CN113584170A - 一种NGS定量检测胰腺癌ctDNA抑癌基因甲基化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明通过对胰腺癌患者血浆ctDNA进行转化，预测基因CpG岛，针对5个基因设计多组不同的特异性引物，利用带有Index序列的引物对ctDNA进行多重PCR扩增建立文库等手段，检测ctDNA 5个抑癌基因中CpG位点的甲基化信息，最终筛选得到可用于胰腺癌检测的相关基因及其ctDNA甲基化的引物组合物，从而建立了NGS定量检测胰腺癌ctDNA抑癌基因甲基化的方法，所述方法使用的引物组合物筛选抑癌基因异常高甲基化位点，高于正常值则判断为胰腺癌。方法简便，准确，可应用于胰腺癌的诊断、鉴别诊断和疗效评估，具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域：
本发明涉及胰腺癌筛查检测技术领域，具体涉及一种NGS定量检测胰腺癌ctDNA抑癌基因甲基化的方法。
技术背景：
胰腺癌是一种恶性程度极高的消化系统恶性肿瘤， 2015年国内癌症统计数据显示，每年新发胰腺癌超9万例，居恶性肿瘤第9位，每年因胰腺癌死亡近8万例，居所有恶性肿瘤第6位。目前胰腺癌的总体5年生存率仅9%左右，预后极差，严重危害人类健康。影像学和血清肿瘤标记物检测是诊断和监测胰腺癌治疗效果的主要手段，但仍存在许多不足。因此，当前临床上仍迫切需要发掘新的有足够敏感性和特异性的早期诊断和监测胰腺癌病情的指标与方法。近年来随着肿瘤基因组学的深入研究和高通量测序技术的发展，以循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、外泌体等为代表的液体活检技术为胰腺癌的精准诊治带来了新的曙光。许多研究表明，癌症的发生发展与抑癌基因的高甲基化密切相关。这些抑癌基因启动子区域DNA甲基化在肿瘤早期即可发生，并能特异性的反应肿瘤的情况。ctDNA具有与肿瘤细胞一致的遗传学特征，通过检测ctDNA抑癌基因的甲基化情况，能够在胰腺癌的早期诊断、鉴别诊断、疗效评估以及复发监测等方面提供帮助。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是提供一种NGS定量检测胰腺癌ctDNA抑癌基因甲基化的方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一种NGS定量检测胰腺癌ctDNA抑癌基因甲基化的方法，所述方法使用引物组合物进行NGS定量检测，并且所述引物组合物由如下引物对中的一种或多种组成：
引物对RASSF1A-1：由RASSF1A-1正向引物和RASSF1A-1反向引物组成；
引物对RASSF1A-2：由RASSF1A-2正向引物和RASSF1A-2反向引物组成；
引物对RASSF1A-3：由RASSF1A-3正向引物和RASSF1A-3反向引物组成；
引物对p16-1：由p16-1正向引物和p16-1反向引物组成；
引物对p16-2：由p16-2正向引物和p16-2反向引物组成；
引物对ppENK-1：由ppENK-1正向引物和ppENK-1反向引物组成；
引物对ppENK-2：由ppENK-2正向引物和ppENK-2反向引物4组成；
引物对EYA2-1：由EYA2-1正向引物和EYA2-1反正向引物组成；
引物对EYA2-2：由EYA2-2正向引物和EYA2-2反向引物组成；
引物对EYA2-3：由EYA2-3正向引物和EYA2-3反向引物组成；
其中，
所述RASSF1A-1正向引物的核苷酸序列为GGAAGGGGTAGTTAAGGGGTAG，为序列表序列5；
所述RASSF1A-1反向引物的核苷酸序列为AACCCTTTCTCAAAAAAAACCA，为序列表序列6；
所述RASSF1A-2正向引物的核苷酸序列为AAATGAGGGTTGTAGTTGTTGA，
为序列表序列7；
所述RASSF1A-2反向引物的核苷酸序列为AACAACACACTTAACCTACCCA，
为序列表序列8；
所述RASSF1A-3正向引物的核苷酸序列为GATGTGGGGATTTTTTTTTT，
为序列表序列9；
所述RASSF1A-3反向引物的核苷酸序列为CCCCCAAAATCCAAACTA，
为序列表序列10；
所述p16-1正向引物的核苷酸序列为AAAAATGGGTTAGATATAAAGGA，
为序列表序列11；
所述p16-1反向引物的核苷酸序列为CCTCTTCTAAATTTAAAAAACAAA，
为序列表序列12；
所述p16-2正向引物的核苷酸序列为GTTTTTTAGTTGGAAAGGAGGA，
为序列表序列13；
所述p16-2反向引物的核苷酸序列为TCCCCTCCCCTACTAACC，
为序列表序列14；
所述ppENK-1正向引物的核苷酸序列为ATTTTTTAATTGTTTTGGGTTTGT，为序列表序列15；
所述ppENK-1反向引物的核苷酸序列为TAAAACCACTTTATAATTAACCCCA，为序列表序列16；
