CN113577305A - 一种含白蛋白和阳离子两亲性化合物的脂质体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种含有白蛋白和阳离子脂质体的组合物，所述白蛋白包裹在所述阳离子脂质体的外部，所述阳离子脂质体含有阳离子两亲性脂质、中性脂质和活性成分，所述活性成分选自可以制备成脂质体的任何药物。所述组合物不影响阳离子脂质体后续的分布，不降低阳离子脂质体的靶向性和疗效，还极大地降低了阳离子脂质体的毒性，安全性大大提高。所述组合物制备工艺简单，便于工艺条件控制和批量放大。

Description

一种含白蛋白和阳离子两亲性化合物的脂质体
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种含白蛋白和阳离子脂质体的组合物。
背景技术
阳离子脂质体是粒子表面荷正电的脂质体，其脂质双层通常由阳离子两亲脂质和中性脂质组成。其中阳离子两亲脂质为一个带正电荷的头基团(亲水基团)连接在一个疏水基团上，头基团一般是带有一个或数个氨基的长链胺类基团，疏水基团则主要有两类：脂肪酰链和胆固醇环。阳离子两亲脂质选自(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTMA)、1,2-二油氧基-3-二甲基氨基丙烷(DODAP)、双十烷基二甲基溴化铵(DDAB)、O-[(N,N-二甲基氨基乙基)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-chol)等。
阳离子脂质体两个主要用途为基因药物的非病毒载体和抗肿瘤药物载体。肿瘤新血管内皮细胞带负电荷，与阳离子两亲性物质有很强的亲和性。利用阳离子脂质体靶向肿瘤新生血管的特点，携带抗细胞毒药物到达新生血管内皮细胞，达到抑瘤作用。但由于阳离子磷脂毒性较大，限制了它的临床应用。目前正在研究的阳离子脂质体有以下几种，分别进行到了临床前或临床研究的不同阶段，均尚未进行临床III期，更无产品上市：伊立替康阳离子脂质体EndoTAG-2，Ⅰ期临床；肿瘤造影剂阳离子脂质体LipoRed，Ⅱ期临床；甲氨蝶呤阳离子脂质体Endo-MTX，临床前；紫杉醇阳离子脂质体EndoTAG-1，Ⅱ期临床结束。对于这些临床试验，研究者尚未公开所用阳离子脂质体是否会导致严重副反应以及如何解决。
Carsten Mundus等人的专利US7794747B2公开了利用DOTAP、1,2-二油酰基卵磷脂(DOPC)、紫杉醇制备阳离子脂质体。本申请发明人重复上述方案，然而在动物试验的过程中，经静脉快速给药时，大量受试动物迅速窒息抽搐死亡，解剖结果显示，动物的肺部出现密集血点，发生了肺部栓塞。但是，专利US7794747B2并未意识到该问题，也没有记载解决这一问题的技术方案。
本申请发明人分析静脉快速输入阳离子脂质体导致肺栓塞的可能原因是：肺部毛细血管内皮细胞富含负电荷，与表面带正电荷的阳离子脂质体有很强的亲和力；阳离子脂质体输入血液后首先迅速富集于肺部并与血管内皮细胞结合，导致肺部血管栓塞。李晨晓等人曾观察了静脉输入多西他赛阳离子脂质体的组织分布(李晨晓.多西他赛阳离子脂质体的研究[D].河北医科大学,2015.)，结果显示静脉输入结束后，大量阳离子脂质体在肺部快速聚集而后下降。本申请发明人在观察静脉注射阳离子脂质体的体内分布情况时也观察到同样现象。这些试验结果有力证实了大量带正电荷的阳离子脂质体与血管内皮细胞结合可能是导致肺栓塞的主要原因。
现有技术公开了多种阳离子脂质体修饰手段，但都聚焦于如何提高靶向性、减轻细胞毒性、增强基因或核酸物质的转染效率等方面，并且对阳离子脂质体的毒性研究基本都停留在培养细胞等体外模型阶段，尚未对阳离子脂质体快速静脉输注到动物体内的血管栓塞风险予以足够的重视。因此，有必要寻找一种技术手段来降低阳离子脂质体静脉给药可能带来的血管栓塞风险。
