CN113584044A - 一种牙鲆socs3基因及其真核表达载体、表达系统和异源表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牙鲆SOCS3基因及其真核表达载体、表达系统和异源表达方法。所述牙鲆SOCS3基因的核酸序列如SEQIDNO.1所示。扩增所述牙鲆SOCS3基因的上游引物如SEQIDNO.2所示，下游引物如SEQIDNO.3所示。本申请在成功克隆牙鲆SOCS3基因的基础上，进一步构建了牙鲆SOCS3基因的真核表达载体pEGFP‑C1‑PoSOCS3，并将其成功转染HEK293T细胞中，荧光倒置显微镜观察牙鲆SOCS3基因在细胞中的亚细胞定位，为后续的牙鲆SOCS3功能研究提供了基础资料。

Description

一种牙鲆SOCS3基因及其真核表达载体、表达系统和异源表达 方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种牙鲆SOCS3基因及其真核表达载体、表达系统和异源表达方法。

背景技术

牙鲆(Paralichthysolivaceus)，也称为褐牙鲆，俗称牙片、偏口，属于硬骨鱼纲、鲽形目、牙鲆科，是在近海水底层生活的冷温性鱼类，具有潜沙习性，为广盐性鱼类。同时牙鲆的经济价值与营养价值都很高，其具有肉质鲜嫩、营养丰富、杂刺少、生长快等优点，在亚洲的一些国家被广泛养殖，例如中国、日本、朝鲜半岛。我国的牙鲆养殖多分布在沿海之地，其中属黄海与渤海的养殖牙鲆的数量较多。随着牙鲆养殖业的迅速发展，人工集约化养殖成为牙鲆的主要养殖模式。然而人工的养殖池通常有着较高的养殖密度和水流动性较差的养殖环境，这与牙鲆天然生长的环境差别较大，因此时常会遭受一些细菌、病毒和寄生虫等病害影响，给养殖带来很大的困扰与经济损失。

细胞因子(Cytokines,CK)是由多种活化的免疫细胞以及其他细胞产生的多肽分子，能够广泛的调节细胞。因此细胞因子在机体的免疫调节和维持生物稳定方面发挥着重要的作用。过量的细胞因子或其信号转导紊乱可引起多种疾病，例如过敏性疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病、生殖性疾病和癌症。但这种情况并不会经常发生，因为机体为了防止过度的免疫给其造成伤害，会严格控制细胞因子的作用强度、空间与时间。

细胞因子信号转导抑制蛋白(Suppressor of cytokine signaling,SOCS)是一类重要的细胞因子信号通路抑制剂。多种细胞因子可以诱导SOCS的生成，生成的SOCS并对细胞因子信号通路产生负调控作用，对细胞因子的激活、连续周期和信号强度有着反向调控的功能，在维持稳态和正常细胞功能中发挥重要作用。SOCS家族的成员作为免疫系统关键的调节因子，目前在哺乳动物中研究的较多。在高等哺乳动物中研究发现了8个SOCS家族蛋白成员，包括SOCS1-7和CISH。尤其是在人类的医学方面，SOCS家族成员为人类的许多疾病的治疗提供了方向。SOCS家族虽然在鱼类中研究较少，但是从中也有发现。研究者们从黑青斑河鲀(Tetraodon nigroviridis)、斑马鱼(Danio rerio)、红鳍东方鲀(Fugu rubripes)、青鳉(Oryziaslatipes)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、鲤(Cyprinus carpio)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、草鱼(Ctenopharyngodonidella)等均有发现SOCS家族，还特别发现了几种鱼类中特有的SOCS家族成员，包括SOCS1b、SOCS3b、SOCS5b、SOSCS8与SOCS9。