所述ppENK-2正向引物的核苷酸序列为GTTTTTAATTGGAAAGGTGAAA，为序列表序列17；
所述ppENK-2反向引物的核苷酸序列为ATAAACCTACCCCTTTCCC，为序列表序列18；
所述EYA2-1正向引物的核苷酸序列为TAGGAAGGTATAAGGGTAGAGG，为序列表序列19；
所述EYA2-1反向引物的核苷酸序列为ATCCCATAAACACTACCTAAAAA，为序列表序列20；
所述EYA2-2正向引物的核苷酸序列为TGGTTTGTTTTTTTATGTGAATG，为序列表序列21；
所述EYA2-2反向引物的核苷酸序列为CCCAAACATAACCCCTATAAAA，为序列表序列22；
所述EYA2-3正向引物的核苷酸序列为AGGAGGTTGGGTTTTGGT，为序列表序列23；
所述EYA2-3反向引物的核苷酸序列为CCCTTCTCCTCCCTAAACC，为序列表序列24。
上述引物对RASSF1A-1、引物对RASSF1A-2和引物对RASSF1A-3用于检测RASSF1A基因的甲基化；
上述引物对p16-1和引物对p16-2用于检测p16基因的甲基化；
上述引物对ppENK-1和引物对ppENK-2用于检测ppENK基因的甲基化；
上述引物对EYA2-1、引物对EYA2-2和引物对EYA2-3用于检测EYA2基因的甲基化。
进一步的，所述引物对RASSF1A-1、引物对RASSF1A-2和引物对RASSF1A-3用于检测RASSF1A基因CpG位点的甲基化；
所述引物对p16-1和引物对p16-2用于检测p16基因CpG位点的甲基化；
所述引物对ppENK-1和引物对ppENK-2用于检测ppENK基因CpG位点的甲基化；
所述引物对EYA2-1、引物对EYA2-2和引物对EYA2-3用于检测EYA2基因CpG位点的甲基化。
本发明还提供一种NGS定量检测胰腺癌ctDNA抑癌基因甲基化的方法，所述方法采用PCR试剂组合物进行NGS定量检测，并且所述PCR试剂组合物由下列PCR试剂中的一种或多种组成：
PCR试剂1：由所述引物对RASSF1A-1、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合物组成；
PCR试剂2：由所述引物对RASSF1A-2、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合物组成；
PCR试剂3：由所述引物对RASSF1A-3、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合物组成；
PCR试剂4：由所述引物对p16-1、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合物组成；
PCR试剂5：由所述引物对p16-2、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合物组成；
PCR试剂6：由所述引物对ppENK-1、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合物组成；
PCR试剂7：由所述引物对ppENK-2、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合物组成；
PCR试剂8：由所述引物对EYA2-1、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合物组成；
PCR试剂9：由所述引物对EYA2-2、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合物组成；
PCR试剂10：由所述引物对EYA2-3、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合物组成。
本发明还提供了上述方法所述的含有上述引物组合物的试剂盒或含有上述PCR试剂组合物的试剂盒。
本发明还提供了上述方法所述的引物组合物或上述PCR试剂组合物在制备检测或辅助检测胰腺癌产品中的应用。
本发明通过对胰腺癌患者血浆ctDNA进行转化，预测基因CpG岛，针对5个基因设计多组不同的特异性引物，优化引物组成及浓度；在文库末端引入illuminate的特异性标签序列，利用带有Index序列的引物对ctDNA进行多重PCR扩增建立文库。扩增产物进行切胶回收获得最终文库后进行上机测序；对数据进行统计分析，最终检测ctDNA 5个抑癌基因中CpG位点的甲基化信息，并最终筛选得到可用于胰腺癌检测的相关基因及其ctDNA甲基化的引物组合物，从而建立了NGS定量检测胰腺癌ctDNA抑癌基因甲基化的方法，所述方法使用的引物组合物筛选抑癌基因异常高甲基化位点，高于正常值则判断为胰腺癌。方法简便，准确，可应用于胰腺癌的诊断、鉴别诊断和疗效评估，具有良好的临床应用前景。
具体实施方式