H.Faneca等人(Association of albumin or protamine to lipoplexesenhancement of transfection and resistance to serum，J Gene Med 2004；6:681-692.)利用DOTAP和1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)制备阳离子脂质体作为DNA载体，并进一步提供了人血清白蛋白与阳离子脂质体的复合物，研究显示该复合物显著增强了DNA转染作用，但阳离子脂质体与人血清白蛋白结合后粒径增长很大，从255nm增长至2000nm。药典规定静脉用乳状液型注射液中90％的乳滴粒径应在1μm以下，该研究获得的载有人血清白蛋白的阳离子脂质体无法用于静脉注射，仅在培养细胞中观察了复合物对阳离子脂质体细胞毒性的影响，结果显示不论是否结合白蛋白不会影响脂质体的细胞毒性。
Martin Bartsch等(Massive and selective delivery of lipid-coatedcationic lipoplexes of oligonucleotides targeted in vivo to hepaticendothelial cells，Pharm.Res.，Vol.19,No.5,May2002：676-680.)利用DOTAP、POPC(1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂)、DSPE-PEG2000制备脂质体，外层包被顺式乌头修饰的白蛋白，粒径154nm，可有效靶向大鼠肝脏内皮细胞。由于白蛋白与脂膜的吸附受PEG的阻碍，所以使用顺式乌头对白蛋白进行了修饰，但是对白蛋白进行化学修饰工艺复杂不易控制，成本较高且修饰后的白蛋白在体内行为未经验证，有安全隐患。此文献在细胞层面研究摄取，没有公开白蛋白修饰脂质体可以降低毒性。
发明内容
针对上述技术缺陷，本发明旨在提供一种组合物，其制剂学性质符合静脉给药的要求，并且可以减少静脉注射阳离子脂质体引起血管栓塞(尤其是肺栓塞)的风险，增强临床用药的安全性。
本发明提供一种含有白蛋白和阳离子脂质体的组合物，所述白蛋白包裹在所述阳离子脂质体的外部。其中，所述阳离子脂质体含有阳离子两亲性脂质、中性脂质和活性成分。所述阳离子两亲性脂质与白蛋白的质量比为小于0.08，优选小于0.075，更优选小于0.07，最优选0.008-0.07。
所述阳离子两亲性脂质选自DOTAP、DODAP、DDAB或DOTMA。在一些实施例中，阳离子两亲性脂质为DOTAP。
其中，所述阳离子两亲性脂质、中性脂质和活性成分的摩尔比为50:(40-49.9):(0.1-10)，优选50:(45-49):(1-5)，更优选50:(47-49):(1-3)。
所述中性脂质包括天然磷脂和合成磷脂，选自DOPC(1,2-二油酰基卵磷脂),EPC(蛋黄卵磷脂)、PC(大豆卵磷脂)、HSPC(氢化大豆卵磷脂)、DPPC(二棕榈酸磷脂酰胆碱)、DOPE(二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺)、GPC(甘油酰磷脂酰胆碱)、DMPC(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)等。