SOCS3(suppressor ofcytokine signaling 3)全称为细胞因子信号转导抑制蛋白3，它是由SOCS3基因编码的一种蛋白质。SOCS3是近年来新发现的SOCS家族的重要成员之一，可以调节多种免疫细胞因子的应答，如干扰素(IFN)、白细胞介素2(IL-2)和白细胞介素6(IL-6)等。通过抑制Janus激酶(JAK)-信号转导子和转录激活子(STAT)信号以负反馈调节方式来抑制多种细胞因子的信号传导。1997年由三个不同的研究机构首次克隆。随着SOCS3的研究，其免疫机制和临床功能已取得了很大进展。虽然SOCS3在几种哺乳动物中具有良好的特性，但有关于牙鲆SOCS3研究的相关内容比较匮乏。所以，研究牙鲆SOCS3具有重大意义，以期为牙鲆的免疫防御机制研究提供基础资料。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提供了一种牙鲆SOCS3基因及其真核表达载体、表达系统和异源表达方法。

第一方面，本申请提供了一种牙鲆SOCS3基因，是采用以下技术方案实现的。

一种牙鲆SOCS3基因，所述牙鲆SOCS3基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，扩增所述牙鲆SOCS3基因的上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示。

第二方面，本申请提供了一种牙鲆SOCS3基因真核表达载体，是采用以下技术方案实现的。

一种牙鲆SOCS3基因真核表达载体，所述牙鲆SOCS3基因真核表达载体由pEGFP-C1质粒和上述牙鲆SOCS3基因构建而成。

第三方面，本申请提供了一种牙鲆SOCS3基因的真核表达系统，是采用以下技术方案实现的。

一种上述牙鲆SOCS3基因的真核表达系统，所述真核表达系统为哺乳动物表达系统。

进一步的，所述真核表达系统为HEK293T哺乳动物细胞表达系统。

第四方面，本申请提供了一种牙鲆SOCS3基因的异源表达方法，是采用以下技术方案实现的。

一种上述牙鲆SOCS3基因的异源表达方法，包括以下步骤：

S1.以牙鲆SOCS3cDNA为模板，采用上、下游引物对其进行扩增得到目的DNA；上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.3所示；

S2.将扩增得到的目的DNA与酶切后的pEGFP-C1质粒连接，转化感受态细胞，得到重组质粒；

S3.将构建成功的重组质粒转染HEK293T细胞，进行细胞培养。

本申请具有以下有益效果。

本申请采用的pEGFP-C1载体，具有容易转染真核细胞，且对目的蛋白的生物活性和宿主细胞的生长无影响等特点，其中的绿色荧光蛋白报告基因EGFP表达稳定，有利于示踪和检测所克隆的目的基因。本申请采用的HEK293T哺乳动物细胞表达系统能够诱导基因高效率表达，而且可以严格控制基因的表达，对表达的时间和水平进行调控。本申请在成功克隆牙鲆SOCS3基因的基础上，进一步构建了牙鲆SOCS3基因的真核表达载体pEGFP-C1-PoSOCS3，并将其成功转染HEK293T细胞中，荧光倒置显微镜观察牙鲆SOCS3基因在细胞中的亚细胞定位，为后续的牙鲆SOCS3功能研究提供了基础资料。

附图说明

图1是本申请PCR扩增目的基因片段的琼脂糖凝胶电泳图(M：2000 DNA Maker；1：PoSOCS1 cDNA扩增产物)；

图2是本申请质粒酶切后的琼脂糖凝胶电泳图(M：2000 DNA Maker；1：空白质粒；2：酶切质粒)；

图3是本申请连接转化后菌液PCR的琼脂糖凝胶电泳图(M：2000 DNA Maker；1-5：5个单菌落PCR产物)；

图4是本申请转染PEGFP-C1空载体48h后倒置荧光显微镜下观察293T细胞中的荧光表达情况图；

图5是本申请转染PEGFP-C1-PoSOCS3真核载体48h后倒置荧光显微镜下观察293T细胞中的荧光表达情况图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对发明进行进一步的说明。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1载体、细胞、菌株

