kDa的红藻多糖提取液A，备用。将截留得到的分子量大于100kDa的红藻多糖提取液B按步骤S4进行处理。
S4的具体过程是：
S41，将步骤S3得到的分子量大于100kDa的红藻多糖提取液转移至反应釜中，按照水解酶的质量是红藻多糖提取液B质量的3％的比例加入水解酶溶液，并调节反应釜中混合液的pH值范围至6.0，在60℃的温度下，水解4h。
S42，将反应釜升温至105℃，继续提取1.5h。
S43，将反应釜中混合液经300目分子筛过滤，收集滤液，备用。
其中，步骤S41使用的水解酶由纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和α-淀粉酶组成。纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和α-淀粉酶的质量比为1:1:1:1:1。
S5，将红藻多糖提取液A和红藻多糖提取液C混合，按每100ml混合滤液加入10gD401型大孔吸附树脂进行吸附处理24h，然后过滤，收集滤液，备用。
S6，将步骤S5收集的滤液以65℃真空减压浓缩至相对密度在1.30g/cm3为止。再往滤液中加入无水乙醇，使混合溶液中的乙醇含量达到80％，搅拌均匀后，静置沉淀24h后除去乙醇水。所得红藻多糖沉淀物经冷冻干燥处理后，得到分子量小于等于100kDa的固体粉末状红藻多糖。
[实施例9]
一种制备分子量小于等于100kDa的小分子量红藻多糖的方法，其它步骤等特征与实施例3相同，不同之处在于，本实施例具体采用如下参数制备：
S1，将红藻干制品粉碎成80目的细粉。取红藻细粉，加入7.5倍量无水乙醇萃取8h，过滤并挥去多余乙醇，所得滤渣备用。
S2，将步骤S1制得的脱脂红藻按料液比为1:30的比例加入去离子水，浸泡27.5min，然后过胶体磨研磨处理10min，即得到红藻匀浆液，备用。
S3，将步骤S2制得的红藻匀浆液投入亚临界提取釜中，设置提取温度为145℃，压力为3Mpa，提取时间为1h，进行亚临界提取。提取完毕后，利用分子筛过滤并收集分子量小于等于100kDa的红藻多糖提取液A，备用。将截留得到的分子量大于100kDa的红藻多糖提取液B按步骤S4进行处理。
S4的具体过程是：
S41，将步骤S3得到的分子量大于100kDa的红藻多糖提取液转移至反应釜中，按照水解酶的质量是红藻多糖提取液B质量的2％的比例加入水解酶溶液，并调节反应釜中混合液的pH值范围至5.25，在55℃的温度下，水解2.5h。
S42，将反应釜升温至100℃，继续提取1h。
S43，将反应釜中混合液经300目分子筛过滤，收集滤液，备用。
其中，步骤S41使用的水解酶由纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶和β-(1→3)葡聚糖水解酶组成。纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶和β-(1→3)葡聚糖水解酶的质量比为1:1:1:1:1。
S5，将红藻多糖提取液A和红藻多糖提取液C混合，按每100ml混合滤液加入6gD401型大孔吸附树脂进行吸附处理16h，然后过滤，收集滤液，备用。
S6，将步骤S5收集的滤液以65℃真空减压浓缩至相对密度在1.20g/cm3为止。再往滤液中加入无水乙醇，使混合溶液中的乙醇含量达到80％，搅拌均匀后，静置沉淀16h后除去乙醇水。所得红藻多糖沉淀物经冷冻干燥处理后，得到分子量小于等于100kDa的固体粉末状红藻多糖。
[对比例1]
本对比例采用传统热水提取工艺制备红藻多糖，具体步骤如下：
(1)脱脂处理：将红藻干制品粉碎成100目的细粉，取红藻细粉，加入8倍量无水乙醇萃取8h，挥去乙醇，滤渣备用。
(2)红藻多糖提取：取步骤(1)中红藻滤渣加入料液比为1:20的去离子水，浸泡30min，投入反应釜中，设置提取温度为100℃，提取2h后，提取两次，过滤，滤液备用。
(3)浓缩干燥：将步骤(2)所得滤液，分别置于65℃浓缩至相对密度为1.30g/cm3，加入乙醇使溶液中乙醇浓度为80％，搅拌均匀后，静置10h后除去乙醇水，多糖沉淀物经干燥后得到红藻多糖。
[对比例2]