所述活性成分选自可以制备成脂质体的任何药物，例如选自抗肿瘤药物。所述抗肿瘤药物选自门冬酰胺酶、博来霉素、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、左旋门冬酰胺酶、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、六甲蜜胺、羟基脲、异环磷酰胺、依立替康、亚叶酸、环己亚硝脲、氮芥、6-巯嘌呤、巯乙磺酸钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素C、米托蒽醌、泼尼松龙、泼尼松、甲基苄肼、雷洛昔芬、链脲霉素、他莫昔芬、硫鸟嘌呤、托泊替康、长春花碱、长春新碱、长春地辛、氨鲁米特、L-天冬酰胺酶、硫唑嘌呤、5-氮杂胞苷、白消安、己烯雌酚、2'2'-二氟脱氧胞苷酸、多西他赛、erythrohydroxynonyladenine、乙炔雌二醇、5-氟尿嘧啶脱氧核苷、5-氟尿嘧啶脱氧核苷单磷酸酯、氟达拉滨磷酸酯、氟烃甲基睾丸素、氟他胺、己酸孕酮、伊达比星、干扰素、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、苯丙氨酸氮芥、米托坦、紫杉醇、喷司他丁、N-膦酰乙酰基-L-天冬氨酸(PALA)、普卡霉素、司莫司汀、表鬼臼毒噻吩糖苷、丙酸睾丸酮、塞替派、三甲蜜胺、尿核甙和长春瑞滨、奥沙利铂、吉西他滨、卡培他滨、埃坡霉素和其天然或合成的衍生物、替莫唑胺、托西莫单抗等等。在一些实施例中，所述抗肿瘤药物为二萜类化合物，如紫杉烷类药物，紫杉醇、多西他赛等，和喜树碱类化合物，如伊立替康、伊立替康的活性代谢产物SN-38等。
其中，所述白蛋白选自牛血清白蛋白，人血清白蛋白，优选人血清白蛋白。
其中，所述组合物的Zeta电位为-25mV至10mV，优选-25mv至-10mv。
其中，所述组合物的粒径为60-500nm，优选150-270nm。
本发明所述的组合物与结合白蛋白之前的阳离子脂质体相比，粒径增长不超过500nm，优选不超过200nm，更优选不超过100nm。
本发明还提供所述组合物的制备方法，具体如下：(1)将所需装载的活性成分(API)与阳离子两亲性脂质、中性脂质制备成阳离子脂质体，(2)将步骤(1)制得的阳离子脂质体与白蛋白结合，得到含白蛋白和阳离子脂质体的组合物。
其中，步骤(1)所述的阳离子脂质体可以使用本领域公开的任意一种制备脂质体的方法制成，例如使用薄膜分散法、有机溶剂注入法、超声波分散法、逆向蒸发法或冷冻干燥法。
其中所述各种制备方法中用以溶解阳离子两亲性脂质、中性脂质和活性成分的有机溶剂选自甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜。
其中，步骤(2)所述的将阳离子脂质体与白蛋白结合的制备方法为将阳离子脂质体与白蛋白溶液进行混合。其中，上述混合所用方法选自滴注、三通法、静态混合器混合。
三通法记载于美国专利US6843942，本专利申请引用该专利的全部公开内容。该装置包括两条分别传输待混合的液体A、B的管路，一个将两种液体管路按垂直方向以小孔连接起来的元件(下面简称为小孔三通)。该制备方法的原理为溶液A通过小孔被高速注射到与它流动方向垂直的溶液B中，然后流经一段直管，借湍流脉动达到相互混合。在管内加装孔板或圆缺形折流挡板，可加强流体的湍流程度，提高混合效果。
静态混合器是一种管道混合设备，在管内设置静止的分割元件，对流动流体作多次分割和汇合。这种混合器不限于湍流操作，也适用于层流操作的高粘度液体的混合。可以实现连续混合。
本发明还提供一种药物制剂，所述药物制剂含有上述组合物和药学上可接受的载体。
其中，所述药学上可接受的载体包括但不限于冻干保护剂，所述冻干保护剂可以是药学上可接受的任意一种冻干保护剂，选自海藻糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和环糊精中的一种或几种，优选海藻糖、葡萄糖和蔗糖中的一种或几种。
所述药物制剂为注射剂型，包括注射液、注射用粉剂、注射用片剂，优选注射用粉剂或注射液，更优选冻干粉针剂。
所述冻干保护剂的用量可以按照本领域对脂质体冻干保护的要求确定，优选2％-10％，更优选10％。