真核表达载体pEGFP-C1购自武汉淼灵生物科技有限公司、HEK293T细胞购自科佰生物、DH5α感受态细胞购自擎科生物。

1.1.2主要实验试剂

2000 DNA Maker、限制性内切酶EcoRⅠ、FD.Buffer、双蒸水、DNA Loading Buffer、DNA凝胶回收试剂盒(离心柱形)、高纯度质粒DNA小量试剂盒。

1.1.3主要实验仪器

微量可调移液枪(10μl、200μl、1000μl)、4摄氏度冰箱、PCR仪、水平电泳槽、离心管(0.2ml、1.5ml、2ml)、高速离心机、微量离心机、恒温水浴锅、自动凝胶成像分析仪、超净工作台、恒温37摄氏度培养箱、恒温摇床、倒置光学显微镜、荧光显微镜、微波炉、通风橱、电子天平、超微量分光光度计、酒精灯、三角瓶等。

1.1.4主要实验溶液配制方法

(1)1％琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖粉与100ml1×TAE缓冲液在锥形瓶中混合，然后给锥形瓶塞好塞子以免水分蒸发导致胶浓度有所变化，将锥形瓶放入微波炉中反复加热2-3次，每次加热时长不超过2分钟，避免溶液沸腾造成水分流失。加热至琼脂糖粉溶解且溶液中无气泡存在，然后放入通风橱中待其冷却。将梳子在干净的胶槽摆好，等到锥形瓶内的溶液不烫手时可往里边滴加1μl的核酸染料，混匀，然后及时将其倒入胶板内，静置大约20分钟后胶凝固，轻轻拔掉梳子，最后将凝胶切成合适大小放入缓冲液中保存以备使用。

(2)LB液体培养基：准确称量酵母浸粉1.0g，胰蛋白胨2.0g，氯化钠2.0g放入容量瓶中，然后加入无菌ddH₂O定容至200ml，轻轻摇晃加速固体溶解，然后加入NaOH调节pH值至7.4-7.6(约加入150μl10mM NaOH)[14],分装溶液后放入高温灭菌锅中灭菌30分钟，最后待其温度降低后放入4摄氏度冰箱进行保存。

(3)LB固体培养基：取一个250ml的三角瓶，放入100mlLB液体培养基，1.0g琼脂粉，加上棉塞，放入灭菌锅中灭菌后，放入超净工作台摇匀静置，在酒精灯下，将其倒入平板，待平板冷却凝固后，将平板倒置，再用封口膜封口，放入4℃冰箱保存。

1.2方法

1.2.1牙鲆SOCS3基因真核表达片段的克隆

1.2.1.1牙鲆SOCS3基因真核表达片段的PCR扩增

(1)根据同源臂连接的方法首先根据已知的牙鲆SOCS3基因序列(XP_019949709)设计引物F:AGATCTCGAGCTCAAGCTTCGGCCACCATGGTAACTTACAGCAAGTTT(SEQ ID NO.2)和R:GGTACCGTCGACTGCAGAATTGATCGGAGCATCATACTCCTGGAG(SEQ ID NO.3)

(2)以牙鲆SOCS3 cDNA(牙鲆肾脏组织提取RNA反转录成的cDNA)为模板进行PCR扩增。反应体系共25微升，为cDNA1微升、引物F1微升、引物R1微升、Mix 22微升。扩增体系为97℃预变性4分钟，97℃变性20秒，62.5℃退火20秒，72℃延伸30秒，进行35个循环，最后72℃充分延伸7分钟，4℃保存。

(3)将扩增的产物进行琼脂糖凝胶检测。将5微升的DNA Maker与5微升的扩增产物用移液枪分别点入点样孔中进行电泳，电压220V，时间为20分钟。放入凝胶成像仪中观察条带并拍照。

1.2.1.2扩增产物纯化回收

为了确保含有目的基因的片段和载体的准确连接，要在连接转化之前对扩增的产物进行纯化回收。参照DNA凝胶回收试剂盒(GE0101-200)操作说明书，对牙鲆SOCS3基因PCR扩增片段进行纯化回收。因为此过程要用到恒温水浴锅，因此要在实验前打开水浴锅进行调温以节省时间。