本对比例采用传统亚临界提取工艺制备红藻多糖，具体步骤如下：
(1)脱脂处理：将红藻干制品粉碎成100目的细粉，取红藻细粉，加入6倍量无水乙醇萃取8h，挥去乙醇，滤渣备用。
(2)红藻匀浆液制备：取步骤(1)中红藻滤渣加入料液比为1:10的去离子水，浸泡30min，过胶体磨处理5min，得到红藻匀浆液，备用。
(3)将步骤(2)中所得红藻匀浆液投入亚临界提取釜中，设置提取温度为150℃，压力为3Mpa，提取0.5h后，过滤并截留分子量大于100kDa的红藻多糖提取液备用。收集分子量小于等于100kDa的红藻多糖提取液备用。
(4)将步骤(3)所得分子量大于100kDa和分子量小于100kDa红藻多糖提取液，在65℃下浓缩至相对密度为1.30g/cm3，加入乙醇使溶液中乙醇浓度为80％，搅拌均匀后，静置10h后除去乙醇水，多糖沉淀物经干燥后得到红藻多糖。
[实施例10]
红藻多糖提取质量情况分析
1红藻多糖提取率的测定
以本发明实施例4至9的红藻多糖制备方法中，步骤S5收集的红藻多糖滤液作为检测样品，进行红藻多糖提取率计算。以对比例1中，浓缩步骤前最后收集的红藻多糖滤液作为检测样品，进行红藻多糖提取率计算。以对比例2中，步骤(4)的红藻多糖提取液混合液作为检测样品，进行红藻多糖提取率计算。按式(1)分别计算实施例4至9和对比例1、2所制备的红藻多糖的提取率，结果见表1。
ω＝c×V/m×N×100％……式(1)；
式(1)中：
ω为红藻多糖提取率；
c为检测样品的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；
V为检测样品的取样体积，单位为升(L)；
N为检测样品的稀释倍数；
m为红藻干制品重量，单位为克(g)。
表1不同工艺组别红藻多糖的提取率
| 不同工艺组别 | 多糖提取率(％) |
| 实施例4 | 13.96 |
| 实施例5 | 12.72 |
| 实施例6 | 13.18 |
| 实施例7 | 13.02 |
| 实施例8 | 15.25 |
| 实施例9 | 12.89 |
| 对比例1(热水提取) | 6.29 |
| 对比例2(亚临界提取) | 10.50 |
从表1的结果可以看出，本发明实施例4至9的红藻多糖提取率均高于传统热水提取工艺和传统亚临界提取工艺。
2红藻多糖分子量的测定
采用高效凝胶过滤色谱法测定实施例4至9和对比例1、2所制备的红藻多糖的分子量，结果见表2。需要说明的是，本发明中所说的分子量均为重均分子量，符号为Mw。
2.1色谱条件：YMC Pack-Diol 200色谱柱(300mm×8.0mm，5μm，200A)；流动相：蒸馏水；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；检测器：示差折光检测器；进样量：20μL。
2.2标准曲线的制作
分别称取标准葡萄糖和系列标准葡聚糖T-10、T-40、T-500、T-2000适量。用流动相(蒸馏水)将上述标准品分别配制成2mg/mL的溶液。分别取上述标准溶液进样，记录洗脱峰的保留时间。先取葡萄糖标液进样，洗脱测得柱的总体积Vt；再用T-2000洗脱测得柱的空体积V0；分别用T-500、T-40、T-10的标准溶液进样，求得它们的洗脱体积Ve。分子量Mw与其在凝胶柱上的洗脱体积Ve、分配系数Kav存在如下关系：
Ve＝a－blnMw ……式(2)；
Kav＝K1－K2lnMw ……式(3)；
Kav＝(Ve－V0)/(Vt－V0) ……式(4)；
式中，a、b、K1、K2为常数。以Kav对lnMw进行线性回归处理，得线性回归方程。
2.3样品分子量的测定
取实施例4至9和对比例1、2所制备的红藻多糖，用流动相(蒸馏水)分别配制成2mg/mL的溶液，然后按色谱条件进样分析，记录样品保留时间。由样品保留时间计算该红藻多糖在凝胶柱上的洗脱体积Ve，从而获得分配系数Kav。通过2.2节制作的回归方程即可得该红藻多糖的分子量Mw，单位为kDa。
表2不同工艺组别的红藻多糖分子量
| 不同工艺组别 | 分子量范围(kDa) |
| 实施例4 | 5.00-50.00 |
| 实施例5 | 8.00-47.00 |
