CN113584062A - 融合成像基因及其慢病毒表达质粒、慢病毒、细胞，其制备方法和用途 - Google Patents

融合成像基因及其慢病毒表达质粒、慢病毒、细胞，其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种融合成像基因及其慢病毒表达质粒、慢病毒和细胞，其制备方法和用途。融合成像基因包括生物发光成像基因、荧光蛋白基因和钙成像基因，三种基因之间通过连接基团连接。将融合基因插入改造后的慢病毒表达质粒，获得携带融合成像基因的慢病毒颗粒。慢病毒颗粒可用于不同类型细胞的感染，获得融合成像基因标记的细胞。经本发明中的融合成像基因标记的细胞，可以同步进行细胞的数量成像检测、形态成像检测以及钙活动功能成像检测，在细胞命运追踪方面具有重要用途。

Description

融合成像基因及其慢病毒表达质粒、慢病毒、细胞，其制备方 法和用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种融合成像基因及其慢病毒表达质粒、慢病毒、细胞，其制备方法和用途。
背景技术
细胞命运的成像示踪在生物医学研究领域具有广泛与重要用途，如细胞对特定刺激的应答评价、细胞移植后的评价等等。以细胞移植研究为例，细胞命运示踪，包括存活、分布、分化、功能整合等，是评价其安全性、有效性的重要指标。以往的研究中，由于缺乏多模态成像基因标记的细胞株，无法在同一细胞中实现细胞移植后存活/分布、分化/形态、功能整合的同时示踪。为了实现上述不同的示踪目的，研究人员只能采用折中的办法，利用不同成像基因标记的种子细胞分别进行存活/分布、分化/形态、功能整合等评价，通过综合不同标记细胞追踪的数据对细胞命运进行综合分析。典型的报道如2016年Nature文章(Nature,2016,539：248-253)关于移植胚胎神经元在大脑新皮层中整合的研究，为了评价胚胎神经元在宿主中的结构整合，研究人员通过红色荧光蛋白标记的神经元进行移植，通过组织病理学检测其结构整合情况；为了评价胚胎神经元在受体中的功能整合，利用Gcamp6f标记的神经元进行移植，利用钙成像评价其功能整合情况。最后，通过两种细胞的移植结果共同说明移植胚胎神经元能够在受体大脑中实现结构与功能的整合。然而，上述方法不仅增加了研究的成本与工作量，同时由于结构与功能整合的评价在相互独立的动物中进行(即非同步评价)，也可能影响结果的可靠性，如结构整合的细胞中可能未发生功能整合，发生功能整合的细胞结构整合水平未知。因此，实现细胞不同命运的同步示踪具有重要意义。
获得多模态成像基因标记的种子细胞，是解决细胞不同命运同步评价的关键，具有重要应用价值。慢病毒是进行稳定基因转染标记最常用的载体，但尚未有携带多模态成像基因(数量成像、形态成像、功能成像)的慢病毒颗粒及其转染标记细胞的报道，主要原因是实现上述目的存在多个的技术难点，包括：1)多个报告基因长度较大，一般慢病毒载体不易容纳，且不易成功转染目的细胞。尤其是使用多个启动子分别驱动各个报告基因的表达，会进一步增加外源基因的长度，更难实现慢病毒颗粒的有效包装与目标细胞的成功转染；2)连接多个报告基因形成融合的多模态成像基因，使用一个启动子进行驱动表达，可以节省启动子占据的长度，但不适当的融合会由于各个基因产物之间空间上的相互影响而导致功能失活。此外，融合的基因也可能由于长度较大，难以获得高活性的慢病毒。克服大片段基因在慢病毒中的插入以及融合基因的功能保持等问题，构建携带多模态成像基因的慢病毒，进一步用于不同细胞的多模成像基因稳定基因标记，具有重要科学意义与实用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种携带融合的多模态成像基因的慢病毒及其用途。利用该慢病毒颗粒，可转染制备多模态成像基因稳定标记的细胞，如人多能干细胞(ESC/iPSC)，进一步可以对标记细胞本身及其分化来源的细胞，同步实现单细胞水平的数量成像检测、组织学水平的细胞形态检测以及亚细胞水平钙活动功能检测。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种融合成像基因，所述融合成像基因包括生物发光成像基因、荧光蛋白基因和钙成像基因，三种所述基因之间通过连接基团连接；
优选的，所述生物发光成像基因选自Nanoluc基因；
更优选的，所述荧光蛋白基因基因选自mRuby2基因；
进一步优选的，所述钙成像基因选自Gcamp6f基因。
本发明还涉及一种携带有上述的融合成像基因的慢病毒表达质粒；优选的，所述的携带融合成像基因的慢病毒表达质粒序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还涉及一种慢病毒表达质粒的制备方法，至少包括以下步骤：
S21、对慢病毒表达质粒进行改造：
所述改造优选包括：
S211、经SphI与BamHI限制性内切酶双酶切，去除pLenti-EF1α-FH-CMV-CopGFP&Puro质粒中的EF-1α启动子，得到骨架质粒；所述pLenti-EF1α-FH-CMV-CopGFP&Puro质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
S212、经过酶连接将人泛素启动子hUbc插入到所述骨架质粒中，获得pLenti-Ubc-FH-CMV-CopGFP&Puro中间质粒；
S213、经PmeI与BamHI双酶切去除pLenti-Ubc-FH-CMV-CopGFP&Puro质粒中Ubc下游至Puro基因位点的序列，即SEQ ID NO.3所示核苷酸序列中3826～6112位核苷酸序列；
S22、将上述的融合成像基因插入到改造后的慢病毒表达质粒中，获得携带融合基因探针的慢病毒表达质粒；
优选包括：利用所述融合成像基因两端同样的酶切位点，将所述融合成像基因插入到所述改造后的中间质粒中，获得pLenti-Ubc-Nanoluc-mRuby2-Gcamp6f质粒，并经转化、测序等获得所述慢病毒表达质粒，所述慢病毒表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还涉及一种携带有上述融合成像基因的慢病毒。
本发明还涉及上述慢病毒的制备方法，至少包括以下步骤：
将pLenti-Ubc-Nanoluc-mRuby2-Gcamp6f质粒与慢病毒包装质粒PAX2、pMD2G共转染293T细胞，获得携带融合成像基因的慢病毒颗粒；
优选的，pLenti-Ubc-Nanoluc-mRuby2-Gcamp6f质粒、质粒PAX2、质粒pMD2G3的质量比为3～4：1.5～2.5：0.5～1.5，优选3：2：1。
本发明还涉及上述的融合成像基因标记的细胞或由上述慢病毒感染的细胞，优选的，所述细胞选自人胚胎干细胞和人多能干细胞。
本发明还涉及上述细胞的应用，所述应用包括：在细胞成像检测中的应用；在细胞命运追踪方面的应用；或在制备用于细胞命运追踪或细胞成像检测的制剂或试剂盒中的应用；优选的，所述细胞成像检测为同时实现细胞数量成像、形态成像和钙活动功能的检测。
本发明技术方案的有益效果至少包括：
本发明提供的携带融合融合成像基因的慢病毒，能够用于各种细胞稳定的多模态成像基因标记，实现对细胞数量、细胞形态、细胞钙功能活动的多模态成像检测，实现对细胞上述不同命运的同时追踪，为细胞命运评价提供更有力的工具。
附图说明
图1为本发明一实施例中融合的多模态成像基因的结构示意图。
图2为本发明一实施例中用于改造的慢病毒原始质粒图谱。
图3为本发明一实施例中构建的携带融合的多模态成像基因的慢病毒表达质粒图谱。