本发明通过提取胰腺癌患者血浆ctDNA，亚硫酸盐转化，检测转化效果并计算ctDNA浓度；利用软件对基因组区域进行分析，预测基因CpG岛；使用Bisulfite convertDNA设计5个基因的特异性引物，优化引物组成及浓度；在文库末端引入illuminate的特异性标签序列，利用带有Index序列的引物对ctDNA进行多重PCR扩增建立文库。扩增产物进行切胶回收获得最终文库后进行上机测序；对数据进行统计分析，最终检测ctDNA 5个抑癌基因CpG位点的甲基化信息。所述的检测方法，筛选抑癌基因异常高甲基化位点，高于正常值则判断为胰腺癌。
本发明通过研究证实胰腺癌患者血浆ctDNA4个抑癌基因（RASSF1A、p16、ppENK和EYA2）甲基化检测可应用于胰腺癌的诊断、鉴别诊断和疗效评估，具有良好的临床应用前景。
实施例1
1.检测6例胰腺癌患者手术前后（分别命名为1组和2组）、6例胰腺良性肿瘤患者术前（3组）和2例健康献血者（4组）血浆ctDNA 4个抑癌基因（RASSF1A、p16、ppENK和EYA2）上游1000bp至下游200bp区域的CpG位点甲基化。
（1）采集三组患者血20ml，3500r离心10min，提取上层血浆，立即冻存于-80℃冰箱；
（2）解冻血浆，取2ml血浆根据Qiagen公司提供的游离血浆DNA提取试剂盒的使用说明书，提取cfDNA，使用Zymo Research公司提供的甲基化转化试剂盒EZ methylation-gold kit对所提取的DNA进行亚硫酸盐转化及纯化。
（3）转化效果验证：使用ACTB引物验证样本转化效果，引物序列如下：5’-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3’ (sense),
5’-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3’ (antisense)。以已知浓度的标准样为标准品（10ng，2ng，0.4ng，0.08ng，0.016ng）构建标准曲线，每个样本做2次重复，评估亚硫酸盐转化的样本DNA含量。
（4）利用MethPrimer软件对5个抑癌基因（NPTX2-1、RASSF1A、p16、ppENK和EYA2）转录起始位点上游1000bp至下游200bp区域进行分析，预测CpG岛，使用Bisulfite ConvertDNA设计的基因特异性扩增引物，具体如下：
NPTX2-1正向引物：TTTTTGGGGGTTTTTGTTTATA（见序列表序列1）
NPTX2-1反向引物：CCTTATTCAACAAAACCTAAACTCA（见序列表序列2）
NPTX2-2正向引物：GGTTGTTTTTGTTGGAGAAAA（见序列表序列3）
NPTX2-2正向引物：CCCRAACTCTACCTCAAAAA（见序列表序列4）
RASSF1A-1正向引物：GGAAGGGGTAGTTAAGGGGTAG（见序列表序列5）
RASSF1A-1反向引物：AACCCTTTCTCAAAAAAAACCA（见序列表序列6）
RASSF1A-2正向引物：AAATGAGGGTTGTAGTTGTTGA（见序列表序列7）
RASSF1A-2反向引物：AACAACACACTTAACCTACCCA（见序列表序列8）
RASSF1A-3正向引物：GATGTGGGGATTTTTTTTTT（见序列表序列9）
RASSF1A-3反向引物：CCCCCAAAATCCAAACTA（见序列表序列10）
p16-1正向引物：AAAAATGGGTTAGATATAAAGGA（见序列表序列11）
p16-1反向引物：CCTCTTCTAAATTTAAAAAACAAA（见序列表序列12）
p16-2正向引物：GTTTTTTAGTTGGAAAGGAGGA（见序列表序列13）
p16-2反向引物：TCCCCTCCCCTACTAACC（见序列表序列14）
ppENK-1正向引物：ATTTTTTAATTGTTTTGGGTTTGT（见序列表序列15）
ppENK-1反向引物：TAAAACCACTTTATAATTAACCCCA（见序列表序列16）
ppENK-2正向引物：GTTTTTAATTGGAAAGGTGAAA（见序列表序列17）
ppENK-2反向引物：ATAAACCTACCCCTTTCCC（见序列表序列18）
EYA2-1正向引物：TAGGAAGGTATAAGGGTAGAGG（见序列表序列19）
EYA2-1反向引物：ATCCCATAAACACTACCTAAAAA（见序列表序列20）
EYA2-2正向引物：TGGTTTGTTTTTTTATGTGAATG（见序列表序列21）
EYA2-2反向引物：CCCAAACATAACCCCTATAAAA（见序列表序列22）
EYA2-3正向引物：AGGAGGTTGGGTTTTGGT（见序列表序列23）
EYA2-3反向引物：CCCTTCTCCTCCCTAAACC（见序列表序列24）
（5）抑癌基因甲基化检测建库方法按照上海翌圣生物科技公司的DNA建库试剂盒说明书进行操作，具体反应体系：
反应过程：第一阶段 95℃预变性5min；第二阶段(40个循环) 95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s；第三阶段 72℃延伸5min。
