CN113574075B - 卡拉胶衍生物、用于标记巨噬细胞的探针及用于制备其的方法 - Google Patents
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Abstract
根据本发明的卡拉胶衍生物可以快速且容易地检测和标记炎症相关的巨噬细胞的存在,特别是可以准确且容易地识别与早期炎症高度相关的M1型巨噬细胞。此外,卡拉胶衍生物具有容易制备、因使用少量有机溶剂而最大程度减少环境污染、以及初始成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于标记巨噬细胞的探针,其能特异性标记由炎症诱导的巨噬细胞。更具体地,本公开涉及一种卡拉胶衍生物(其允许通过与特异性存在于巨噬细胞表面上的CD80相互作用来检测巨噬细胞的存在)、一种用于标记巨噬细胞的探针(其为与放射性同位素或荧光染料结合的复合物形式)、一种用于制备探针的方法、一种用于提供关于巨噬细胞位置的信息的方法以及一种用于标记巨噬细胞且包括探针的试剂盒。
背景技术
炎症是身体组织对有害刺激,例如病原体、受损的细胞或刺激物的生物反应的一部分,并且其是涉及免疫细胞、血管和分子介质的保护性反应。炎症的作用是消除细胞损伤的最初原因,清除伤口部位的坏死细胞和受损的组织,并且使组织再生。
因此,开发能够无创追踪炎症细胞运动的成像技术可以成为各种炎症细胞相关的研究的基础。虽然在各种动物模型中对由炎症细胞诱导的各种疾病的治疗进行了实验,但由于尚未开发出能够定量且有效评价治疗效果的成像探针,因此困难在于必须反复牺牲昂贵的动物模型。
因为允许通过无创核医学成像评估细胞治疗的效果,并且在临床上适用,因此对几种放射性药物寄予厚望。
特别是,由于它们允许通过无创成像实时监测各种疾病涉及的巨噬细胞,并且可广泛应用于监测各种疾病,如炎症、动脉硬化、自身免疫性疾病、肿瘤等的发病、进展和治疗,已经开发出各种能够有效标记巨噬细胞的成像探针物质。
作为代表性的实例,已经报道了使用氟-18氟脱氧葡萄糖(18F-FDG)标记巨噬细胞的方法。该方法利用巨噬细胞的代谢特性。具体地,由于与其他细胞相比,巨噬细胞表现出葡萄糖摄取增加以及作为葡萄糖衍生物的FDG的摄取增加,因此利用这些特性可以检测巨噬细胞的存在。然而,由于其基于巨噬细胞的代谢特性,使用18F-FDG标记和成像巨噬细胞的技术具有一些局限性。首先,由于FDG是葡萄糖类似物,它受血液中葡萄糖和代谢相关的激素的影响,因此巨噬细胞标记的准确性和再现性可能会根据身体状况而有显著差异。另外,在诊断前身体状况应保持不变。此外,因为需要满足如禁食、血糖等条件,所以它在高危人群中限制使用。其次,由于大脑和心脏使用血糖作为营养物质,因此无法检测大脑和心脏中发生的病灶。最后,使用FDG不能选择性检测促炎M1巨噬细胞的存在。
因此,有必要开发新方法,其在不受身体状况影响的情况下能够检测吞噬作用,特别是巨噬细胞的吞噬作用。
发明内容
技术问题
本公开旨在提供具有改性的结构的卡拉胶衍生物,其可以与巨噬细胞的CD80特异性结合。
本公开还旨在提供用于标记巨噬细胞的探针,其中荧光染料或放射性同位素与卡拉胶衍生物结合。
本发明还旨在提供用于简便和方便地大规模制备卡拉胶衍生物和用于标记巨噬细胞的探针的方法。
本公开还旨在提供用于提供关于巨噬细胞位置的信息的方法。
技术方案
本公开提供了一种卡拉胶衍生物,其由以下物质形成
通过过碘酸氧化将具有由化学式1表示的重复单元的卡拉胶的半乳糖部分或3,6-脱水半乳糖部分的羟基氧化为醛基,并且醛基被由化学式2或化学式3表示的化合物取代然后被还原:
化学式1
化学式2
化学式3