图4为本发明一实施例中构建的携带融合的多模态成像基因的慢病毒表达质粒(质粒总长度<10000bp)，与包装质粒共转染293T细胞的效率。
图5为本发明一实施例中，常规携带单报告基因的慢病毒表达质粒(质粒总长度<10000bp)与包装质粒共转染293T细胞的效率。
图6为本发明一实施例中，携带多个成像基因的常规病毒表达质粒(质粒总长度>11000bp)与包装质粒共转染293T细胞的效率。
图7为本发明一实施例中携带融合的多模态成像基因的慢病毒颗粒的活性鉴定。
图8为本发明一实施例中利用携带融合的多模态成像基因的慢病毒颗粒转染标记的人胚胎干细胞(hESC)。
图9为本发明一实施例中利用携带融合的多模态成像基因的慢病毒颗粒转染标记的人诱导型多能干细胞(hiPSC)。
图10为本发明一实施例中融合的多模态成像基因标记的人iPSC通过生物发光成像进行数量定量。
图11为本发明一实施例中融合的多模态成像基因标记的人iPSC形态成像(mRuby2)与钙活动功能成像(Gcamp6f)。
图12为本发明一实施例中融合的多模态成像基因标记的人iPSC分化形成的神经网络形态成像。
图13为本发明一实施例中融合的多模态成像基因标记的人iPSC分化形成的神经网络钙活动功能成像。
图14为本发明一实施例中融合的多模态成像基因标记的人iPSC培育形成的类脑器官在ZIKA感染过程中细胞活力(代表活细胞数量)定量成像。
图15为本发明一实施例中融合的多模态成像基因标记的人iPSC分化心肌细胞形态成像与钙活动功能成像。
图16为本发明一实施例中融合的多模态成像基因标记的人iPSC分化的心肌细胞在节律波动过程中的钙活动实时成像。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。
本发明实施例涉及一种融合成像基因，融合成像基因包括生物发光成像基因、荧光蛋白基因和钙成像基因，三种基因之间通过连接基团连接。
在某一具体实施方式中，生物发光成像基因选自Nanoluc基因，荧光蛋白基因基因选自mRuby2基因，钙成像基因选自Gcamp6f基因。
在某一具体实施方式中，连接基团选自多肽链，多肽链优选含有2～8个氨基酸，更优选的，所述多肽链中的氨基酸选自S(丝氨酸)、L(亮氨酸)、D(天冬氨酸)和G(甘氨酸)中的两种、三种或四种所构成的具有柔性的多肽链；
进一步优选的，多肽链选自S-L-D-S或G-S-S-G。
在某一具体实施方式中，Nanoluc基因和mRuby2基因通过S-L-D-S连接；mRuby2基因和Gcamp6f基因通过G-S-S-G连接；本发明实施例经研究发现，三个报告基因之间分别通过S-L-D-S与G-S-S-G柔性多肽链连接融合表达，可以保证每个基因产物的正确折叠与活性。
具体的，多模态成像基因的结构示意图如图1所示。融合的三个报告基因分别为进行细胞定量成像的Nanoluc、细胞形态成像观察的mRuby2、细胞钙活动功能成像的Gcamp6f。Nanoluc与mRuby2蛋白之间通过S-L-D-S(丝氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-丝氨酸)连接，mRuby2与Gcamp6f蛋白之间通过G-S-S-G(甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸)连接，能够保持融合蛋白中各个蛋白的活性。
在某一具体实施方式中，融合成像基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明实施例还涉及该融合成像基因的构建方法，至少包括以下步骤：
S11、获得Nanoluc基因序列，去掉尾部终止密码子，在Nanoluc基因末尾添加一个S氨基酸基因序列及Xhol酶切位点序列；优选通过基因合成；
S12、获得mRuby2基因序列，去掉尾部终止密码子，在mRuby2前端先后加上SalI酶切位点序列与一个S氨基酸；mRuby2后端加一个G氨基酸序列及XbaI酶切位点序列；优选通过基因合成；
S13、获得Gcamp6f基因序列，在基因前端加上一个G氨基酸与SpeI酶切位点，基因尾端加入PmeI酶切位点；优选的，通过PCR方法进行扩增获得Gcamp6f基因序列；更优选的，引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；
S14、利用Nanoluc尾端的Xhol酶切位点与mRuby2前端SalI酶切位点，分别使用Xhol酶与SalI酶切割Nanoluc基因与Xhol基因，纯化后分别获得Nanoluc基因、mRuby2基因的酶切产物；
S15、将上述Nanoluc基因的酶切产物与mRuby2基因的酶切产物连接，经扩增、纯化、连接到T载体、转化感受态细胞、培养、测序获得Nanoluc-S-L-D-S-mRuby2质粒；
S16、PCR扩增Gcamp6f基因，使用XbaI酶处理Nanoluc-S-L-D-S-mRuby2质粒，SpeI酶处理Gcamp6f基因，纯化酶切产物；
S17、将Nanoluc-S-L-D-S-mRuby2基因和Gcamp6f基因连接，经扩增、纯化、连接到T载体、转化感受态细胞、培养、测序获得含有融合成像基因的菌种。
具体步骤为：
(1)融合的多模态成像基因的设计与构建
1)Nanoluc基因序列通过基因合成获得，去掉尾部终止密码子，并在Nanoluc基因末尾添加一个S氨基酸基因序列(TCG)及Xhol酶切位点序列；
2)红色荧光蛋白mRuby2的基因序列通过基因合成获得，去掉尾部终止密码子，并在mRuby2前端先后加上SalI酶切位点序列(Xhol同尾酶)与一个S氨基酸(TCG)；mRuby2后端加一个G氨基酸序列(GGA)及XbaI酶切位点序列；
3)携带Gcamp6f基因的质粒来自北京麦津生物，通过PCR方法进行扩增Gcamp6f基因，引物设计时分别在基因前端先后加上一个G氨基酸(GGA)与SpeI酶切位点(XbaI同尾酶)，基因尾端加入PmeI酶切位点。引物序列如下：
SEQ ID NO.4：上游引物:
actagtggaatgggttctcatcatcatcatcatcatggt(下划线部分为SpeI酶切位点和G氨基酸密码子)
SEQ ID NO.5：下游引物:
gtttaaactcacttcgctgtcatcatttgta(下划线部分为PmeI酶切位点)
4)利用Nanoluc尾端的Xhol酶切位点与mRuby2前端SalI酶切位点，分别使用Xhol酶与SalI酶切割Nanoluc基因与Xhol基因，并通过琼脂糖电泳纯化切割产物；
5)利用Xhol与SalI为同尾酶的特性，将上述Nanoluc基因酶切产物与mRuby2酶切产物连接；
6)通过PCR扩增上述连接产物，并通过琼脂糖凝胶电泳回收纯化扩增的产物，进一步将纯化的产物连接到T载体，转化DH5α感受态细胞；
7)转化后的细胞涂于含有氨苄的LB固体培养基，37℃孵箱培养24小时；
8)挑取细菌单克隆，转移到一个试管中(含氨苄的LB液体培养基)扩增并编号，培养至培养液浑浊；
9)取上述每一试管菌液1mL，交测序公司测序，确定基因序列完全正确的Nanoluc-S-L-D-S-mRuby2质粒，保存备用；
10)PCR扩增Gcamp6f基因，使用XbaI酶处理上述Nanoluc-S-L-D-S-mRuby2基因，SpeI酶处理Gcamp6f基因，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化酶切产物；
11)重复前述5)-9)步骤，经连接、转化、测序等获得含融合基因Nanoluc-S-L-D-S-mRuby2-G-S-S-G-Gcamp6f的菌种，保存备用。
