CN113584232A

CN113584232A - 一种新型冠状病毒及其德尔塔突变株检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN113584232A
Application number: CN202111147120.0A
Authority: CN
Inventors: 韩亚平; 张淼; 臧百盛; 顾城玮; 赵譞
Original assignee: Beijing Jijian Medical Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Jijian Medical Technology Co ltd
Priority date: 2021-09-29
Filing date: 2021-09-29
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2041-09-29
Also published as: CN113584232B

Abstract

本发明提供了一种新型冠状病毒及其德尔塔突变株检测试剂盒及其检测方法，属于分子生物学检测技术领域。本发明重新设计了一系列引物探针组，增加检测靶点，从而有效区分新型冠状病毒野生型和德尔塔突变株。可用于体外定性检测新型冠状病毒或德尔塔突变株感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者、其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者的鼻咽拭子、痰液等样本中的新型冠状病毒基因。

Description

一种新型冠状病毒及其德尔塔突变株检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒及其德尔塔突变株检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

新型冠状病毒在全世界范围内已经出现多种变种。其中B.1.617谱系是其于2020年10月首先于印度发现的变种病毒。2021年5月31日，世界卫生组织将COVID-19几种主要的变异病毒株均以希腊字母命名，其中其子系B.1.617.2的特征突变位点在于L452R和T478K，它被命名为“Delta”（德尔塔）变种。Delta毒株具有潜伏期更短（平均3.7天)、其感染者首次核酸检测呈阳性所需要的病毒载量更高(比原始毒株高出1260倍）、其在感染的早期阶段具有更强的传染性（口咽拭子传染性80.65%）等特点。因此，在面对可能存在Delta毒株的样品时，现有的新型冠状病毒检测试剂盒呈现出检测灵敏度低、准确性差等局限性，很容易出现假阴性结果，而且无法在检测的同时准确区分新型冠状病毒野生型和德尔塔突变株，不利于快速有效地采取针对性的防控和救治措施。

发明内容

本发明重新设计了一系列引物探针组，增加检测靶点，从而有效区分新型冠状病毒野生型和德尔塔突变株。可用于体外定性检测新型冠状病毒或德尔塔突变株感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者、其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者的鼻咽拭子、痰液等样本中的新型冠状病毒基因。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的引物探针组，其特征在于，包括用于检测ORF1ab基因的引物探针组A、用于检测N基因的引物探针组B和用于区分野生型和突变株的S基因的引物探针组 C。

作为可选方式，在上述用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的引物探针组中，所述用于区分野生型和突变株的S基因的引物探针组 C包括引物S-delta-F和S-delta-R以及检测用探针S-delta-P，其序列信息具体为：

S-delta-F：TACAGGCTGCGTTATAGCTT；

S-delta-R：AACACCATTAGTGGGTTGGA；

S-delta-P：ACAAGGTTTGCTACCGGCCTGA。

全新设计优化的S基因的引物探针组C，选在L425R和T478K突变位点，尽量避免发卡结构、引物内部二聚体、引物间二聚体以及错配的形成且能够避免与新型冠状病毒野生型、其他病毒或人类基因发生非特异结合，可以用同一个试剂盒区分新型冠状病毒和其德尔塔突变株。

作为可选方式，在上述用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的引物探针组中，所述用于检测ORF1ab基因的引物探针组A包括引物ORF1ab-F和ORF1ab-R以及检测用探针ORF1ab-P；所述用于检测N基因的引物探针组B包括引物N-F和N-R以及检测用探针N-P;其序列信息具体为：

ORF1ab-F: ACTTGTGCTAATGACCCTG，

ORF1ab-R: AGACGGGCTGCACTTACA，

ORF1ab-P: CGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG；

N-F: AGACAAGGAACTGATTACAAACA，

N-R: TGTGACTTCCATGCCAATG，

N-P: TTGCCCCCAGCGCTTCAG。

本发明针对不同靶点设计了与推荐标准完全不同的全新的引物探针，在实际样品测试中，与推荐标准中的引物探针进行比较检出了更多的阳性样本。

作为可选方式，在上述用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的引物探针组中，还包含用于监控整个检测流程的内标引物探针组RP。通过在反应体系中加入内标引物探针，用以监控整个检测流程，从而排除部分假阴性结果。进一步的，所述内标引物探针组RP包括引物 RP-F和RP -R以及检测用探针RP-P，其具体序列为：