| 实施例6 | 3.20-28.00 |
| 实施例7 | 4.90-90.50 |
| 实施例8 | 2.00-68.60 |
| 实施例9 | 11.70-100.00 |
| 对比例1(热水提取) | 10.00-2000.00 |
| 对比例2(亚临界提取) | 4.00-1050.00 |
从表2的结果可以看出，本发明实施例4至9的工艺制得的红藻多糖分子量均小于100kDa，且红藻多糖分子量的大小分布更集中。证明本发明的制备方法能够对红藻多糖的分子量进行有效控制，所制得的红藻多糖分子量的大小分布更集中，分子量更稳定。
3红藻多糖重金属脱除率的测定
采用原子吸收光度法测定实施例4至9和对比例1、2所制备的红藻多糖的Pb、Cd、Hg等重金属的含量，按公式(5)计算各工艺组别的重金属脱除率，结果见表3。
重金属脱除率＝(A0-A1)/A0×100％……公式(5)
式中，
A0为脱除前重金属的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；
A1为脱除后重金属的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)。
对实施例4至9和对比例1、2所制备的红藻多糖的重金属脱除率进行分析，结果见表3。
表3不同工艺组别的重金属脱除率
从表3的结果可以看出，本发明实施例4至9红藻多糖制备方法的重金属脱除率更高。采用本发明的制备方法制得的红藻多糖作为神经酰胺表达促进剂制备相关化妆品或者皮肤外用药物，对人体的重金属毒害风险低。
本发明的红藻多糖制备方法对比传统热水提取工艺或者传统亚临界提取工艺，红藻多糖提取率更高。提取过程中使用的试剂环保安全，对环境友好，对人体无害。本发明的提取方法利用亚临界提取联合酶水解处理的工艺，能够精准控制所得红藻多糖的分子量大小。经由本发明的红藻多糖制备方法制得的红藻多糖具有分子量低，可达到小于等于100kDa的水平，相比于大分子量红藻多糖更有利于人体吸收利用。该红藻多糖生物活性高，相比大分子量红藻多糖更加充分发挥红藻多糖促进神经酰胺表达的作用。该红藻多糖具有重金属含量低、产品质量好的优势。
[实施例11]
红藻多糖促进小鼠皮肤中神经酰胺表达的功效评价实验
1实验目的：通过丙酮/乙醚去除皮肤脂质，构建皮肤脂质损失的模型，利用本发明实施例5的工艺制备的红藻多糖，与对比例1传统热水提取工艺制备的红藻多糖进行比较，检测皮肤神经酰胺含量的变化，以及皮肤中炎症因子的变化，验证小分子量红藻多糖对神经酰胺的促进作用。
2实验方法：
配置不同组别的添加溶液。使用实施例5制得的红藻多糖分别配制质量浓度为0.01％、0.05％和0.25％的红藻多糖水溶液，并分别对应编号为实施例5-1(0.01％)，实施例5-2(0.05％)，实施例5-3(0.25％)，使用实施例9制得的红藻多糖配制质量浓度为0.05％的红藻多糖水溶液，编号为实施例9(0.05％)，作为添加组使用的溶液。
使用对比例1制得的红藻多糖配制质量浓度为0.05％的红藻多糖水溶液，编号为对比例1(0.05％)，作为对照组使用的溶液。
设置空白组、模型组、添加组、对照组小鼠进行比对实验。空白组小鼠不进行任何处理。模型组、添加组和对照组小鼠经过丙酮/乙醚处理30s，水处理30s的模型构建之后。间隔30min，使用不同组别的红藻多糖溶液分别在小鼠背部涂抹100μl样品；模型组涂抹蒸馏水100μl，一天两次。如是处理6天，每天进行经皮失水率TWEL和皮肤水分含量的测试。最后一天收集小鼠皮肤组织，进行皮肤神经酰胺含量的分析，同时利用ELISA检测皮肤组织中炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表达。
3实验数据处理
不同组间的实验结果数据差异用spss软件采用T检验分析比较，根据P值大小判断差异的显著性。
4指标检测
4.1经皮失水率TWEL和皮肤水分含量的测试
4.1.1实验步骤
小鼠处死前，使用仪器对小鼠背部皮肤水分含量和经皮失水率进行测定。测试仪器为CM825德国CK皮肤水分含量测试仪和TM300-德国CK皮肤水份流失(TEWL)测试仪。测试环境保持温度20℃-22℃，湿度50％的恒温恒湿环境稳定30min之后进行测量，保持探头贴合小鼠的背部皮肤，数值稳定后进行记录。