在以上化学式中,R1至R5彼此相同或不同,各自选自-H、-OH、-CH3、-CH2OH、-COOH或-OSO3 -中的任一个,n是1至10000的整数,并且o是1至10的整数。
由化学式1表示的卡拉胶可以是选自化学式a至化学式c表示的任一个,具体地,由化学式c表示的λ-卡拉胶。
化学式a
化学式b
化学式c
在以上化学式中,n可为50至10000的整数。
卡拉胶衍生物可充当巨噬细胞的CD80的配体。
巨噬细胞可为M1型巨噬细胞。
每分子结合的卡拉胶衍生物可以具有一种或两种由化学式2或化学式3表示的化合物作为亲和基团。
卡拉胶衍生物可以具有1摩尔%至40摩尔%的取代度。
本公开提供了一种用于制备卡拉胶衍生物的方法,其包括:
步骤1)通过将具有由化学式1表示的重复单元的卡拉胶与氧化剂反应来制备具有由化学式1和化学式4表示的重复单元的卡拉胶-醛;
步骤2)通过将步骤1)中制备的卡拉胶-醛与由化学式2或化学式3表示的化合物反应,用化学式2或化学式3的化合物取代卡拉胶-醛的醛基;以及
步骤3)将步骤2)中制备的经取代的卡拉胶衍生物与还原剂反应。
化学式1
化学式2
化学式3
化学式4
在以上化学式中,R1至R5各自独立地选自-H、-OH、-CH3、-CH2OH、-COOH和-OSO3 -中的任一个,n和m各自是1至10000的整数,并且o是1至10的整数。
氧化剂可为过碘酸钠。
每单元具有由化学式1表示的重复单元的卡拉胶可添加1摩尔至10摩尔当量的氧化剂。
步骤1)可在10℃至30℃下进行1分钟至180分钟。
在步骤2)中,可以进行反应使得每个卡拉胶-醛分子反应1至10个、具体2至6个由化学式2或化学式3表示的化合物的分子。
在步骤3)中,每单元具有由化学式1表示的重复单元的卡拉胶可添加1摩尔至100摩尔当量的还原剂。
步骤3)可在-10℃至10℃下进行1分钟至240分钟。
还原剂可为氰基硼氢化钠(NaCNBH3)或硼氢化钠。
本公开还提供了一种用于标记巨噬细胞的探针,其中荧光染料或放射性同位素与上述卡拉胶衍生物结合。
荧光染料可选自Cy3、Cy5、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(RITC)、Alexa、4,4,-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚满(BODIPY)、德克萨斯红、NOTA和生物素中的一种或多于一种。
放射性同位素可选自C-11、F-18、Ga-67、Ga-68、Cu-64、I-123、I-124、I-125、Zr-89、In-111、Tc-99m、Y-90、Re-186、Re-188、Lu-177、Ac-225、At-211和I-131中的一种或多于一种。
巨噬细胞可以是通过炎症诱导因子获得的。
用于标记巨噬细胞的探针可以特异性标记M1型巨噬细胞。
本公开还提供了一种用于成像巨噬细胞的试剂盒,其包括用于标记巨噬细胞的探针。
本公开还提供了一种用于制备用于标记巨噬细胞的探针的方法,其包括:
步骤a)通过将具有由化学式1表示的重复单元的卡拉胶与氧化剂反应来制备具有由化学式1和化学式4表示的重复单元的卡拉胶-醛;
步骤b)通过将步骤a)中制备的卡拉胶-醛与由化学式2或化学式3表示的化合物反应,用化学式2的化合物取代卡拉胶-醛的醛基;
步骤c)将步骤b)中制备的经取代的卡拉胶衍生物与还原剂反应;以及
步骤d)将步骤c)中制备的卡拉胶衍生物与放射性同位素或异硫氰酸酯改性的荧光染料反应。
化学式1
化学式2
化学式3
化学式4