(1)将250微升Buffer BL加入吸附柱EC中，然后放入高速离心机中12000g离心1分钟以充分活化吸附柱中的硅胶；

(2)在365纳米长波紫外线灯下，用干净的切胶器将要回收的DNA条带切下，要尽量切准确，切除不含目的基因的条带，要使得凝胶的体积尽可能的小；

(3)将切下来的含有目的基因的凝胶放进2ml的离心管中；

(4)向离心管中加入500微升的Buffer GL；

(5)将离心管插在水浴浮板中并放入提前调好温度的65℃水浴锅中水浴5分钟，每2分钟轻轻上下颠倒混匀一次，直至离心管中的凝胶熔化，这时溶液呈现淡黄色；

(6)用移液枪将离心管中的溶液转入吸附柱EC中，然后放入离心机中12000g离心1分钟，弃废液，再将吸附柱EC放入一个空的收集管中；

(7)取700微升的Buffer W2(已加入指定体积的无水乙醇)加入吸附柱EC中，再放入离心机中12000g离心1分钟，弃废液，不需要换收集管；

(8)再一次重复步骤(7)的操作内容；

(9)将吸附柱EC放入一个空的收集管中，离心机12000g离心2分钟；

(10)取一个干净的1.5ml的离心管，将吸附柱EC从收集管中取出并放入离心管中，打开盖子，21-25℃静置2分钟挥发掉残留的无水乙醇。用移液枪取55微升的Eluent放入一个干净的0.2ml的离心管中，并在65℃水浴锅中预热2分钟，然后在吸附膜的中间位置加入50微升Eluent，20-25℃静置2分钟，再放入离心机中12000g离心2分钟，用移液枪吸取离心管中的溶液再次加入吸附膜中间位置，离心2分钟。

1.2.2真核表达载体的构建

1.2.2.1pEGFP-C1质粒回收

参照高纯度质粒DNA小量试剂盒操作说明书。

(1)用移液枪吸取250微升Buffer BL于吸附柱中，取一个收集管插在吸附柱下边，放入离心机12000g离心1分钟，充分活化吸附柱中间的硅胶膜；

(2)取4ml过夜培养的质粒菌液平均分装到两个2ml离心管中(方便离心时配平)，然后放入高速离心机中12000g离心1分钟，倒掉废液收集菌体；

(3)从4℃冰箱里取出已加入RNase A的Buffer S1200微升分别平均加入两个装有菌体的离心管中，用移液枪和枪头均匀的轻轻吹打菌体，重悬菌体沉淀，漩涡震荡至菌体均匀悬浮在液体之中；

(4)将其中一个离心管中的溶液倒入另一个离心管中，然后用移液枪轻轻吹打混匀；

(5)再加入200微升Buffer S2，轻柔地上下翻转离心管7次，使菌体充分裂解，裂解时间不宜过长，不可以超过5分钟；

(6)向离心管中加入200微升Buffer S3，轻柔地上下翻转离心管7次，使得溶液充分混匀，此时溶液从淡黄色变有白色絮状沉淀出现，放入离心机12000g离心15分钟；