本发明实施例第三方面提供一种上述融合成像基因的慢病毒表达质粒。优选的，携带融合成像基因的慢病毒表达质粒序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明实施例第四方面提供一种上述融合成像基因的慢病毒表达质粒的制备方法，由于融合的多模态成像基因总长度较大，插入常规的慢病毒表达质粒可能导致病毒包装成功率低、活性低，难以开展后期细胞转染。因此，本发明以维真生物pLenti-EF1α-FH-CMV-CopGFP&Puro质粒为骨架(用于改造的慢病毒的原始质粒图谱如图2，核苷酸序列如SEQID NO.3所示)，首先为了保证基因在不同细胞中广泛表达，酶切去掉EF1α启动子，并替换成人泛素化启动子hUbc。随后，酶切删除Ubc启动子下游至Puro基因的序列，为外源基因的插入提供更大的空间。
至少包括以下步骤：
S21、对慢病毒表达质粒进行改造：
优选包括：
S211、经SphI与BamHI限制性内切酶双酶切，去除pLenti-EF1α-FH-CMV-CopGFP&Puro质粒中的EF-1α启动子，得到骨架质粒；
S212、经过酶连接将人泛素启动子hUbc插入到骨架质粒中，获得pLenti-Ubc-FH-CMV-CopGFP&Puro中间质粒；
S213、经PmeI和BamHI双酶切去除pLenti-Ubc-FH-CMV-CopGFP&Puro质粒中Ubc下游至Puro基因位点的序列，即SEQ ID NO.3所示核苷酸序列中3826～6112位核苷酸序列；
S22、将上述融合成像基因插入到改造后的慢病毒表达质粒中，获得携带融合基因探针的慢病毒表达质粒；
优选包括：
利用融合成像基因两端同样的酶切位点，将融合成像基因插入到中间质粒中，获得pLenti-Ubc-Nanoluc-mRuby2-Gcamp6f质粒，并经转化、测序等获得慢病毒表达质粒。
具体的，慢病毒表达质粒改造与融合成像基因的插入主要通过以下步骤来实现：
1)首先经SphI与BamHI限制性内切酶双酶切，去除pLenti-EF1α-FH-CMV-CopGFP&Puro质粒中的EF-1α启动子；
2)经过酶连接将人泛素启动子hUbc插入到骨架质粒中，取代EF-1α启动子，获得pLenti-Ubc-FH-CMV-CopGFP&Puro中间质粒，经转化、测序获得序列完全正确的质粒备用；
3)使用BamHI与PmeI双酶切去除pLenti-Ubc-FH-CMV-CopGFP&Puro质粒中Ubc下游至Puro基因位点的序列，即SEQ ID NO.3所示核苷酸序列中3826～6112位核苷酸序列；
4)利用前述制备的Nanoluc-mRuby2-Gcamp6f融合多报告基因两端同样的酶切位点(BamHI与PmeI)，将融合基因插入到上述酶切质粒中，获得pLenti-Ubc-Nanoluc-mRuby2-Gcamp6f质粒，并经转化、测序等获得序列完全正确的慢病毒表达质粒备用。获得的多模态成像基因的慢病毒表达质粒图谱如图3所示，融合多模态成像基因由UBC启动子驱动，质粒骨架经改造删除了图2原始质粒中puro等筛选基因及启动子序列，为外源基因的插入提供更多的空间。融合多模态成像基因插入后表达质粒总长度保持在10000bp以下，与常规慢病毒表达质粒长度相当。
本发明实施例第五方面涉及一种携带有上述的融合成像基因的慢病毒。这一慢病毒可以用于不同细胞的转染标记，获得融合成像基因稳定标记的细胞，从而用于细胞不同命运的多模态成像追踪，包括定量成像、形态成像以及钙活动功能成像。
本发明实施例第六方面涉及上述慢病毒的制备方法，由上述pLenti-Ubc-Nanoluc-mRuby2-Gcamp6f质粒与慢病毒包装质粒共转染细胞，包装获得的携带融合成像基因的慢病毒。至少包括以下步骤：
将pLenti-Ubc-Nanoluc-mRuby2-Gcamp6f质粒与慢病毒包装质粒PAX2、pMD2G共转染293T细胞，获得携带融合成像基因的慢病毒颗粒；
优选的，pLenti-Ubc-Nanoluc-mRuby2-Gcamp6f质粒、质粒PAX2、质粒pMD2G3的质量比为3：2：1。
本发明实施例第七方面涉及上述融合成像基因标记的细胞或由上述慢病毒感染的细胞，优选的，细胞选自人胚胎干细胞和人多能干细胞。
本发明实施例第八方面涉及上述细胞在同时实现细胞数量成像、形态成像和钙活动功能成像检测中的应用。
实施例1：携带融合多模态成像基因的慢病毒颗粒制备
(1)融合的多模态成像基因的设计与构建
1)为了减小多个成像基因融合表达对蛋白折叠与空间构象的影响，维持各个蛋白的活性，Nanoluc、mRuby2、Gcamp6f之间分别通过柔性多肽序列S-L-D-S(SEQ ID NO.8)及G-S-S-G(SEQ ID NO.9)作为连接基团(Linker)进行连接，如图1所示多基因融合表达设计结构图；
2)分别通过基因合成获得Nanoluc基因、mRuby2基因，去掉尾部终止密码子，在Nanoluc基因前端加BamHI酶切序列(GGATCC)，末尾添加一个S氨基酸基因序列(TCG)及Xhol酶切序列(CTCGAG)；mRuby2前端先后加上SalI酶切序列(GTCGAC，Xhol同尾酶)与一个S氨基酸(TCG)；mRuby2后端加一个G氨基酸序列(GGA)及XbaI酶切序列(TCTAGA)；
3)携带Gcamp6f基因的质粒来自北京麦津生物，通过PCR方法进行扩增Gcamp6f基因，引物设计时分别在基因前端先后加上一个G氨基酸(GGA)与SpeI酶切位点(XbaI同尾酶)，基因尾端加入PmeI酶切位点序列。引物序列如下：
SEQ ID NO.4：上游引物:
actagtggaatgggttctcatcatcatcatcatcatggt(下划线部分为SpeI酶切位点和G氨基酸密码子)；
SEQ ID NO.5：下游引物:
gtttaaactcacttcgctgtcatcatttgta(下划线部分为PmeI酶切位点序列)。
4)利用Nanoluc尾端的Xhol酶切位点与mRuby2前端SalI酶切位点，分别使用XhoI酶与SalI酶(购自Thermo公司)切割Nanoluc基因与mRuby2基因，并通过琼脂糖电泳纯化切割产物；利用Xhol与SalI为同尾酶的特性，将上述Nanoluc基因酶切产物与mRuby2酶切产物连接；通过PCR扩增上述连接产物，并通过琼脂糖凝胶电泳回收纯化扩增产物，进一步将纯化的产物连接到T载体(购自Takara公司)，转化DH5α感受态细胞(购自博迈德公司)；
5)转化后的细胞涂于含有氨苄的LB固体培养基，37℃孵箱培养24小时；无菌试管中加入约5mL含氨苄的LB液体培养基，并分别编号，挑取细菌单克隆，每一克隆转移到一个试管中，培养扩增；取上述每一试管菌液1mL，交测序公司测序，确定基因序列完全正确的Nanoluc-S-L-D-S-mRuby2菌液，扩增提取质粒，保存备用；
6)PCR扩增Nanoluc-S-L-D-S-mRuby2基因，
SEQ ID NO.6：上游引物：
ggatccatggtcttcacactcgaagatttcgt(下划线为BamHI酶切序列)，
SEQ ID NO.7：下游引物：
tctagatcccttgtacagctcgtccatcccaccac(下划线为XbaI酶切位点)；
采用XbaI酶(Thermo公司)处理PCR产物，同时使用SpeI酶(购自Thermo公司)处理Gcamp6f基因扩增产物，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化酶切产物；