在以上化学式中,R1至R5各自独立地选自-H、-OH、-CH3、-CH2OH、-COOH和-OSO3 -中的任一个,n和m各自为1至10000的整数,并且o是1至10的整数。
本公开还提供了一种用于制备用于标记巨噬细胞的探针的方法,其包括:
步骤i)通过将具有由化学式1表示的重复单元的卡拉胶与氧化剂反应来制备具有由化学式1和化学式4表示的重复单元的卡拉胶-醛;
步骤ii)通过将步骤i)中制备的卡拉胶-醛与由化学式2或化学式3表示的化合物反应,用化学式3的化合物取代卡拉胶-醛的醛基;
步骤iii)将步骤ii)中制备的经取代的卡拉胶衍生物与还原剂反应:以及
步骤iv)使步骤iii)中制备的卡拉胶衍生物与由化学式5表示的叠氮化合物进行无铜点击反应:
化学式1
化学式2
化学式3
化学式4
化学式5
其中R1至R5各自独立地选自-H、-OH、-CH3、-CH2OH、-COOH和-OSO3 -中的任一个,n和m各自为1至10000的整数,o为1至10的整数,并且A选自Cy3、Cy5、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(RITC)、Alexa、4,4,-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚满(BODIPY)、德克萨斯红、NOTA、生物素、C-11、F-18、Ga-67、Ga-68、Cu-64、I-123、I-124、I-125、Zr-89、In-111、Tc-99m、Y-90、Re-186、Re-188、Lu-177、Ac-225、At-211和I-131中的一种或多于一种。
本公开还提供了一种用于提供关于巨噬细胞位置的信息的方法,其通过向分离的生物样品施用含有用于标记巨噬细胞的探针的组合物。
巨噬细胞可以是炎症相关的M1型巨噬细胞。
有益效果
根据本公开的卡拉胶衍生物可以快速且容易地检测和标记炎症相关的巨噬细胞的存在,特别是可以准确且容易地识别与早期炎症高度相关的M1型巨噬细胞。
另外,卡拉胶衍生物具有容易制备、因使用少量有机溶剂而最大程度减少环境污染、以及初始成本低等优点。
此外,卡拉胶衍生物的优势在于,与现有用于标记炎症相关的细胞的物质不同,它与巨噬细胞的细胞表面受体CD80直接相互作用,不受新陈代谢影响,因此无需在诊断前保持身体状况。
附图说明
图1A、图1B和图1C显示了瞬时薄层色谱(iTLC)的结果以确认实施例1中制备的用于标记巨噬细胞的Tc-99m标记的探针的合成。图1A、图1B以及图1C显示了在柠檬酸、盐水和丙酮中瞬时薄层色谱(iTLC)的测量结果。
图2显示了根据RITC浓度(1mg/mL至0.01mg/mL)的UV校准曲线。
图3显示了实施例2中制备的用于标记巨噬细胞的RITC标记的探针的紫外吸光度。
图4显示了卡拉胶(λ-卡拉胶)的平均分子量。
图5显示了λ-卡拉胶、制备例2的卡拉胶衍生物和实施例2的用于标记巨噬细胞的RITC标记的探针的MALDI-TOF结果。
图6显示了λ-卡拉胶的MALDI-TOF原始数据。
图7显示了制备例2的卡拉胶衍生物的MALDI-TOF原始数据。
图8显示了实施例2的用于标记巨噬细胞的RITC标记的探针的MALDI-TOF原始数据。
图9显示了用在各种浓度或标准RITC溶液下实施例2制备的用于标记巨噬细胞的探针(RITC-CGN)处理后获得的活化的白细胞(Raw264.7)的荧光显微图像。
图10显示了用CD80抗体处理的测试组和阴性对照组的荧光显微图像。
图11显示了用TPR4抗体处理的测试组和阴性对照组的荧光显微图像。
图12显示了根据本公开用于标记巨噬细胞的RITC标记的探针的作用机制。