RP-F：GCCTCATCATCTTAGACACT，

RP-R：ACACAACAAAACCGCCTA，

RP-P：ATGCACCTTTCAGAACGTATCCCT。

内标引物探针是检测人的基因RNaseP，这个基因在人体内大量存在，只要是人类样本就应该可以检测到这个基因，通过对这个基因的检测来验证整个扩增系统是否正常。如果该检测结果呈阴性说明采样、提取及扩增过程存在问题，即使新冠检测为阴性也可能是假阴性结果。

作为可选方式，在上述用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的引物探针组中，所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有荧光淬灭基团或MGB淬灭基团，针对不同靶基因的探针分别标记有不同的荧光基团。方便检测中采用不同的荧光通道对进行检测。进一步的，所述荧光基团可选自FAM、ROX、VIC、CY5、HEX；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB，所述基团的激发和发射波段相对分开可以在一个体系内进行分别检测。

作为可选方式，在上述用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的引物探针组中，所述探针ORF1ab-P用FAM标记，所述探针N-P用VIC标记，所述探针S-delta-P用CY5标记，所述探针RP-P用ROX标记。

本发明还提供了一种用于区分新型冠状病毒区分野生型和突变株的S基因的引物探针组，其特征在于，包括S-delta-F、S-delta-R和 S-delta-P，其序列信息具体为：

S-delta-F：TACAGGCTGCGTTATAGCTT；

S-delta-R：AACACCATTAGTGGGTTGGA；

S-delta-P：ACAAGGTTTGCTACCGGCCTGA。

本发明还公开了一种用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的试剂盒，其特征在于，包括本发明所述的任意一种用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的引物探针组。

作为可选方式，在上述用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的试剂盒中，还包括用于PCR检测的Tris缓冲液、镁离子、dA/G/C/UTPs、DNA聚合酶、逆转录酶、UDG酶。

作为可选方式，在上述用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的试剂盒中，还包括阴性对照、阳性对照。

作为可选方式，在上述用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的试剂盒中，所述阳性对照品为含有检测靶点基因片段的假病毒。

本发明还公开了一种用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的方法，其特征在于，采用本发明所述的用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的试剂盒，利用PCR技术进行检测。进一步的，所述PCR技术为荧光定量PCR（Fluorogenic Quantitative PolymeraseChain Reaction，FQ-PCR），又称为实时定量PCR（real-time quantitative PCR, RT-qPCR）或定量PCR（qPCR），是由美国Applied Biosystems公司推出的一种定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，获得扩增曲线，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品核酸模板的初始浓度。可以按如下步骤依据荧光定量PCR扩增曲线获得Ct（Cycle-threshold）值。

反应体系配制表

*待检样本数为n时，配制反应体系数N=待检样本数(n) +阳性对照(1)+阴性对照(1)+1。将配制好的反应体系混匀后，按20μL量分装到PCR反应管中，备用。

作为可选方式，在用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的方法中，所述步骤（3）具体为：向分装好的反应体系中分别加入5μL经过提取的待检样本以及阳性对照和阴性对照，总反应体积为25μL。盖紧反应管，瞬时低速离心。

作为可选方式，在上述用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的方法中，所述步骤（4）具体为：将PCR管按顺序放入扩增仪样品槽中，并依次设置阳性对照、阴性对照、待检样本等样品类型，同时设置样本名称。选择对应的荧光通道检测目标基因。

作为可选方式，在上述用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的方法中，所述步骤（5）具体为：反应结束后自动保存结果，对检测靶标以及内标的扩增曲线分别进行分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End 值以及Threshold值 (以ABI 7500为例，用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，确保所有扩增曲线的基线区部分平直；各种荧光通道的阈值线高度均设置为△Rn=6000)，点击Analyze进行分析，然后到Plate窗口下记录定性结果。

作为可选方式，在上述用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的方法中，还包括步骤（6）质量控制：根据各荧光通道检测结果对应的Ct值和扩增曲线形态，判断实验有效性。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本发明具有以下有益效果：

1、全新设计优化的ORF1ab和N基因的引物探针组，选在基因保守区域，尽量避免发卡结构、引物内部二聚体、引物间二聚体以及错配的形成且能够避免与其他病毒或人类基因发生非特异结合。