4.1.2实验结果
经皮失水率和皮肤水分含量能够在一定程度上反映出皮肤屏障功能的完整性。经皮失水率越高，皮肤水分含量越低，说明皮肤水分流失越严重，反映出皮肤屏障功能受到破坏。
表4不同组别皮肤经皮失水率和水分含量的变化
注：不同组别与模型组的显著性分析用“*”进行标注，P＜0.05标注为“*”，P＜0.01标注为
“**”，P＜0.001标注为“***”，P＜0.0001标注为“****”；不同实施例组别与对比例1之间
的显著性用“#”进行标注，P＜0.05标注为“#”。
4.1.3结果分析
①空白组与其他组数据比较
从表4结果可以看出，空白组代表小鼠的自身皮肤屏障功能，只涂抹水的模型组经皮失水率数据远高于空白组，证明皮肤表面的脂质对皮肤起到重要的保护、保水作用。添加组和对照组的经皮失水率数据高于空白组，低于只涂抹水的模型组，证明即使除去了小鼠自身皮肤脂质屏障，采用在小鼠皮肤表面涂抹红藻多糖的方法，能够促进小鼠皮肤表面的屏障功能再生。
从表4的皮肤水分含量的数据可知，模型组、添加组和对照组的小鼠皮肤均经过除脂处理，小鼠皮肤屏障受到破坏，皮肤含水量均低于没有经过任何处理的空白组。经受皮肤除脂处理的小鼠在涂抹了红藻多糖溶液后，皮肤水分含量均得到明显提高，基本恢复到皮肤屏障功能被破坏前的水平。
②添加红藻多糖的添加组和对照组比较
从表4添加组和对照组的数据比较可知，涂抹本发明实施例5的工艺制备的小分子量红藻多糖在修复小鼠皮肤屏障功能的效果要优于对比例1传统热水提取的大分子量红藻多糖。本发明的小分子量红藻多糖的有效添加浓度范围在0.01％～0.25％，且红藻多糖添加浓度为0.05％的效果最佳。
③添加组内不同实施例的比较
从表4添加组中实施例5-2和实施例9的结果比较可知，在同等添加浓度下，红藻多糖的分子量越小，其修复小鼠皮肤屏障功能的效果越佳。
4.2LC-MS脂质含量检测
4.2.1脂质检测样品处理
采用经典的脂质提取方法(Bligh&Dyer法)——氯仿甲醇提取方法，具体步骤如下：取0.5g小鼠皮肤组织，加入1ml水，进行匀浆破碎5min，再加入4ml的氯仿和甲醇的混合液(氯仿:甲醇＝1:2)，混匀15min～20min后以2000rpm离心10min，取下层液，用N2吹干氯仿获得脂质，于-80℃保存。上机前用200μl甲醇进行复溶，离心后取上清液上机测定。
4.2.2LC-MS检测
色谱条件：色谱柱thermo ODS-C(18)，4.6×150mm，流速1ml/min，流动相为甲醇-水，洗脱梯度如下：0-2min：85-85％，2-10min：85-100％，10-15min：100-100％。进样量为5μL。
质谱参数和条件：离子源ESI，毛细管电压5500V，curtain30，GS1和GS2分别为60，TEM 680℃。
4.2.3检测结果计算
相同保留时间的同一种脂质成分，其含量与峰面积成正比。需要说明的是，此处的脂质就是指神经酰胺。通过峰面积的比较，能够得出不同组别的神经酰胺含量的相对值。由于神经酰胺的种类较多，本实验选择其中一种亚型神经酰胺CER[NDS]作为分析对象，并设置模型组的神经酰胺CER[NDS]的峰面积为比较基准。添加组和对照组中的神经酰胺含量的相对值按公式(6)计算。
神经酰胺含量的相对值＝样品组神经酰胺峰面积/模型组神经酰胺峰面积……公式(6)；
式中，样品组是指添加组或者对照组。
经过LC-MS数据分析，将皮肤中不同类型的神经酰胺含量的数据进行汇总，得到相对于模型组的神经酰胺含量的数据，结果见表5。红藻多糖对神经酰胺具有调节作用，不同红藻多糖添加组别均能一定程度促进神经酰胺的表达。神经酰胺含量的相对值越高，证明红藻多糖对促进神经酰胺表达的效果越好。这也是使用红藻多糖能够修复小鼠受破坏的皮肤屏障功能的主要原因。
表5不同组别神经酰胺相对表达含量的变化
注：不同组别与模型组的显著性分析用“*”进行标注，P＜0.05标注为“*”，
P＜0.01标注为“**”，P＜0.001标注为“***”，P＜0.0001标注为“****”。