本发明还提供所述组合物或药物制剂在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途，所述肿瘤选自卵巢癌、乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、黑色素瘤等。
本发明还提供了白蛋白在制备含阳离子脂质体的药物中的用途，所述用途是指降低阳离子脂质体引起血管栓塞的风险，所述白蛋白包裹在所述阳离子脂质体的外部。所述血管栓塞优选肺栓塞。
发明的有益效果：
本发明采用含负电荷的人血清白蛋白与阳离子脂质体结合，中和表面正电荷，避免阳离子脂质体在血管(例如肺部毛细血管)的快速富集导致的栓塞风险。并且，本发明所述组合物能够在体内解离，不影响阳离子脂质体的后续分布，不会降低阳离子脂质体的靶向性和疗效。本发明极大地降低了阳离子脂质体的毒性，安全性大大提高，为未来应用于人体提供了可能。
本发明提供的组合物，包封率高，结合白蛋白后整体粒径变化小，性质稳定，可以满足静脉使用的要求。
本发明使用人血清白蛋白，原料易得且成本较低，人血清白蛋白为内源性物质，不易引发免疫反应。制备工艺简单，且便于工艺条件控制和批量放大。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的具体说明，不应对本发明的范围构成限制。
实施例1-1：乙醇注入法制备紫杉醇阳离子-HSA脂质体
DOTAP/DOPC/API(紫杉醇)以表1-1所示的不同摩尔比例溶于乙醇，DOTAP、DOPC和紫杉醇摩尔浓度之和为1000mM，形成乙醇溶液，注入到10％海藻糖溶液中，乙醇溶液和海藻糖溶液的体积比为1:49，搅拌10min即得阳离子脂质体1。将所得脂质体1过0.2μm聚碳酸酯膜挤出，可得到粒径均匀的阳离子脂质体2。将脂质体2与5％的HSA(人血清白蛋白)等体积混合，即得阳离子-HSA脂质体。
实施例1-2：乙醇注入法制备多西他赛阳离子-HSA脂质体
按照实施例1-1的方法，将紫杉醇替换为多西他赛，即得多西他赛阳离子-HSA脂质体。
实施例1-1和1-2脂质体处方及性质如下：
表1-1
Figure BDA0002474874600000061
研发过程中，本申请发明人还考察了阳离子两亲性脂质与活性成分的摩尔比大于50:1或者小于5:1的效果，发现当阳离子两亲性脂质与活性成分的摩尔比大于50:1，仍可以获得本发明所述的组合物，但是过多的阳离子两亲性脂质的加入会导致载药量低，造成浪费；当阳离子两亲性脂质与活性成分的摩尔比小于5:1，会导致包封率低而不能实现脂质体的制备。
实施例1-3：乙醇注入法制备不同粒径的紫杉醇阳离子-HSA脂质体
按照实施例1-1的方法，固定DOTAP/DOPC/紫杉醇比例为50/47/3，将0.2μm聚碳酸酯膜替换为0.05μm、0.1μm和0.45μm的聚碳酸酯膜，即得不同粒径的紫杉醇阳离子-HSA脂质体。
实施例1-3脂质体处方及性质如下：
表1-2
Figure BDA0002474874600000062
Figure BDA0002474874600000071
实施例2：阳离子两亲性脂质与HSA的比值对阳离子-HSA脂质体的影响
DOTAP/DOPC/紫杉醇以50/47/3摩尔比例溶于乙醇，DOTAP、DOPC和紫杉醇的总摩尔浓度1000mM，形成乙醇溶液，注入10％海藻糖溶液中，乙醇溶液和海藻糖溶液的体积比为1:49，混合搅拌即得紫杉醇阳离子脂质体1。将所得脂质体1过0.2μm聚碳酸酯膜挤出，可得到粒径162.8nm，PDI 0.128，Zeta电位52mV的脂质体2。按照表2所示DOTAP/HSA比例(w/w)混合(HSA溶液的pH为7.5)，得到紫杉醇阳离子-HSA脂质体。
这个实施例说明，当DOTAP/HSA(w/w)≥0.1时，所得紫杉醇阳离子-HSA脂质体的PDI过大，或粒径增大过大。PDI是聚合物分散性指数，用于描述聚合物分子量分布，PDI越大，粒子直径分布越不均匀。由经验得知，PDI在0.2以下为纳米制剂的理想分布范围，超过0.25粒径分布很不均匀。