2、全新设计优化的S基因的引物探针组，选在L425R和T478K突变位点，尽量避免发卡结构、引物内部二聚体、引物间二聚体以及错配的形成且能够避免与新型冠状病毒野生型、其他病毒或人类基因发生非特异结合，可以用同一个试剂盒区分新型冠状病毒和其德尔塔突变株。

附图说明

图1是本发明实施例2中ORF1ab基因引物探针单重检测野生型与突变株样品的扩增结果图；

图2是本发明实施例2中N基因引物探针单重检测野生型与突变株样品的扩增结果图；

图3是本发明实施例2中S基因引物探针单重检测野生型与突变株样品的扩增结果图；

图4是本发明实施例2中RP基因引物探针单重检测样品的扩增结果图；

图5是本发明实施例3中采用混四重体系检测样品的结果图；

图6是本发明实施例4中以ORF1ab基因、N基因和S基因为检测靶点的试剂盒的效果评估结果图；

图7是本发明实施例5中采用本发明所述四重检测试剂检测不同比例的混合样品的结果图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于发明保护的范围。

1.样本类型：以下实施例中被测样本来自咽拭子或肺泡灌洗液。

2.样本采集：按照常规样本采集方法进行采集，或按照《新型冠状病毒感染的肺炎防控方案》文件中《新型冠状病毒感染的肺炎实验室技术指南》“标本采集方法”相关规定执行。

3.样本保存和运送：待测样本可立即用于处理，能在24小时内检测的标本可置于4℃保存；24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存 (如无-70℃保存条件，待测样本可于-20℃保存10天，核酸样本-20±5℃保存15天)。应避免反复冻融。样本运送采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。

实施例1 各试剂的准备

本发明目的是筛检新型冠状病毒野生型与德尔塔突变株，在GenBank中查找新型冠状病毒ORF1ab、N基因的全长序列，并单独对ORF1ab、N基因进行blast分析，比对获得目标基因的保守序列区段，在基因的保守序列区段设计引物探针方案，设计过程中评估Tm值、目标对应探针的Tm值的差值、GC含量、避免出现发夹结构及二聚体等情况。用于区分野生型和突变株的S基因，在GenBank中查找新型冠状病毒S基因的全长序列，进行blast分析，选在L425R和T478K突变位点，尽量避免发卡结构、引物内部二聚体、引物间二聚体以及错配的形成且能够避免与新型冠状病毒野生型、其他病毒或人类基因发生非特异结合。

由于新型冠状病毒传染性强，且难以得到，故采用人工合成的逆转录病毒载体作为性能验证的样本，载体装载新型冠状病毒ORF1ab基因部分序列，N基因和S基因编码区的全部序列，其中野生型假病毒S基因为全长序列，德尔塔突变株假病毒S基因为含L425R和T478K突变位点的全长序列。RP内标同样也合成假病毒用于性能验证。

使用DNA合成仪通过固相亚磷酰胺三酯法合成以下几种序列：

引物探针组A：含ORF1ab-F、ORF1ab-R、ORF1ab-P；

引物探针组B：含N-F、N-R、N-P；引物探针组C：含S-delta-F、S-delta-R、S-delta-P；内标引物探针组RP：含RP-F、RP-R、RP-P；

探针ORF1ab-P用FAM标记，所述探针N-P用VIC标记，所述探针S-delta-P用CY5标记，所述探针RP-P用ROX标记；

或者直接委托合成公司合成所设计的引物探针。

反应Buffer：含Tris缓冲液、镁离子、dA/G/C/UTPs、DNA聚合酶、逆转录酶、UDG酶：购自北京全式金生物技术有限公司。

实施例2 引物探针单重验证

分别取野生型假病毒、德尔塔突变株假病毒以及RP假病毒，使用商品化病毒核酸提取试剂盒提取待检核酸作为模板，（每种样品均设置4个浓度组，分别与各目标基因对应的引物和探针进行混合扩增），配制PCR反应体系，其配制如下：PCR反应液15μL，引物探针反应液4μL（上下游引物终浓度50-500nM，探针终浓度25-250nM），酶混合液1μL，模板5μL，总体积25μL。将PCR管放入荧光定量PCR仪中，按照如下程序进行PCR反应：50℃ 5min；95℃ 30s；95℃ 5s，66℃ 34s（采集荧光），循环45个反应。结果如图1~图4和表1所示。