(6)验证文库的片段长度和定量后，通过HiSeq X Ten平台对上述构建的文库进行高通量测序。
（7） 利用FLASH软件，对通过质量初筛的双端序列根据重叠碱基进行配对连接（参数设置，碱基质量值类型，33；reads长度，150；片段长度，250；文库的偏差，80）。根据每个样本所对应的Index信息（即Barcode序列，为序列起始处用于识别样本的一小段碱基序列），将连接后的序列识别分配入对应样本，从而获得每个样本的有效序列。结合BWA和Samtools软件（默认参数），将序列比对到目标参考序列上，获得CpG位点的CT碱基对信息，并进行统计分析。
(8)CpG位点甲基化率=C/C+T。通过对比三组数据位点甲基化率，筛选出具有统计学意义的位点(P＜0.05)，可作为胰腺癌诊断和鉴别诊断的特异性位点。计算方法举例如下：例如实验组：RASSF1A (-797)， C=12，T=5025，甲基化率=（C/C+T）×100%=24%。
(9)筛选出的具有统计学意义的CpG位点：
实验表明， RASSF1A、p16、ppENK和EYA2 基因甲基化检测结果与胰腺癌疾病有特异性表现，能够作为胰腺癌患者的诊断或辅助诊断方法，而NPTX2-1基因甲基化检测结果准确度并不高，不能作为胰腺癌诊断和鉴别诊断的特异性位点。
上述具体实施例详细说明本发明、本领域技术人员应清楚，本发明并不限于此处所列出的肿瘤及基因，其保护范围所附权利要求书限定，下面的实施例仅仅是以示例的方式说明本发明，使本发明更易于理解。
序列表
<110> 南昌大学第一附属医院
<120> 一种NGS定量检测胰腺癌ctDNA抑癌基因甲基化的方法
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<400> 1
tttttggggg tttttgttta ta 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<400> 2
ccttattcaa caaaacctaa actca 25
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<400> 3
ggttgttttt gttggagaaa a 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<400> 4
cccraactct acctcaaaaa 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<400> 5
ggaaggggta gttaaggggt ag 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<400> 6
aaccctttct caaaaaaaac ca 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<400> 7
aaatgagggt tgtagttgtt ga 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<400> 8
aacaacacac ttaacctacc ca 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<400> 9
gatgtgggga tttttttttt 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<400> 10
cccccaaaat ccaaacta 18
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<400> 11
aaaaatgggt tagatataaa gga 23
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<400> 12
cctcttctaa atttaaaaaa caaa 24
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<400> 13
gttttttagt tggaaaggag ga 22
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<400> 14
tcccctcccc tactaacc 18
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<400> 15
attttttaat tgttttgggt ttgt 24
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<400> 16
taaaaccact ttataattaa cccca 25