7)按照前述4)-5)步骤同样方法，经连接、转化、测序等获得含融合基因Nanoluc-S-L-D-S-mRuby2-G-S-S-G-Gcamp6f且序列完全正确的菌液，扩增提取质粒(T载体质粒)，保存备用。如SEQ ID NO.1所示，构建得到融合成像基因的序列。
(2)携带融合成像基因的慢病毒表达质粒构建
1)以维真生物pLenti-EF1α-FH-CMV-CopGFP&Puro质粒为骨架(如图2，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，经SphI与BamHI限制性内切酶(购自Thermo公司)双酶切，去除原始质粒中的EF-1α启动子；
2)经过酶连接将人泛素启动子hUbc插入到骨架质粒中，取代EF-1α启动子，获得pLenti-Ubc-FH-CMV-CopGFP&Puro质粒；
3)酶连接产物转化DH5α感受态细胞；转化后的细胞涂于含有氨苄的LB固体培养基，37℃孵箱培养24小时；无菌试管中加入约5mL含氨苄的LB液体培养基,并分别编号，挑取细菌单克隆，每一克隆转移到一个试管中，培养扩增；取上述每一试管菌液1mL，交测序公司测序，确定基因序列完全正确的菌液，扩增，提取质粒，保存备用；
4)使用BamHI与PmeI双酶切去除pLenti-Ubc-FH-CMV-CopGFP&Puro质粒中Ubc下游至Puro基因位点的序列，即SEQ ID NO.3所示核苷酸序列中3826～6112位核苷酸序列；
5)利用前述制备的Nanoluc-mRuby2-Gcamp6f融合成像基因两端同样的酶切位点(BamHI与PmeI)，通过酶切含有上述融合基因的T载体质粒，获得融合基因片段，随后通过DNA连接酶(购自Promega公司)连接，将融合基因插入到上述酶切质粒中Ubc启动子下游，获得pLenti-Ubc-Nanoluc-mRuby2-Gcamp6f质粒；
6)同上述步骤3)，获得基因序列完全正确的质粒，保存备用。
如图3所示，构建成功的携带融合基因的慢病毒表达质粒结构图谱，质粒基因序列如SEQ ID NO.1所示。
(3)携带融合的多模态成像基因的慢病毒制备
使用上述pLenti-Ubc-Nanoluc-mRuby2-Gcamp6f质粒，与包装质粒PAX2、PMD2G等以3：2：1比例，按常规慢病毒包装方法(参考PLoS One 2013；8(6):e66369.)共转染293T细胞，转染48小时后观察荧光蛋白的转染效率初步判断包装效率。实验结果如图4所示。图4为多模态成像基因插入到改造后的慢病毒表达质粒(质粒总长度<10000bp)，与包装质粒共转染293T细胞的效率。表达多模态成像基因的慢病毒表达质粒与包装质粒共转染293T细胞具有较高的转染效率，从荧光表达率观察，成功转染率在80～90％，提示具有较好的病毒包装效率。
同时分别以携带单个荧光蛋白的常规慢病毒表达质粒(仅携带mRuby2基因)，以及携带多个成像基因、长度较大的常规慢病毒表达质粒(采用改造前的pLenti-EF1α-FH-CMV-CopGFP&Puro质粒插入本发明实施例1的融合的多模态成像基因直接)作为对照，比较病毒包装效率。图5为单报告基因插入到常规慢病毒表达质粒后(质粒总长度<10000bp)与包装质粒共转染293T细胞的效率，由图5可知，常规慢病毒包装时，共转染293T细胞效率约在80～90％，与本发明改造后的插入多模态成像基因的质粒包装病毒效率相当。图6为融合的多模态成像基因插入到一般慢病毒表达质粒后(质粒总长度>11000bp)与包装质粒共转染293T细胞的效率。
如图4可知，本发明实施例的携带融合基因的改造质粒共转染效率达80～90％，与如图5所述的携带单个荧光蛋白的常规质粒的转染效率相当，提示本发明提供的插入多个报告基因的慢病毒质粒与常规慢病毒质粒均具有较高的慢病毒包装效率，而如图6可知，插入多个报告基因、长度较大的常规慢病毒质粒，共转染包装效率很低，约在10-20％，长度较大的慢病毒表达质粒严重影响病毒包装效率。结果表明，改造常规慢病毒质粒骨架，为长度较大的融合基因探针提供空间、减少质粒总长度，对于维持慢病毒包装效率十分必要。本发明中对质粒骨架的删除改造提高了外源基因插入的长度，同时保持了质粒活性。
慢病毒颗粒收集后，通过常规慢病毒感染细胞的方法对293T细胞进行转基因标记，实验结果如图7所示。由图7可知，293T细胞被病毒成功感染并表达mRuby2荧光蛋白，同时Gcamp6f在无钙离子的常规环境下基本处于无荧光状态。证明慢病毒具有良好的活性，通过S-L-D-S与G-S-S-G肽链连接融合的基因维持了各个蛋白的正常活性，提示本发明制备的携带多模态成像基因的慢病毒颗粒具有良好的活性。
实施例2：融合的多模态成像基因在人多能干细胞中的应用
(1)人胚胎干细胞(hESC)的多模态成像基因标记
通过常规的慢病毒感染细胞方法(参考PLoS One.2013；8(6):e66369.)，使用上述携带融合基因探针的慢病毒颗粒转染h1ESC(中山大学曹楠教授馈赠，或从美国ATCC购买获得)，并通过专利方法(ZL201911133148.1)分离阳性克隆进行扩增。实验结果如图8所示，由图8可知，本发明制备的携带融合的多模态成像基因的慢病毒颗粒，成功转染hESC，可以观察到mRuby2的表达，成功获得融合成像基因标记的hESC细胞株。提示本发明制备的携带多模态成像基因的慢病毒颗粒具有良好的活性。
(2)人诱导型多能干细胞(hiPSC)的多模态成像基因标记
通过常规的慢病毒感染细胞方法(参考PLoS One.2013；8(6):e66369.)，使用上述携带融合基因探针的慢病毒颗粒转染hiPSC0100(来源自中科院上海干细胞库)，并通过专利方法(ZL201911133148.1)分离阳性克隆进行扩增。实验结果如图9所示，由图9可知，本发明制备的携带融合的多模态成像基因的慢病毒颗粒，成功转染hiPSC，可以观察到mRuby2的表达，成功获得融合成像基因标记的hiPSC细胞株。提示本发明制备的携带多模态成像基因的慢病毒颗粒具有良好的活性。
(3)人多能干细胞的多模态成像检测
利用融合成像基因标记的hiPSC，分别进行数量成像、形态成像以及钙活动功能成像。数量成像基本方法为，收集生长状态良好的标记hiPSC，分散成单细胞悬液，分别稀释到每100uL培养液含0，10，20，30，40个iPSC，将上述梯度细胞悬液100uL加入到96孔培养板，按照试剂盒(购自Promega，货号N1110)说明加入Nanoluc底物溶液，利用活体成像仪(Invitrogen活体成像仪)检测荧光信号。实验结果如图10所示：其中左图为生物发光成像图片，右图为荧光信号值与细胞数量的关系。表明基于Nanoluc的生物发光成像可以进行细胞数量定量，且灵敏度可以达到10个细胞以内；形态成像(mRuby2)与钙活动功能成像(Gcamp6f)结果如图11所示：利用mRuby2进行荧光显微镜成像，可以观察到细胞典型形态，能够在细胞移植后对标记的细胞进行形态检测；同时可以观察到Gcamp6f在常规条件下处于无或低荧光状态，通过加入10uM离子霉素(购自Sigma公司)刺激钙活动，显著激活Gcamp6f荧光，表明融合成像基因能够进行细胞钙活动成像。
实施例3：融合的多模态成像基因在人多能干细胞分化来源细胞中的应用
(1)hiPSC来源神经细胞的形态成像检测
参考现有方法方法(英文书籍Methods in Molecular Biology,Neural StemCells pp1-7)，将hiPSC分化成神经干细胞(NSC)，进一步将NSC球贴壁生长，利用神经元培养液长期培养，促进向神经细胞分化。人iPSC分化形成的神经网络形态成像观察实验结果如图12所示。由图12可知，NSC分化培养4个月，形成明显的神经网络形态，通过荧光显微镜(购自Nikon公司，Ti2-U型号)能够观察到mRuby2的稳定表达，呈现较好的神经网络形态。提示多模态成像基因在细胞增殖、神经分化后仍能维持稳定表达，可以用于其分化来源的神经细胞的稳定成像追踪。