替换DOPAT为其他阳离子两亲性脂质，例如DODAP、DDAB或DOTMA，当阳离子两亲性脂质/HSA(w/w)为0.008-0.08时，所得阳离子-HSA脂质体的粒径、PDI和电位均符合要求。
表2
Figure BDA0002474874600000072
Figure BDA0002474874600000081
实施例3-1：薄膜分散法制备伊立替康(CPT-11)阳离子-HSA脂质体
将DOTAP/DOPC以1:1摩尔比例溶于5ml氯仿，磷脂总浓度1000mM，旋转蒸发后除去氯仿，在烧瓶表面形成磷脂薄膜。加入10mlCPT-11的水溶液1mg/ml，水化后即得CPT-11阳离子脂质体1。将所得脂质体1过200nm聚碳酸酯膜挤出，可得到粒径均匀的脂质体2。将脂质体与5％的HSA等体积混合，即得CPT-11阳离子-HSA脂质体。
实施例3-2：薄膜分散法制备SN-38阳离子-HSA脂质体
按照实施例3-1的方法，将CPT-11替换为SN-38，即得SN-38阳离子-HSA脂质体。
实施例3-1和3-2脂质体处方及性质如下：
表3
Figure BDA0002474874600000082
实施例4：调节HSA溶液至不同pH，制备阳离子-HSA脂质体
按照表4，将HSA溶液以表4所示调节至不同pH，然后与实施例2中得到的粒径162.8，PDI 0.128，Zeta电位52mV的脂质体2和HSA溶液以表4所示的不同DOTAP/HSA比例(w/w)混合，得到紫杉醇阳离子-HSA脂质体。
可见，白蛋白溶液pH有所变化不影响最终产品。
表4
Figure BDA0002474874600000083
Figure BDA0002474874600000091
实施例5：不同水相制备阳离子脂质体
DOTAP/DOPC/紫杉醇以50/47/3摩尔比例溶于乙醇，DOTAP、DOPC和紫杉醇摩尔浓度之和为1000mM，形成乙醇溶液，注入如表5所示的不同水相溶液中，乙醇溶液和水相溶液的体积比为1:74，混合搅拌即得紫杉醇阳离子脂质体1。将所得脂质体1过0.2μm聚碳酸酯膜挤出，可得到粒径均匀的脂质体2。将脂质体2与5％的HSA等体积混合，即得阳离子-HSA脂质体。将脂质体分装到西林瓶中，按照设定程序冷冻干燥，得到冻干粉。
冻干粉以注射用水复溶后，测定粒径，结果如表5。结果表明海藻糖、乳糖和蔗糖都可以作为冻干保护剂；但是对于冻干保护剂的用量有要求，当保护剂少于2％(质量百分浓度)，冻干复溶后粒径变化较大，包封率下降，低于脂质体一般要求(95％-105％)。
表5
Figure BDA0002474874600000092
实施例6三通法制备紫杉醇阳离子-HSA脂质体
配置HSA 1％浓度的水溶液，将实施例2中得到的粒径162.8nm，PDI 0.128，Zeta电位52mV的脂质体2与HSA水溶液按照1:1体积比，DOTAP/HSA比例(w/w)为0.02，利用小孔三通进行混合，流速6ml/min，得到紫杉醇阳离子-HSA脂质体。所得脂质体粒径、PDI和Zeta电位如表6所示。说明用三通法可以实现所述阳离子-HSA脂质体在生产规模上的扩大。
将所得阳离子-HSA脂质体用300KD再生纤维素膜包进行不同倍数的浓缩，所得脂质体粒径、PDI和Zeta电位如表6所示，无显著变化，说明浓缩可以在不改变脂质体性质的情况下，提高药物浓度，减少输液量。
表6
浓缩体积分数 粒径nm PDI 电位mV
未浓缩 186.5 0.143 -18.4
浓缩1倍 183.0 0.098 -18.4
浓缩2倍 189.5 0.139 -18.3
浓缩4倍 207.2 0.105 -18.4
浓缩8倍 213.4 0.109 -18.4
实施例7阳离子-HSA脂质体放置稳定性
将实施例6中浓缩8倍的阳离子-HSA脂质体冷藏(2-8℃)或冷冻(-20℃)条件下放置1h、24h、72h后，检测粒径、粒度、电位(冷冻样品先复溶再检测)。结果显示上述检测指标均无明显变化(见表7)。