4.2.4结果分析
①空白组与其他组数据比较
从表5结果可知，添加组和对照组的神经酰胺总含量显著优于模型组，且能够接近于没有被破坏皮肤屏障的空白组数据。说明红藻多糖能够促进皮肤中神经酰胺表达，提高神经酰胺在皮肤中的含量。
②添加红藻多糖的添加组和对照组比较
从表5添加组和对照组的数据比较可知，涂抹本发明实施例5的工艺制备的小分子量红藻多糖在促进神经酰胺表达的效果要优于对比例1传统热水提取的大分子量红藻多糖。本发明的小分子量红藻多糖的有效添加浓度范围在0.01％～0.25％，且红藻多糖添加浓度为0.05％的效果最佳。
③添加组内不同实施例的比较
从表5添加组中实施例5-2和实施例9的结果比较可知，在同等添加浓度下，红藻多糖的分子量越小，其促进皮肤中神经酰胺表达的效果越佳。
4.3ELISA检测
4.3.1BCA定量检测
取不同组别小鼠的皮肤组织进行研磨提取蛋白，并进行BCA定量(碧云天BCA蛋白测定试剂盒P0012S)，主要步骤如下：
4.3.2蛋白标准品的准备
a.取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(20mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。
b.取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取20μl 25mg/ml蛋白标准，加入980μl稀释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。
4.3.3BCA工作液配制
根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。例如5ml BCA试剂A加100μl BCA试剂B，混匀，配制成5.1ml BCA工作液。BCA工作液室温24小时内稳定。
4.3.4蛋白浓度测定
a.将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。
b.加适当体积样品到96孔板的样品孔中。如果样品不足20μl，需加标准品稀释液补足到20μl。记录样品体积。
c.各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置20-30分钟。
d.用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的其他波长的吸光度。
e.根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
4.3.5炎症因子ELISA测试
使用炎症因子IL-6，TNF-α，IL-1β的ELISA试剂盒(江苏酶标)，按照说明书操作，测定组织中炎症因子的含量。测试步骤如下：
a.准备酶标板，每孔添加100μl标准品和样品。用提供的胶带盖住。在37℃下培养2小时。提供平板布局，以记录分析的标准品和样品。
b.将每孔的液体吸出，不要清洗。
c.向每个孔中添加100μl生物素抗体(1x)。用新胶带盖住。在37℃下培养1小时
d.每孔吸去液体并清洗，重复该过程两次，共清洗三次。每个孔注入清洗缓冲液(200μl)进行清洗，并让其静置2分钟，最后一次清洗后，通过抽吸或倾析除去所有剩余的清洗缓冲液。倒置盘子，用干净的纸巾将其吸干。
e.向每个孔中添加100μl HRP抗生物素(1x)。用新胶带盖住微量滴定板。在37℃下培养1小时。
f.如步骤4所示，重复吸入/清洗过程五次。
g.向每个孔中添加90μl TMB基质。在37℃下培养15-30分钟。避光。
h.向每个孔中加入50μl停止溶液，轻轻敲打平板以确保充分混合。
i.使用设置为540nm的酶标仪，在5分钟内测定每个孔的光密度。
利用试剂盒提供标准样品进行梯度稀释，制作标准曲线。随后对不同样品进行相同步骤的操作获得样品吸光度，利用标准曲线换算得到不同样品的指标的蛋白含量。为了进行比较分析，这里对不同样品组ELISA测试的指标进行相对值分析。模型组炎症因子均值的相对表达含量设为比较基准，添加组和对照组中的炎症因子含量的相对值按公式(7)计算。