(2)hiPSC来源神经细胞的钙活动功能成像检测
利用上述hiPSC分化形成的神经网络，分别通过在常规环境下以及离子霉素、ATP刺激下观察Gcamp6f蛋白的反应。人iPSC分化形成的神经网络钙活动功能成像的实验结果如图13所示。如图13可知，离子霉素和ATP(购自Sigma公司)刺激下均能观察到荧光信号的激活，表明融合基因探针标在hiPSC分化维持良好活性，能够用于分化细胞的钙活动成像。
(3)hiPSC来源类脑器官中细胞活力的实时定量成像检测
根据文献报道的方法(J.Vis.Exp.2017；127：e56404)，将融合基因探针标记的iPSC培育形成脑类器官，作为寨卡(ZIKA)的感染模型。病毒的感染可能导致其中的神经细胞、神经干细胞死亡，但常规的形态观察无法分辨，以往研究通过有创的取材检测。利用Nanoluc蛋白，在ZIKA感染后的不同时间点，无创、连续检测细胞活力，人iPSC培育形成的类脑器官在ZIKA感染过程中细胞数量成像的实验结果如图14所示。如图14可知，ZIKA感染三天即导致脑类器官中细胞明显死亡，随后感染过程中细胞活力持续下降，实现了在同一标本中细胞活力的持续、可视化、定量成像。
(4)hiPSC来源心肌细胞钙活动实时成像检测
1)融合基因标记的hiPSC细胞，培养至80％汇合；
2)更换RPMI1640培养基(购自Gibco公司)，添加无胰岛素的B27(1X，购自Gibco公司)与6uM CHIR99021(购自默克公司)，培养48小时；
3)更换新鲜的RPMI1640培养基，添加无胰岛素的B27(1X)，培养24小时；
4)更换RPMI1640培养基，添加无胰岛素的B27(1X)与6uM IWR-1(购自默克公司)，培养48小时；
5)更换RPMI1640培养基，添加无胰岛素的B27(1X)，培养48小时；
6)更换RPMI1640培养基，添加含胰岛素的B27(1X)，每3天换液。培养过程中观察搏动细胞的出现。
7)利用活细胞工作站(购自Nikon公司)，观察mRuby2的表达情况；同时，实时记录Gcamp6f的荧光变化情况。人iPSC分化心肌细胞形态成像与钙活动功能成像的实验结果如图15所示，利用标记的iPSC分化形成心肌细胞，可以观察到mRuby2的稳定表达，同时利用Gcamp6f成像，可以观察到心肌细胞静息状态下无荧光，搏动时可以灵敏的激活荧光。进一步，在心肌搏动过程中，可以检测到心肌细胞节律搏动时荧光信号的节律变化。多模态成像基因标记的人iPSC分化的神经细胞在波动过程中的钙活动持续成像实验结果如图16所示。如图16可知，利用标记的iPSC分化形成心肌细胞，在搏动过程中伴随钙活动的节律变化，利用Gcamp6f与活细胞工作站进行实时成像，可以观察伴随心肌细胞节律波动时荧光信号的节律变化，表明本发明中的多模态成像基因可以用于细胞钙活动的高灵敏、实时成像检测。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究
<120> 融合成像基因及其慢病毒表达质粒、慢病毒、细胞，其制备方法和用途
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2615
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatccatgg tcttcacact cgaagatttc gttggggact ggcgacagac agccggctac 60
aacctggacc aagtccttga acagggaggt gtgtccagtt tgtttcagaa tctcggggtg 120
tccgtaactc cgatccaaag gattgtcctg agcggtgaaa atgggctgaa gatcgacatc 180
catgtcatca tcccgtatga aggtctgagc ggcgaccaaa tgggccagat cgaaaaaatt 240
tttaaggtgg tgtaccctgt ggatgatcat cactttaagg tgatcctgca ctatggcaca 300
ctggtaatcg acggggttac gccgaacatg atcgactatt tcggacggcc gtatgaaggc 360
atcgccgtgt tcgacggcaa aaagatcact gtaacaggga ccctgtggaa cggcaacaaa 420
attatcgacg agcgcctgat caaccccgac ggctccctgc tgttccgagt aaccatcaac 480
ggagtgaccg gctggcggct gtgcgaacgc attctggcgt cgctcgactc gatggtgtct 540
aagggcgaag agctgatcaa ggaaaatatg cgtatgaagg tggtcatgga aggttcggtc 600
aacggccacc aattcaaatg cacaggtgaa ggagaaggca atccgtacat gggaactcaa 660
accatgagga tcaaagtcat cgagggagga cccctgccat ttgcctttga cattcttgcc 720
acgtcgttca tgtatggcag ccgtactttt atcaagtacc cgaaaggcat tcctgatttc 780
tttaaacagt cctttcctga gggttttact tgggaaagag ttacgagata cgaagatggt 840
ggagtcgtca ccgtcatgca ggacaccagc cttgaggatg gctgtctcgt ttaccacgtc 900
caagtcagag gggtaaactt tccctccaat ggtcccgtga tgcagaagaa gaccaagggt 960
tgggagccta atacagagat gatgtatcca gcagatggtg gtctgagggg atacactcat 1020
atggcactga aagttgatgg tggtggccat ctgtcttgct ctttcgtaac aacttacagg 1080
tcaaaaaaga ccgtcgggaa catcaagatg cccggtatcc atgccgttga tcaccgcctg 1140
gaaaggttag aggaaagtga caatgaaatg ttcgtagtac aacgcgaaca cgcagttgcc 1200
aagttcgccg ggcttggtgg tgggatggac gagctgtaca agggatctag tggaatgggt 1260
tctcatcatc atcatcatca tggtatggct agcatgactg gtggacagca aatgggtcgg 1320
gatctgtacg acgatgacga taaggatctc gccaccatgg tcgactcatc ccgtcgtaag 1380
tggaataaga caggtcacgc agtcagagct ataggtcggc tgagctcact cgagaacgtc 1440