表7
Figure BDA0002474874600000101
说明：实施例8-11中所用阳离子-HSA脂质体是实施例6制备得到的浓缩2倍的阳离子-HSA脂质体，所用阳离子脂质体为实施例4中得到的脂质体2。
实施例8阳离子-HSA脂质体与阳离子脂质体体内药代动力学比较
取体重180～220g的Wistar大鼠24只，雌雄各半，分为2组，尾部静脉注射给与紫杉醇阳离子脂质体和紫杉醇阳离子-HSA脂质体5mg/kg(按紫杉醇计)，给药容积10ml/kg，给药速度1ml/min。采血点为给药后1min、5min、10min、15min、30min、1h、2h、4h和8h。由大鼠眼眶静脉采血0.5ml，分别置于肝素抗凝管中，摇匀，3000rpm离心10min，分取血浆，血浆样品置于-70℃保存待测。LC/MS/MS检测各血样中紫杉醇及DOTAP含量。采用WinNonlin(Ver6.2，Phoeix)软件计算，大鼠静脉注射紫杉醇阳离子脂质体和紫杉醇阳离子-HSA脂质体后，紫杉醇和DOTAP的主要药动学参数对比分别见表8和9。
表8
Figure BDA0002474874600000111
表9
Figure BDA0002474874600000112
实验结果表明紫杉醇阳离子-HSA脂质体与紫杉醇阳离子脂质体体内药代行为无显著差异(P>0.05)。说明HSA并不影响阳离子脂质体的药代动力学特性。
实施例9阳离子-HSA脂质体与阳离子脂质体体内组织分布比较
无菌注射器抽取RM-1瘤细胞悬液皮下接种于C57小鼠前肢腋部皮下组织，接种体积为0.2mL/只，含瘤细胞约5×105个。当肿瘤体积长至400mm3以上，挑选肿瘤生长良好、整体状态良好、体重范围接近的小鼠，按肿瘤体积将动物均衡分组，以苦味酸标记。
实验组分别给予紫杉醇阳离子脂质体或紫杉醇阳离子-HSA脂质体，给药剂量均为含紫杉醇5mg/kg、DOTAP 73mg/kg，给药容积为20ml/kg，控制给药速度为2.5ml/min。在给药后1min、15min、60min、4h、8h和24h时间点检测分布情况，每个实验组每个时间点5只小鼠。检测血浆、心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织中紫杉醇含量和DOTAP含量。分布情况见表10和11。
表10
Figure BDA0002474874600000113
Figure BDA0002474874600000121
表11
Figure BDA0002474874600000122
Figure BDA0002474874600000131
结果表明，紫杉醇阳离子-HSA脂质体与阳离子脂质体在静脉注射后，均快速聚集于肺部，随后逐渐重新分布到血液。比较同一时间点各器官和血浆中活性物质(紫杉醇)和DOTAP的浓度，发现按浓度高低排序的情况无明显差异，说明HSA修饰不会显著影响阳离子脂质体药物在组织器官和血液中的分布。静脉注射阳离子-HSA脂质体与阳离子脂质体，紫杉醇在肿瘤组织中的AUC无明显差异(P>0.05)。说明HSA的修饰可能不会对药物疗效产生显著影响。
比较各时间点DOTAP在肺组织中浓度变化，发现阳离子-HSA脂质体组从肺部移除的速度比阳离子脂质体组更快，阳离子-HSA脂质体组AUC明显低于阳离子脂质体(P<0.01)，说明经过HSA修饰，可以明显减少阳离子两亲性脂质在肺部滞留，降低肺栓塞的风险。
实施例10阳离子-HSA脂质体与阳离子脂质体快速静脉注射的急性毒性比较
取体重20-25g的BALB-C雌性小鼠，随机编为5组，每组5只小鼠。A组为对照组，注射5％葡萄糖；B组给与紫杉醇阳离子脂质体2.5mg/kg(按紫杉醇计)；C组给与紫杉醇阳离子脂质体3.0mg/kg(按紫杉醇计)；D组给与紫杉醇-HSA阳离子脂质体2.5mg/kg(按紫杉醇计)；E组给与紫杉醇-HSA阳离子脂质体3.0mg/kg(按紫杉醇计)。小鼠尾部静脉推注，给药容积20ml/kg，3s内推注完毕。观察动物毒性行为。