(7)将上清液小心吸取，转入吸附柱中，放入离心机12000g离心1分钟，弃废液，再将吸附柱AC放回空收集管；

(8)取700微升的已加入指定体积的无水乙醇的Buffer W2加入吸附柱AC中，放入离心机中12000g离心1分钟，弃废液；

(9)将步骤(8)中的操作内容重复一遍；

(10)再将吸附柱AC放回空收集管中，放进离心机12000g离心2分钟；

(11)取出吸附柱AC放入一个提前准备好的干净的1.5ml离心管中，20-25℃静置2分钟；

(12)再另准备一个干净的0.2ml离心管，加55微升的Eluent，然后再放进提前调好温度的恒温水浴锅65℃预热2分钟；

(13)在吸附膜的中间位置加入50微升已经预热好的Eluent，20-25℃静置2分钟，放进离心机12000g离心2分钟；

(14)将得到的溶液再次转入吸附柱中，离心2分钟，得到较多量的DNA。

(15)检测回收质粒的浓度。用2微升Eluent作对照，使用超微量分光光度计检测质粒浓度。

1.2.2.2剪切质粒

(1)配制反应体系：总体系一共50微升，包括pEGFP-C1质粒20微升、FD Buffer 5微升、限制性内切酶EcoRⅠ4微升、ddH₂O 21微升；

(2)将上述溶液混合在0.2ml离心管中，用微型离心机离心3秒；

(3)放入PCR仪中进行剪切质粒，反应体系为37℃，剪切1.5小时；

(4)取4微升被剪切的质粒，4微升没有被剪切的质粒分别与DNA Loading Buffer混合，进行琼脂糖凝胶检测，检测质粒是否被切开；

(5)成功切开的质粒进行电泳回收。

1.2.2.3目的基因片段与pEGFP-C1载体的连接

取剪切好的真核表达载体pEGFP-C11微升，凝胶回收的PCR产物1微升，同源臂连接反应液SoSoo mix 1微升，放于0.2ml离心管中混匀，然后放置在25℃的环境下作用15分钟，以形成重组质粒。

1.2.3重组质粒转入感受态细胞

将重组质粒pEGFP-C1-PoSOCS3转入DH5α感受态细胞，随着感受态细胞的生长增值，重组质粒也会在体外增值。为了避免杂菌的污染，此项操作的步骤应该在无菌环境下进行。在实验前要把所要用的离心管、涂布棒、培养皿等进行高压灭菌^[15]，在超净工作台中打开酒精灯，所有步骤在酒精灯下进行操作。

(1)从﹣80℃超低温冰箱中取出DH5α感受态细胞，此时感受态细胞处于凝固阶段，需要将其放在冰面上使其自行融化。因为感受态细胞比较敏感脆弱所以操作要在冰面上进行。等到感受态细胞融化后用移液枪轻轻吹打混匀，取50微升于1.5ml离心管中；

(2)取1微升重组质粒轻柔地加入离心管中，用移液枪轻轻吹打，将质粒与感受态细胞混匀，在冰面上静置30分钟，使外源DNA能够更好地吸附在感受态细胞的表面；

(3)打开水浴锅设置42℃，待冰浴完成后，将离心管放入水浴锅42℃热激45秒，42℃热激可以使细胞表面微孔扩大，方便DNA进入细胞；

(4)然后立即放在冰上冰浴3分钟。在移动离心管时注意不要震荡，动作要轻柔；

(5)向离心管中加入400微升的LB液体培养基(不含有卡那霉素)混匀，放入37℃恒温培养箱，200rmp复苏1小时；

(6)将离心管放入离心机，3000rmp转速1分钟，吸取部分上清液弃掉，然后用移液枪反复吹打剩余菌液，使菌体悬浮；

(7)转移菌液至已加入卡那霉素和氯霉素的LB固体培养基中间，涂布棒在酒精灯上灼烧灭菌，待其稍微冷却后将菌液均匀涂在培养基上，先正放1分钟等液体被培养基吸收，再倒置平板，放入37℃恒温培养箱培养过夜；

(8)第二天观察平板中菌的生长情况。

1.2.4阳性克隆的筛选与鉴定

(1)取10个0.2ml的离心管，分为两组，每组5个，标号序号且一一对应起来，在第一组中的5个离心管中分别加入10微升ddH₂O；

(2)观察平板上菌的生长情况，用移液枪最小量程的枪头挑选平板上的5个单菌落。蘸取单菌落分别加入到第一组的10微升ddH₂O中，枪头插到ddH₂O底部然后不断吹打混匀；

(3)再吸取2微升到第二组对应的空管中，注意一组与二组的标号要一一对应；

(4)将第二组5个离心管中的菌液进行PCR扩增，扩增体系为97℃预变性4分钟，97℃变性20秒，62.5℃退火20秒，72℃延伸30秒，进行35个循环，最后72℃充分延伸7分钟；