tatatcaagg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggcga acttcaagat ccgccacaac 1500
atcgaggacg gcggcgtgca gctcgcctac cactaccagc agaacacccc catcggcgac 1560
ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcgtgc agtccaaact ttcgaaagac 1620
cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact 1680
ctcggcatgg acgagctgta caagggcggt accggaggga gcatggtgag caagggcgag 1740
gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac 1800
aagttcagcg tgtccggcga gggtgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag 1860
ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc 1920
tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 1980
tccgccatgc ccgaaggcta catccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac 2040
tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 2100
aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaacctg 2160
ccggaccaac tgactgaaga gcagatcgca gaatttaaag aggaattctc cctatttgac 2220
aaggacgggg atgggacaat aacaaccaag gagctgggga cggtgatgcg gtctctgggg 2280
cagaacccca cagaagcaga gctgcaggac atgatcaatg aagtagatgc cgacggtgac 2340
ggcacaatcg acttccctga gttcctgaca atgatggcaa gaaaaatgaa atacagggac 2400
acggaagaag aaattagaga agcgttcggt gtgtttgata aggatggcaa tggctacatc 2460
agtgcagcag agcttcgcca cgtgatgaca aaccttggag agaagttaac agatgaagag 2520
gttgatgaaa tgatcaggga agcagacatc gatggggatg gtcaggtaaa ctacgaagag 2580
tttgtacaaa tgatgacagc gaagtgagtt taaac 2615
<210> 2
<211> 9300
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca 60
ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg 120
gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg 180
ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc 240
ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg 300
atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca 360
agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt 420
ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg 480
gaggtctata taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct ctctggttag accagatctg 540
agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc 600
ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct 660
cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc gcccgaacag ggacttgaaa 720
gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc ggcttgctga agcgcgcacg 780
gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa ttttgactag cggaggctag 840
aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgcgatgg 900
gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca tatagtatgg 960
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tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga gataaaagac 1140
accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac caccgcacag 1200
caagcggccg gccgctgatc ttcagacctg gaggaggaga tatgagggac aattggagaa 1260
gtgaattata taaatataaa gtagtaaaaa ttgaaccatt aggagtagca cccaccaagg 1320
caaagagaag agtggtgcag agagaaaaaa gagcagtggg aataggagct ttgttccttg 1380
ggttcttggg agcagcagga agcactatgg gcgcagcgtc aatgacgctg acggtacagg 1440
ccagacaatt attgtctggt atagtgcagc agcagaacaa tttgctgagg gctattgagg 1500
cgcaacagca tctgttgcaa ctcacagtct ggggcatcaa gcagctccag gcaagaatcc 1560
tggctgtgga aagataccta aaggatcaac agctcctggg gatttggggt tgctctggaa 1620
aactcatttg caccactgct gtgccttgga atgctagttg gagtaataaa tctctggaac 1680