其中B组动物给药后发生抽搐，濒临死亡，5min后缓解；D组动物不发生抽搐，无明显异常。C组动物给药后发生抽搐，4只在1min内死亡，1只抽搐5min后缓解；E组动物给药时挣扎，给药后无明显异常。观察结束后将小鼠处死，A组、D组和E组小鼠解剖无异常，B组小鼠肺部少量血点，C组小鼠肺部均有大量暗红色斑点，其中3只小鼠口鼻处有淡红色血沫。
结果表明，同等给药剂量下，阳离子-HSA脂质体与阳离子脂质体相比，快速静脉注射引起肺栓塞的风险大大降低，药物安全性改善。
实施例11阳离子-HSA脂质体与阳离子脂质体小鼠最大耐受剂量(MTD)比较
取体重20-25g的KM雄性小鼠，分为A、B、C三组，A组为对照组，给与5％葡萄糖；B组给予不同剂量的紫杉醇阳离子脂质体，每个浓度点5只小鼠；C组给与不同剂量的紫杉醇阳离子-HSA脂质体，每个浓度点5只小鼠；给药速度5ml/min，给药容积20ml/kg。观察给药后毒性反应，计算各组最大耐受剂量(MTD)。
结果表明，紫杉醇阳离子脂质体MTD为3.7mg/kg，紫杉醇阳离子-HSA脂质体MTD为5.3mg/kg，提高了43％。证明含紫杉醇阳离子脂质体添加HSA后毒性明显降低，安全性大大提高。
实施例12乙醇注入法制备紫杉醇阳离子-HSA脂质体
DODAP/EPC/API(紫杉醇)以50/49/1的摩尔比例溶于乙醇，DODAP、EPC和紫杉醇摩尔浓度之和为500mM，形成乙醇溶液，注入到8％海藻糖溶液中，乙醇溶液和海藻糖溶液的体积比为1:49，搅拌10min即得阳离子脂质体1。将所得脂质体1过0.2μm聚碳酸酯膜挤出，可得到粒径均匀的阳离子脂质体2。将脂质体2与5％的HSA(人血清白蛋白)等体积混合，即得阳离子-HSA脂质体。
实施例13乙醇注入法制备紫杉醇阳离子-HSA脂质体
DDAB/DPPC/API(紫杉醇)以50/47/3的摩尔比例溶于乙醇，DDAB、DPPC和紫杉醇摩尔浓度之和为500mM，形成乙醇溶液，注入到10％葡萄糖溶液中，乙醇溶液和葡萄糖溶液的体积比为1:49，搅拌10min即得阳离子脂质体1。将所得脂质体1过0.2μm聚碳酸酯膜挤出，可得到粒径均匀的阳离子脂质体2。将脂质体2与5％的HSA(人血清白蛋白)等体积混合，即得阳离子-HSA脂质体。
实施例14乙醇注入法制备紫杉醇阳离子-HSA脂质体
DOTMA/HSPC/API(紫杉醇)以50/47/3的摩尔比例溶于乙醇，DOTMA、HSPC和紫杉醇摩尔浓度之和为500mM，形成乙醇溶液，注入到6％蔗糖溶液中，乙醇溶液和蔗糖溶液的体积比为1:49，搅拌10min即得阳离子脂质体1。将所得脂质体1过0.2μm聚碳酸酯膜挤出，可得到粒径均匀的阳离子脂质体2。将脂质体2与5％的HSA(人血清白蛋白)等体积混合，即得阳离子-HSA脂质体。
实施例15薄膜分散法制备伊立替康(CPT-11)阳离子-HSA脂质体
将DODAP/DOPE以50:47摩尔比例溶于5ml氯仿，磷脂总浓度500mM，旋转蒸发后除去氯仿，在烧瓶表面形成磷脂薄膜。加入1mg/ml CPT-11水溶液10ml，水化后即得CPT-11阳离子脂质体1。将所得脂质体过200nm聚碳酸酯膜挤出，可得到粒径均匀的脂质体2。将脂质体2与5％的HSA等体积混合，即得CPT-11阳离子-HSA脂质体。

Claims (13)