(5)将扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳，与DNA Marker条带进行比较，选择重组质粒成功转入感受态细胞的菌液拿去生物公司测序，鉴定有无目的片段，如果有，则将对应的菌液通过恒温摇床培养进行增值，然后提纯重组质粒(方法同1.2.2.1)，以备后续实验使用。

1.2.5细胞培养与转染

1.2.5.1 HEK293T细胞复苏与传代

因为细胞培养对外界的环境要求较为严格，为了避免污染，给细胞提供良好的生长条件，将细胞培养所要用的器具(细胞培养瓶、移液枪、酒精灯、枪头、10ml螺纹口离心管等)在实验前需要进行灭菌，并提前半小时放入超净工作台，进行紫外灯照射，在每次实验前都要对手和实验台进行75％酒精擦拭消毒。

(1)从液氮罐中取出HEK293T细胞进行复苏，用完全培养基培养293T细胞，放置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中，注意培养基的颜色变化，若培养基从淡粉色变成橙黄色要及时更换培养基。定期观察细胞的生长状况并及时进行细胞传代。

(2)当观察到细胞贴壁生长，细胞的形态发生变化，细胞铺满培养瓶的80％-90％时可进行传代。从5％CO₂细胞培养箱中取出293T细胞，用酒精擦拭培养瓶表面消毒，放置于超净工作台中，用移液枪吸出培养基，加入PBS十字轻柔摇晃洗涤细胞，再吸出PBS，重复两次。

(3)加入胰酶EDTA十字轻柔摇晃对细胞进行消化，当看到贴壁的细胞从培养瓶底部消化掉时，加入完全培养基终止胰酶消化，用移液枪轻轻吹打溶液，使细胞均匀的悬浮在溶液中。

(4)放回，及时观察细胞的生长状况并更换培养液，传代两次后便可进行细胞转染。

1.2.5.2细胞转染

采用Xfect转染试剂将重组质粒pEGFP-C1-PoSOCS3和空质粒pEGFP-C1转入293T细胞。完全培养基中的贴壁细胞达到70-80％时即可进行转染实验。

(1)在装有293T细胞的培养瓶中加入胰酶进行消化，采用十字交叉摇晃法将细胞从瓶壁上消化下来，再加入完全培养基终止消化，用移液枪缓慢吹打均匀后均匀的滴加到12孔板中的8个孔中，放入5％CO₂细胞培养箱中，37℃进行培养。

(2)观察细胞生长状况，细胞长至70-80％时进行转染。

(3)分别设置4个实验组和对照组，取16微升质粒加入到50微升Buffer液中吹打混匀，加入0.9微升Xfectploymer再次吹打混匀，室温孵育10分钟，使纳米颗粒复合物形成。

(4)将纳米颗粒复合物溶液滴加到细胞培养基中，轻轻地来回摇动以混合；

(5)在37℃孵育4小时后换液过夜，转染48小时。

(6)取出12孔板，用PBS清洗细胞3次，再用多聚甲醛对细胞进行30分钟固定。

(7)加入PBS浸洗3次，然后加入DAPI染液，静置5分钟，再次加入PBS对细胞浸洗3次洗去多余DAPI。

(8)在室温下静置5分钟后，放在倒置荧光显微镜下观察并拍照。

2结果与分析

2.1真核表达片段PCR产物的鉴定

用设计好的一对引物对牙鲆SOCS3基因进行PCR扩增，扩增出的产物用琼脂糖凝胶进行电泳检测，将得到的含有目的基因的条带与2000DNA Maker进行对比，从图1中可以看到目的基因大约在618bp处有一条特异性明亮的条带，这个结果与预期相符合，因此表明了设计的引物是合适的，以及PCR反应体系和扩增条件设计的合理。