样品组炎症因子含量的相对值＝样品组炎症因子含量/模型组炎症因子含量……公式(7)；
式中，样品组是指添加组或者对照组。
4.3.6实验结果
经过ELISA检测分析，将皮肤中不同类型的炎症因子含量的数据进行汇总，得到相对于模型组的炎症因子含量的数据，结果见表6。红藻多糖对神经酰胺具有调节作用，不同红藻多糖添加组别均能一定程度促进神经酰胺的表达。炎症因子相对表达含量越低，说明红藻多糖对抑制炎症因子表达的效果越好。
表6不同组别炎症因子相对表达含量的变化
注：不同组别与模型组的显著性分析用“*”进行标注，P＜0.05标注为“*”，P＜0.01标注为“**”，
P＜0.001标注为“***”，P＜0.0001标注为“****”；不同实施例组别与对比例1之间的显著性用
“#”进行标注，P＜0.05标注为“#”。
4.3.7结果分析
①空白组与其他组数据比较
从表6结果可知，添加组和对照组的炎症因子相对表达含量均低于模型组，且能够接近于没有被破坏皮肤屏障的空白组数据。说明红藻多糖能够有效抑制皮肤中炎症因子表达，从而降低皮肤细胞中炎症因子的含量，有助于皮肤保持健康状态。
②添加红藻多糖的添加组和对照组比较
从表6添加组和对照组的数据比较可知，涂抹本发明实施例5的工艺制备的小分子量红藻多糖在抑制炎症因子表达的效果要优于对比例1传统热水提取的大分子量红藻多糖。原因是本发明的工艺制备的小分子量红藻多糖在促进神经酰胺表达的效果要优于对比例1传统热水提取的大分子量红藻多糖。本发明的小分子量红藻多糖的有效添加浓度范围在0.01％～0.25％，且红藻多糖添加浓度为0.05％的效果最佳。
③添加组内不同实施例的比较
从表6添加组中实施例5-2和实施例9的结果比较可知，在同等添加浓度下，红藻多糖的分子量越小，其抑制皮肤中炎症因子表达的效果越佳。
由于神经酰胺是皮肤角质层最外侧皮脂的主要组成部分，补充皮肤细胞中的神经酰胺，能够修复皮肤屏障损伤。从以上实验结果可以看出，将本发明的红藻多糖外用于皮肤，能够明显提高皮肤细胞中神经酰胺含量，可有效抑制炎症因子分泌的功能，因此，利用本发明的红藻多糖提高皮肤细胞中神经酰胺含量，能够缓解特应性皮炎等皮肤炎症引发的不适。
[实施例12]
红藻多糖对人表皮角化细胞中脂质的调控实验
1实验目的
通过检测细胞中添加多糖样品后神经酰胺的相对含量的变化，同时比对桉树提取物和传统提取工艺的红藻多糖的促进效果，检测红藻多糖对神经酰胺的促进作用。
2细胞培养
于6孔板培养人表皮角化细胞(NHEK)(美国ScienCell，货号YB2100，规格500000cells/vial)培养到聚集状态，此后变换为Epilife-KG2培养基(无增殖添加因子)，分别添加实验用样品的溶液和对照溶液，培养3日后，从每个孔回收细胞。
3脂质提取
由Bligh and Dyer法从回收的细胞中提取脂质(参见[实施例11]中4.2.1节步骤)。将提取液进行氮气干燥后，用氯仿/甲醇的混合液溶解部分脂质，作为脂质样品。另外，蛋白质量由BCA法进行定量(参见[实施例11]中4.3.2节步骤)。
4神经酰胺量解析
以薄层色谱法在提取的脂质中进行解析。跑板溶剂以氯仿:甲醇:醋酸＝190:9:1的比例混合，在水平方向展开2次，喷以硫酸铜显色溶液，以加热板烘烤，并检测神经酰胺薄层色谱值。神经酰胺量按公式(8)计算。
神经酰胺量＝神经酰胺薄层色谱值/蛋白含量……公式(8)；
为了进行比较，设置空白对照品的神经酰胺量(相对值)为比较基准。神经酰胺量(相对值)按公式(9)计算。
样品组神经酰胺量(相对值)＝样品组神经酰胺量/空白对照品神经酰胺量公式(9)；
式中，样品组是指添加组或者对照组。
5实验结果
经过神经酰胺量解析，得到相对于空白对照品的神经酰胺量数据，结果见表7。
表7神经酰胺量(相对值)
6结果分析
角质层中神经酰胺的含量影响着皮肤屏障的功能，而神经酰胺代谢相关酶的活性可调节神经酰胺在细胞内的含量。神经酰胺合成代谢途径所涉及的主要酶包括：丝氨酸棕榈酰转移酶(STP)、神经酰胺合成酶(CerS)、鞘磷脂酶(SMase)。有研究结果表明桉树提取物可以增加角质层中神经酰胺的含量，从而改善角质层功能。其中神经酰胺含量增加的原因是由于桉树提取物诱导神经酰胺代谢中的一些酶如STP表达增加。