表1 引物探针单重验证扩增结果

Un代表Undetermined,无扩增信号；数字代表Ct值

ORF1ab基因引物探针组合既可以检测到野生型假病毒，也可以检测到德尔塔突变株假病毒；N基因引物探针组合既可以检测到野生型假病毒，也可以检测到德尔塔突变株假病毒；而根据德尔塔突变株设计的S基因引物探针组合可以检测到德尔塔突变株假病毒，而不能检测到野生型假病毒；RP基因引物探针组合可以检测到RP假病毒。通过本实施例说明：选定的方案可以在不同样品浓度下对靶标进行有效扩增，

实施例3 混四重

取四种引物探针组合成四重体系，对四种不同浓度的德尔塔突变株假病毒进行扩增，结果如图5所示。

表2 混四重验证扩增结果

*为了模拟真实临床样本采集过程，根据以往经验值，固定RP假病毒投入浓度为6×10⁵copies/mL。

通过本实施例说明：四重体系可以检测出不同浓度的德尔塔突变株假病毒，扩增线型呈标准S型曲线，10倍倍比稀释的假病毒Ct值间隔均匀。

实施例4 以ORF1ab基因、N基因和S基因为检测靶点的试剂盒

按照下表组成配制试剂：

引物配制浓度为0.4μmol/L，探针配置浓度均为0.2μmol/L。

PCR反应液含0.1mmol/L的dATP，0.1mmol/L的dCTP，0.1mmol/L的dGTP，0.1mmol/L的dUTP，1mmol/L的MgCl₂、体积百分比为30%的无酶水；

PCR酶混合液包括：5 U的逆转录酶， 1U的热启动DNA聚合酶，1U的热敏UDG酶。

1.样本处理 (在样本处理区进行)

取200 µl待测样本、阳性对照和阴性对照，分别进行核酸提取。提取的RNA可直接用于检测。若样本提取后不立即检测，可存于-70℃备用，避免反复冻融。本试剂盒中的阳性对照和阴性对照均参与提取过程。

2.试剂准备 (在试剂准备区进行)

从试剂盒中取出PCR反应液和PCR引物探针，室温解冻后振荡混匀，并短暂离心后备用。取出试剂盒中的PCR酶混合液，瞬时离心后，置于冰上备用。根据所检测的样本数量按照下表配制反应液，建议每次检测均设置阴性对照和阳性对照。待检样本数为n时，需配制反应体系数N=待检样本数(n) +阳性对照(1)+阴性对照(1)+1。

反应体系配制表

将配制好的反应体系混匀后，按20μL量分装到PCR反应管中，转移至样本处理区。

3.加样 (在样本处理区进行)

向分装好的反应体系中分别加入5μL经过提取的待检样本以及阳性对照和阴性对照，总反应体积为25μL。盖紧反应管，瞬时低速离心，转移至检测区。

4.PCR 扩增 (在扩增与分析区进行)

将PCR管按顺序放入扩增仪样品槽中，并依次设置阳性对照、阴性对照、待检样本等样品类型，同时设置样本名称。选择FAM、VIC通道和CY5通道分别检测基因ORF1ab、N和S；选择ROX通道检测内标基因RP。ABI 7500仪器中“Quencher Dye”和“Passive Reference”均设置为None。

5. 结果分析

反应结束后自动保存结果，对检测靶标以及内标的扩增曲线分别进行分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End 值以及Threshold值 (以ABI 7500为例，用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，确保所有扩增曲线的基线区部分平直；四种荧光通道的阈值线高度均设置为△Rn=6000 )，点击Analyze进行分析，然后到Plate窗口下记录定性结果。

6.质量控制 (实验有效性判断)

试剂盒各对照品须达到以下要求，否则实验视为无效。

阳性判断值

通过参考值的研究确定本试剂盒检测目标基因的Ct参考值为37，内标Ct的参考值为37。

【检验结果的解释】

一、如果样本ROX通道出现典型S型曲线且Ct≤ 37，样本结果可按下表判定2019-nCOV阴阳性：

可按下表判定是否为B1.1.7突变株

可疑样本均需复检，若复检结果中，FAM、VIC通道和CY5通道均Ct>40，则为阴性；FAM和VIC通道均Ct<40，CY5通道Ct>40，则为2019-nCoV阳性；FAM、VIC和ROX通道均Ct<40，则为B1.1.7突变株阳性。