agatttggaa tcacacgacc tggatggagt gggacagaga aattaacaat tacacaagct 1740
taatacactc cttaattgaa gaatcgcaaa accagcaaga aaagaatgaa caagaattat 1800
tggaattaga taaatgggca agtttgtgga attggtttaa cataacaaat tggctgtggt 1860
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tactttctat agtgaataga gttaggcagg gatattcacc attatcgttt cagacccacc 1980
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<210> 3
<211> 9361
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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acccccactg gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc 6540
cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg 6600
gctcggctgt tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct 6660
tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct 6720
tcggccctca atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt 6780
ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgcat 6840
cgataccgtc gacctcgatc gagacctaga aaaacatgga gcaatcacaa gtagcaatac 6900
agcagctacc aatgctgatt gtgcctggct agaagcacaa gaggaggagg aggtgggttt 6960
tccagtcaca cctcaggtac ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg tagatcttag 7020
ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggctaatt cactcccaac gaagacaaga 7080
tatccttgat ctgtggatct accacacaca aggctacttc cctgattggc agaactacac 7140
accagggcca gggatcagat atccactgac ctttggatgg tgctacaagc tagtaccagt 7200
tgagcaagag aaggtagaag aagccaatga aggagagaac acccgcttgt tacaccctgt 7260
gagcctgcat gggatggatg acccggagag agaagtatta gagtggaggt ttgacagccg 7320
cctagcattt catcacatgg cccgagagct gcatccggac tgtactgggt ctctctggtt 7380
agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca 7440
ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa 7500
ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagca tgtgagcaaa 7560
aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 7620
ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 7680
aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 7740
gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 7800
tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 7860
tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 7920
gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 7980
cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 8040
cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 8100
agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 8160
caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 8220
ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 8280
aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 8340
tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc 8400
agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac 8460
gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc 8520
accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg 8580
tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag 8640
tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc 8700
acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac 8760
atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag 8820
aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac 8880
tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg 8940
agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc 9000
gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact 9060
ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg 9120
atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa 9180
tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt 9240
tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg 9300
tatttagaaa aataaacaaa taggggtccc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga 9360
c 9361
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
actagtggaa tgggttctca tcatcatcat catcatggt 39
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtttaaactc acttcgctgt catcatttgt a 31
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggatccatgg tcttcacact cgaagatttc gt 32
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tctagatccc ttgtacagct cgtccatccc accac 35

Claims (10)

1.一种融合成像基因，其特征在于，所述融合成像基因包括生物发光成像基因、荧光蛋白基因和钙成像基因，三种所述基因之间通过连接基团连接；
优选的，所述生物发光成像基因选自Nanoluc基因；
更优选的，所述荧光蛋白基因基因选自mRuby2基因；
进一步优选的，所述钙成像基因选自Gcamp6f基因。
2.根据权利要求1所述的融合成像基因，其特征在于，所述连接基团选自多肽链，所述多肽链优选含有2～8个氨基酸，更优选的，所述多肽链中的氨基酸选自S、L、D和G中的两种、三种或四种；
进一步优选的，所述多肽链选自S-L-D-S或G-S-S-G。
3.根据权利要求2所述的融合成像基因，其特征在于，所述Nanoluc基因和所述mRuby2基因通过S-L-D-S连接；
所述mRuby2基因和所述Gcamp6f基因通过G-S-S-G连接；
进一步优选的，所述融合成像基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求3所述的融合成像基因的构建方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
S11、获得Nanoluc基因序列，去掉尾部终止密码子，在Nanoluc基因末尾添加一个S氨基酸基因序列及Xhol酶切位点序列；优选通过基因合成；
S12、获得mRuby2基因序列，去掉尾部终止密码子，在mRuby2前端先后加上SalI酶切位点序列与一个S氨基酸；mRuby2后端加一个G氨基酸序列及XbaI酶切位点序列；优选通过基因合成；
S13、获得Gcamp6f基因序列，在Gcamp6f基因前端加上一个G氨基酸与SpeI酶切位点，基因尾端加入PmeI酶切位点；优选的，通过PCR方法进行扩增获得Gcamp6f基因序列，更优选的，引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；
S14、利用Nanoluc尾端的Xhol酶切位点与mRuby2前端SalI酶切位点，分别使用Xhol酶与SalI酶切割Nanoluc基因与Xhol酶切位点，纯化后分别获得Nanoluc基因、mRuby2基因的酶切产物；
S15、将所述Nanoluc基因的酶切产物与所述mRuby2基因的酶切产物连接，经扩增、纯化、连接到T载体、转化感受态细胞、培养、测序获得Nanoluc-S-L-D-S-mRuby2质粒；
S16、PCR扩增Gcamp6f基因，使用XbaI酶处理Nanoluc-S-L-D-S-mRuby2质粒，SpeI酶处理Gcamp6f基因，纯化酶切产物；
S17、将Nanoluc-S-L-D-S-mRuby2基因和Gcamp6f基因连接，经扩增、纯化、连接到T载体、转化感受态细胞、培养、测序获得含有所述融合成像基因的菌种。
5.一种携带有如权利要求1～3任一项所述的融合成像基因的慢病毒表达质粒；
优选的，所述的携带融合成像基因的慢病毒表达质粒序列如SEQ ID NO.2所示。
6.一种慢病毒表达质粒的制备方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
S21、对慢病毒表达质粒进行改造：
所述改造优选包括：
S211、经SphI与BamHI限制性内切酶双酶切，去除pLenti-EF1α-FH-CMV-CopGFP&Puro质粒中的EF-1α启动子，得到骨架质粒；所述pLenti-EF1α-FH-CMV-CopGFP&Puro质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
S212、经过酶连接将人泛素启动子hUbc插入到所述骨架质粒中，获得pLenti-Ubc-FH-CMV-CopGFP&Puro中间质粒；
S213、经PmeI与BamHI双酶切去除pLenti-Ubc-FH-CMV-CopGFP&Puro质粒中Ubc下游至Puro基因位点的序列，即SEQ ID NO.3所示核苷酸序列中3826～6112位核苷酸序列；
S22、将如权利要求1～3任一项所述的融合成像基因插入到改造后的慢病毒表达质粒中，获得携带融合基因探针的慢病毒表达质粒；
优选包括：利用所述融合成像基因两端同样的酶切位点，将所述融合成像基因插入到所述改造后的中间质粒中，获得pLenti-Ubc-Nanoluc-mRuby2-Gcamp6f质粒，并经转化、测序等获得所述慢病毒表达质粒，所述慢病毒表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.一种携带有如权利要求1～3任一项所述的融合成像基因的慢病毒。
8.如权利要求7所述的慢病毒的制备方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
将pLenti-Ubc-Nanoluc-mRuby2-Gcamp6f质粒与慢病毒包装质粒PAX2、pMD2G共转染293T细胞，获得携带融合成像基因的慢病毒颗粒；
优选的，pLenti-Ubc-Nanoluc-mRuby2-Gcamp6f质粒、质粒PAX2、质粒pMD2G3的质量比为3～4：1.5～2.5：0.5～1.5，优选3：2：1。
9.一种由权利要求1～3任一项所述的融合成像基因标记的细胞或由权利要求7所述的慢病毒感染的细胞，优选的，所述细胞选自人胚胎干细胞和人多能干细胞。
10.如权利要求9所述的细胞的应用，所述应用包括：
在细胞成像检测中的应用；
在细胞命运追踪方面的应用；或
在制备用于细胞命运追踪或细胞成像检测的制剂或试剂盒中的应用；
优选的，所述细胞成像检测为同时实现细胞数量成像、形态成像和钙活动功能的检测。
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