如表7所示，本发明工艺提取的红藻多糖具有提高人角化细胞的神经酰胺含量的效果。相对于传统方法制得红藻多糖或者桉树提取物促进神经酰胺表达的效果，本发明的制备方法制得的小分子量红藻多糖的促进效果更佳。且本发明制备方法制得的小分子量红藻多糖的促进效果比桉树提取物的促进效果更佳。
综上所述，本发明的小分子量红藻多糖作为一种促进剂，能够诱导神经酰胺合成代谢途径所涉及主要酶的表达，增加相关酶的活性，从而提高神经酰胺在细胞内的含量。
需要说明的是，实施例11至12仅是以分子量小于等于100kDa的红藻多糖、分子量为8.0kDa～47.0kDa的红藻多糖和分子量为11.7kDa～100.0kDa的红藻多糖的样品进行说明的。本发明的红藻多糖，分子量小端分布在2.0kDa～5.0kDa之间、大端分布在小于等于100kDa范围，均具有促进神经酰胺表达合成，从而促进皮肤屏障修复、实现抑制炎症因子表达的效果。在此不对各个分子量小端范围与对应的分子量大端范围的各种情况进行一一效果列举。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.红藻多糖作为神经酰胺表达促进剂的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：红藻多糖在制备具有神经酰胺调控作用的化妆品或者皮肤外用药物中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：
红藻多糖在制备通过调控神经酰胺促进皮肤屏障修复的化妆品或者皮肤外用药物中的用途；或者
红藻多糖在制备通过调控神经酰胺实现抑制炎症因子表达的化妆品或者皮肤外用药物中的用途。
4.根据权利要求1或2或3所述的应用，其特征在于，所述红藻多糖的分子量小于等于100kDa。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述红藻多糖的分子量以Z表示，(2.0～5.0)kDa≤Z≤50kDa。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述红藻多糖通过亚临界提取结合酶水解方法制备而成。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述红藻多糖的具体制备工艺是：
将红藻匀浆液投入亚临界提取釜中进行亚临界提取，过滤并收集分子量小于等于100kDa的红藻多糖提取液A备用，并将截留得到的分子量大于100kDa的红藻多糖提取液B进行酶水解处理得到分子量小于等于100kDa的红藻多糖提取液C；
再将红藻多糖提取液A和红藻多糖提取液C混合，经吸附、过滤、浓缩、醇沉、干燥处理得到分子量小于等于100kDa的红藻多糖。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述红藻多糖的具体制备工艺是：
亚临界提取温度为120℃～170℃，压力为2.5Mpa～3.5Mpa，提取时间为0.5h～1.5h；
对红藻多糖提取液B进行酶水解的具体过程包括：
将分子量大于100kDa的红藻多糖提取液B转移至反应釜中，按照水解酶的质量是红藻多糖提取液B质量的1％～3％的比例加入水解酶溶液，并调节反应釜中混合液的pH值范围至4.5～6.0，在50℃～60℃的温度下，水解1h～4h；
再将反应釜升温至95℃～105℃，继续提取0.5h～1.5h；
最后将反应釜中混合液经分子筛过滤，收集得到红藻多糖提取液C。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述水解酶由纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶、异淀粉酶、β-(1→3)葡聚糖水解酶中的至少三种水解酶组成。
10.一种红藻多糖的制备方法，其特征在于，通过如权利要求6至9任意一项所述的方法制备。
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