二、如果ROX通道的Ct>37或未出现明显的S型扩增曲线，可能原因如下：

1.样本中存在PCR的抑制物，可对样本进行稀释后检测。

2.核酸提取过程异常，可重新提取核酸进行检测。

3.此样本在采样时未能采到合格样本，或在运输、保存时样本降解，可重新采样。

以野生型假病毒、德尔塔突变株假病毒（浓度设置为6×10³-6×10⁶ copies/mL）为质控品，评估以ORF1ab基因、N基因和S基因为检测靶点的试剂盒的效果，结果如图6所示。

表3 ORF1ab基因、N基因和S基因为检测靶点的试剂盒的效果

实验结果显示：本试剂盒可以有效区分野生型、德尔塔突变株的假病毒样本。

实施例5 混合模板验证

为了模拟真实样本中可能存在野生型与突变株共存的情况，以及验证四重试剂盒的特异性，使用新型冠状病毒野生型、新冠状病毒德尔塔突变株以及RP假病毒的混合模板，调节新型冠状病毒野生型与新冠状病毒德尔塔突变株的比例，验证四重对不同突变株存在比例调节下的扩增情况，如下图所示，结果如图7示：

表4 野生型与突变株不同比例混合样本扩增结果

通过该实施例说明：本发明中的四重检测试剂特异性良好，在野生型与德尔突变株共存的样品中，当突变株占比低于1%的情况下，亦能很好地区分新型冠状病毒和其德尔塔突变株。

实施例6 最低检出限验证

选择新型冠状病毒德尔塔假病毒为模板，将假病毒分别稀释成1000 copies/mL，800 copies/mL，500 copies/mL，200 copies/ml的咽拭子模板样本，按照实施例4进行操作和结果判断，具体结果如下表所示。

通过该实施例说明：本发明试剂盒的最低检出限可达到500 copies/mL。

上述实施例仅为本发明的优选实施方式，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上做出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的引物探针组，其特征在于，包括用于检测ORF1ab基因的引物探针组A、用于检测N基因的引物探针组B和用于区分野生型和突变株的S基因的引物探针组 C。

2.根据权利要求1所述的用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的引物探针组，其特征在于，所述用于区分野生型和突变株的S基因的引物探针组 C包括引物S-delta-F和S-delta-R以及检测用探针S-delta-P，其序列信息具体为：

S-delta-F：TACAGGCTGCGTTATAGCTT；

S-delta-R：AACACCATTAGTGGGTTGGA；

S-delta-P：ACAAGGTTTGCTACCGGCCTGA。

3.根据权利要求1所述的用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的引物探针组，所述用于检测ORF1ab基因的引物探针组A包括引物ORF1ab-F和ORF1ab-R以及检测用探针ORF1ab-P；所述用于检测N基因的引物探针组B包括引物N-F和N-R以及检测用探针N-P; 其序列信息具体为：

ORF1ab-F: ACTTGTGCTAATGACCCTG，

ORF1ab-R: AGACGGGCTGCACTTACA，

ORF1ab-P: CGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG；

N-F: AGACAAGGAACTGATTACAAACA，

N-R: TGTGACTTCCATGCCAATG，

N-P: TTGCCCCCAGCGCTTCAG。

4.根据权利要求1所述的用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的引物探针组，其特征在于，包含用于监控整个检测流程的内标引物探针组RP。

5.根据权利要求4所述的用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的引物探针组，其特征在于，所述内标引物探针组RP包括引物RP-F和RP -R以及检测用探针RP-P，其具体序列为：

RP-F：GCCTCATCATCTTAGACACT，

RP-R：ACACAACAAAACCGCCTA，

RP-P：ATGCACCTTTCAGAACGTATCCCT。

6.一种用于区分新型冠状病毒区分野生型和突变株的S基因的引物探针组，其特征在于，包括S-delta-F、S-delta-R和S-delta-P，其序列信息具体为：

S-delta-F：TACAGGCTGCGTTATAGCTT；

S-delta-R：AACACCATTAGTGGGTTGGA；

S-delta-P：ACAAGGTTTGCTACCGGCCTGA。

7.一种用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的引物探针组。

8.根据权利要求7所述的用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的试剂盒，其特征在于，还包括用于PCR检测的Tris缓冲液、镁离子、dA/G/C/UTPs、DNA聚合酶、逆转录酶、UDG酶。

9.根据权利要求7所述的用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照、阳性对照。

10.一种用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的方法，其特征在于，采用权利要求7所述的用于检测新型冠状病毒及其德尔塔突变株的试剂盒，利用PCR技术进行检测。