牙鲆SOCS3基因的DNA序列(SEQ ID NO.1)如下：

ATGGTAACTTACAGCAAGTTTGACTCCGCAATGAGCAGCAGCCTCTTGGACTCCAACATGCGGCTGCCTTACCATTTCAAGACGCTCACCTCTAAGGCGCAGTATCAGATGGTCCTCACCACGATCCACAAGCTCCAGGAGAGCGGCTTCTACTGGGGCACCATCACTGGGAAGGAGGCCAATGCCATGCTGGTGGCTGAGGCCACCGGCACCTTCCTCATCCGGGACAGCTCTGACAACAGGCACCTGTTCACGCTCGTCGTCAAAACAGCATCGGGCACCAAGAACCTGCGCATCCAATGCGACGCAGCTTCTTTTCACCTGCAAACAGACCCTAAGAACCTTCAGTCTGCTCCCCGCTTTGACTGTGTACTTAAGCTGGTTCATCACTACATGCCTCAGAGCAAGGGGAACACACACAGTGGGAATATGTCCTACATTTACTCTGGAGGAGAGAAGATCCCTCTGGAGCTCATCAGACCTCTGTCCTGCAGCTTGTCCACCTTGCAGCACCTGTGCAGGAAAACGGTCAATGGACATTTGGACATTTCGTCTAAAAGAGACCAACTTCCTCACCCTCTGAAGGAGTTCCTCCAGGAGTATGATGCTCCGATCTAG

2.2质粒剪切结果鉴定

在将目的基因与质粒连接起来之前，需要对质粒进行剪切才能够成功构建重组质粒。用限制性内切酶EcoRⅠ对pEGFP-C1质粒进行剪切，以空白质粒为对照，剪切的结果通过琼脂糖凝胶电泳检测，从图2中看到剪切后的质粒条带跑的较慢，空质粒跑的较快。因此证明质粒被成功剪开，可用于与目的基因的连接。

2.3菌液PCR筛选阳性克隆

将重组质粒转入感受态细胞，使得目的基因在体内大量繁殖。用固态LB培养基对感受态细胞进行培养，置于37℃恒温培养箱中培养一夜。随机挑选五个单菌落进行菌落PCR，然后跑电泳进行筛选。结果如图3，点样孔1、2、3、4、5跑出了特异性条带，并且大小与目的基因大小吻合。将测序正确的菌液摇菌过夜，提取质粒。

2.4质粒提取浓度检测

使用高纯度质粒DNA小量试剂盒对重组的质粒和对照质粒进行回收，并用超微量分光光度计检测质粒浓度，对照质粒浓度：Nucleic Acid＝168.4ng/μl，A260＝3.368，A280＝1.781；重组质粒浓度：Nucleic Acid＝121.6ng/μl，A260＝2.432，A280＝1.314。提取的质粒浓度较高，可用于后续实验操作。

2.5重组质粒在293T细胞中表达结果

将重组质粒与空质粒转染293T细胞，培养48小时后，在倒置荧光显微镜下观察293T细胞中的荧光表达情况，如图4、图5，PEGFP-C1均匀的分布在细胞质和细胞核中，而PEGFP-C1-PoSOCS3则分布在细胞质中。

本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种牙鲆SOCS3基因，其特征在于：所述牙鲆SOCS3基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种牙鲆SOCS3基因，其特征在于：扩增所述牙鲆SOCS3基因的上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示。

3.一种牙鲆SOCS3基因真核表达载体，其特征在于：所述牙鲆SOCS3基因真核表达载体由pEGFP-C1质粒和权利要求1所述牙鲆SOCS3基因构建而成。

4.一种权利要求1所述牙鲆SOCS3基因的真核表达系统，其特征在于：所述真核表达系统为哺乳动物表达系统。

5.根据权利要求4所述的一种牙鲆SOCS3基因的真核表达系统，其特征在于：所述真核表达系统为HEK293T哺乳动物细胞表达系统。

6.一种权利要求1所述牙鲆SOCS3基因的异源表达方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1.以牙鲆SOCS3 cDNA为模板，采用上、下游引物对其进行扩增得到目的DNA；上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.3所示；

S2.将扩增得到的目的DNA与酶切后的pEGFP-C1质粒连接，转化感受态细胞，得到重组质粒；

S3.将构建成功的重组质粒转染HEK293T细胞，进行细胞培养。

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