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<400> 17
gtttttaatt ggaaaggtga aa 22
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<400> 18
ataaacctac ccctttccc 19
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<400> 19
taggaaggta taagggtaga gg 22
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<400> 20
atcccataaa cactacctaa aaa 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<400> 21
tggtttgttt ttttatgtga atg 23
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<400> 22
cccaaacata acccctataa aa 22
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<400> 23
aggaggttgg gttttggt 18
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<400> 24
cccttctcct ccctaaacc 19
Claims (6)
1.一种NGS定量检测胰腺癌ctDNA抑癌基因甲基化的方法，其特征在于，所述方法使用引物组合物进行NGS定量检测，并且所述引物组合物由如下引物对中的一种或多种组成：
引物对RASSF1A-1：由RASSF1A-1正向引物和RASSF1A-1反向引物组成；
引物对RASSF1A-2：由RASSF1A-2正向引物和RASSF1A-2反向引物组成；
引物对RASSF1A-3：由RASSF1A-3正向引物和RASSF1A-3反向引物组成；
引物对p16-1：由p16-1正向引物和p16-1反向引物组成；
引物对p16-2：由p16-2正向引物和p16-2反向引物组成；
引物对ppENK-1：由ppENK-1正向引物和ppENK-1反向引物组成；
引物对ppENK-2：由ppENK-2正向引物和ppENK-2反向引物4组成；
引物对EYA2-1：由EYA2-1正向引物和EYA2-1反正向引物组成；
引物对EYA2-2：由EYA2-2正向引物和EYA2-2反向引物组成；
引物对EYA2-3：由EYA2-3正向引物和EYA2-3反向引物组成；
其中，
所述RASSF1A-1正向引物的核苷酸序列为
GGAAGGGGTAGTTAAGGGGTAG，为序列表序列5；
所述RASSF1A-1反向引物的核苷酸序列为
AACCCTTTCTCAAAAAAAACCA，为序列表序列6；
所述RASSF1A-2正向引物的核苷酸序列为
AAATGAGGGTTGTAGTTGTTGA，为序列表序列7；
所述RASSF1A-2反向引物的核苷酸序列为
AACAACACACTTAACCTACCCA，为序列表序列8；
所述RASSF1A-3正向引物的核苷酸序列为GATGTGGGGATTTTTTTTTT，为序列表序列9；
所述RASSF1A-3反向引物的核苷酸序列为CCCCCAAAATCCAAACTA，为序列表序列10；
所述p16-1正向引物的核苷酸序列为AAAAATGGGTTAGATATAAAGGA，为序列表序列11；
所述p16-1反向引物的核苷酸序列为CCTCTTCTAAATTTAAAAAACAAA，为序列表序列12；
所述p16-2正向引物的核苷酸序列为GTTTTTTAGTTGGAAAGGAGGA，为序列表序列13；
所述p16-2反向引物的核苷酸序列为TCCCCTCCCCTACTAACC，为序列表序列14；
所述ppENK-1正向引物的核苷酸序列为ATTTTTTAATTGTTTTGGGTTTGT，为序列表序列15；
所述ppENK-1反向引物的核苷酸序列为
TAAAACCACTTTATAATTAACCCCA，为序列表序列16；
所述ppENK-2正向引物的核苷酸序列为GTTTTTAATTGGAAAGGTGAAA，为序列表序列17；
所述ppENK-2反向引物的核苷酸序列为ATAAACCTACCCCTTTCCC，为序列表序列18；
所述EYA2-1正向引物的核苷酸序列为TAGGAAGGTATAAGGGTAGAGG，为序列表序列19；
所述EYA2-1反向引物的核苷酸序列为ATCCCATAAACACTACCTAAAAA，为序列表序列20；
所述EYA2-2正向引物的核苷酸序列为TGGTTTGTTTTTTTATGTGAATG，为序列表序列21；
所述EYA2-2反向引物的核苷酸序列为CCCAAACATAACCCCTATAAAA，为序列表序列22；
所述EYA2-3正向引物的核苷酸序列为AGGAGGTTGGGTTTTGGT，为序列表序列23；