1.一种含有白蛋白和阳离子脂质体的组合物，其特征在于所述白蛋白包裹在所述阳离子脂质体的外部，所述阳离子脂质体含有阳离子两亲性脂质、中性脂质和活性成分，所述阳离子两亲性脂质与白蛋白的质量比为小于0.08，优选小于0.075，更优选小于0.07，最优选0.008-0.07。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述阳离子两亲性脂质选自DOTAP、DODAP、DDAB或DOTMA，优选DOTAP。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于阳离子两亲性脂质、中性脂质和活性成分的摩尔比为50:(40-49.9):(0.1-10)，优选50:(45-49):(1-5)，更优选50:(47-49):(1-3)。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述活性成分选自可以制备成脂质体的任何药物，包括抗肿瘤药物，进一步优选二萜类化合物，进一步优选紫杉烷类药物，如紫杉醇、多西他赛等，和喜树碱类化合物，如伊立替康、伊立替康的活性代谢产物SN-38；所述中性脂质包括天然磷脂和合成磷脂，选自DOPC(1,2-二油酰基卵磷脂),EPC(蛋黄卵磷脂)、PC(大豆卵磷脂)、HSPC(氢化大豆卵磷脂)、DPPC(二棕榈酸磷脂酰胆碱)、DOPE(二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺)、GPC(甘油酰磷脂酰胆碱)、DMPC(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)等。
5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述白蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白，优选人血清白蛋白。
6.如权利要求1-5中任一项所述组合物，其特征在于所述组合物的Zeta电位为-25mV至10mV，优选-25mv至-10mv；优选的，所述组合物的粒径为60-500nm，优选150-270nm；优选的，与结合白蛋白之前的阳离子脂质体相比，所述组合物粒径增长不超过500nm，优选不超过200nm，进一步优选不超过100nm。
7.如权利要求1-5中任一项所述的组合物的制备方法，含有如下步骤：(1)将所需装载的活性成分与阳离子两亲性脂质、中性脂质制备成阳离子脂质体，(2)将阳离子脂质体与白蛋白结合。
8.如权利要求7所述的组合物的制备方法，其特征在于步骤(2)所述结合是将所述阳离子脂质体与白蛋白溶液进行混合，所述混合的方法选自滴注、三通法、静态混合器混合。
9.一种药物制剂，所述药物制剂含有权利要求1-6中任一项所述组合物和药学上可接受的载体。
10.如权利要求9所述的药物制剂，其特征在于所述药学上可接受的载体选自海藻糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和环糊精中的一种或几种，优选海藻糖、葡萄糖和蔗糖中的一种或几种。
11.如权利要求9所述的药物制剂，其特征在于所述药物制剂为注射剂型，包括注射液、注射用粉剂、注射用片剂，优选注射液或冻干粉针剂。
12.权利要求1-6中任一项所述组合物或权利要求9-11中任一项所述的药物制剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
13.白蛋白在制备含阳离子脂质体的药物中的用途，所述用途是指降低阳离子脂质体引起血管栓塞的风险，所述白蛋白包裹在所述阳离子脂质体的外部；所述血管栓塞优选肺栓塞。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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李赛: "白蛋白包覆阳离子脂质纳米载体的制备及静脉注射药代动力学和组织分布", 《中国药科大学学报》, pages 406 - 411 *

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