所述EYA2-3反向引物的核苷酸序列为CCCTTCTCCTCCCTAAACC，为序列表序列24。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述引物对RASSF1A-1、引物对RASSF1A-2和引物对RASSF1A-3用于检测RASSF1A基因的甲基化；
所述引物对p16-1和引物对p16-2用于检测p16基因的甲基化；
所述引物对ppENK-1和引物对ppENK-2用于检测ppENK基因的甲基化；
所述引物对EYA2-1、引物对EYA2-2和引物对EYA2-3用于检测EYA2基因的甲基化。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述引物对RASSF1A-1、引物对RASSF1A-2和引物对RASSF1A-3用于检测RASSF1A基因CpG位点的甲基化；
所述引物对p16-1和引物对p16-2用于检测p16基因CpG位点的甲基化；
所述引物对ppENK-1和引物对ppENK-2用于检测ppENK基因CpG位点的甲基化；
所述引物对EYA2-1、引物对EYA2-2和引物对EYA2-3用于检测EYA2基因CpG位点的甲基化。
4.一种NGS定量检测胰腺癌ctDNA抑癌基因甲基化的方法，其特征在于，所述方法采用PCR试剂组合物进行NGS定量检测，并且所述PCR试剂组合物由下列PCR试剂中的一种或多种组成：
PCR试剂1：由权利要求1所述的引物对RASSF1A-1、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合物组成；
PCR试剂2：由权利要求1所述的引物对RASSF1A-2、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合物组成；
PCR试剂3：由权利要求1所述的引物对RASSF1A-3、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合物组成；
PCR试剂4：由权利要求1所述的引物对p16-1、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合物组成；
PCR试剂5：由权利要求1所述的引物对p16-2、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合物组成；
PCR试剂6：由权利要求1所述的引物对ppENK-1、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合物组成；
PCR试剂7：由权利要求1所述的引物对ppENK-2、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合物组成；
PCR试剂8：由权利要求1所述的引物对EYA2-1、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合物组成；
PCR试剂9：由权利要求1所述的引物对EYA2-2、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合物组成；
PCR试剂10：由权利要求1所述的引物对EYA2-3、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合物组成。
5.权利要求1-3中任一项所述方法中使用的含有引物组合物的试剂盒或权利要求4所述方法中使用的含有PCR试剂组合物的试剂盒。
6.权利要求1-3中任一项所述方法中使用的引物组合物或权利要求4所述方法中使用的PCR试剂组合物在制备检测或辅助检测胰腺癌产品中的应用。
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| AKASH BARARIA: "Differential methylation landscape of pancreatic ductal adenocarcinoma and its precancerous lesions", 《HEPATOBILIARY & PANCREATIC DISEASES INTERNATIONAL》 * |
| FRANCESCO NATALE: "Deciphering DNA methylation signatures of pancreatic cancer and pancreatitis", 《CLINICAL EPIGENETICS 》 * |
| STINE DAM HENRIKSEN: "Cell-free DNA promoter hypermethylation in plasma as a diagnostic marker for pancreatic adenocarcinoma", 《CLIN EPIGENETICS.》 * |
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