图13显示了在使用实施例2中制备的用于标记巨噬细胞的探针(RITC-CGN)或FITC标记的CD197(M1分化标志物)染色后,通过流式细胞仪观察巨噬细胞的细胞分布,从而确认RITC-CGN与M1型巨噬细胞(分化的THP-1巨噬细胞)特异性反应的结果。
最佳实施方式
本发明涉及充当CD80配体的卡拉胶衍生物,CD80是巨噬细胞,特别是M1型巨噬细胞的细胞膜受体之一。它由具有由化学式1表示的重复单元的卡拉胶合成,并且它可以快速、准确且重复地标记巨噬细胞。当连接同位素99mTc或RITC时,它可以特异性成像炎症相关的巨噬细胞,特别是M1型巨噬细胞。
与现有的18F-FDG标记不同,本公开的卡拉胶衍生物通过直接结合CD80而发挥作用,CD80是巨噬细胞的细胞膜受体之一。利用这些特性本公开的发明人已经开发了一种用于标记巨噬细胞的探针及一种用于制备该探针的方法。已经证实,用于标记巨噬细胞的探针可以在分子生物学上对M1型巨噬细胞(促炎巨噬细胞)的存在进行成像。
在下文中,将更具体地描述本公开的各个方面和示例性实施方案。
本公开的一个方面涉及一种卡拉胶衍生物,其由以下物质形成:通过过碘酸氧化将具有由化学式1表示的重复单元的卡拉胶的半乳糖部分或3,6-脱水半乳糖部分的羟基氧化为醛基,并且醛基被由化学式2或化学式3表示的化合物取代然后被还原。
化学式1
化学式2
化学式3
在以上化学式中,R1至R5彼此相同或不同,各自选自-H、-OH、-CH3、-CH2OH、-COOH或-OSO3 -中的任一个,n是1至10000的整数,并且o是1至10的整数。
除非另有说明,否则本公开的由化学式1表示的卡拉胶没有特别限制。为了优化与巨噬细胞特异性结合的卡拉胶衍生物,卡拉胶可以是分子量具体为10000Da至3000000Da,更具体为10000Da至1000000Da的一种。
本公开中使用的术语“卡拉胶”是指具有由化学式1表示的重复单元的聚合物,并且可以用于包括卡拉胶的盐形式。具体地,卡拉胶可以是选自由化学式a至化学式c表示的任一种。
化学式a
化学式b
化学式c
在以上化学式中,m可为50至10000的整数。
在本公开中,过碘酸氧化表示当两个羟基彼此相邻、一个羟基与醛或酮相邻、或存在与醛或酮动态平衡的半缩醛和半缩酮时,与过碘酸(NaIO4)反应同时发生氧化和碳-碳键断裂的反应。
通常,当多糖如卡拉胶被氧化剂等氧化时,随着脂肪族环结构如半乳糖或3,6-脱水半乳糖被打开(开环)时,多糖的2位、3位或两个位置的羟基都会转变为醛基。当多糖的醛基与由化学式2或化学式3表示的化合物的胺基通过亚胺键反应时,形成被由化学式2或化学式3表示的化合物取代的卡拉胶衍生物。随后,通过用还原剂还原由化学式2或化学式3表示的化合物的胺基与卡拉胶的醛基反应形成的双键,可以获得本公开的卡拉胶衍生物。
在本公开中,通过过碘酸氧化氧化的卡拉胶被称为卡拉胶-醛。具体地,卡拉胶-醛可以含有由化学式1和化学式4表示的重复单元。
化学式1
化学式4
在以上化学式中,R1至R5各自独立地选自-H、-OH、-CH3、-CH2OH、-COOH和-OSO3 -中的任一个,并且表示重复单元数量的n和m各自为1至10000的整数。
卡拉胶-醛的重复单元可以包含60摩尔%至99摩尔%的化学式1的重复单元和1摩尔%至40摩尔%的化学式4的重复单元,具体地80摩尔%至90摩尔%的化学式1的重复单元和10摩尔%至25摩尔%的化学式4的重复单元。
当通过使卡拉胶-醛与由化学式2或化学式3表示的化合物反应,用由化学式2或化学式3表示的化合物取代卡拉胶-醛的醛基时,使用取代度的概念。在本公开中,术语“取代度”指由化学式2或化学式3表示的各个化合物的改性度/取代度。
对于由化学式2表示的化合物,可以结合用官能团或放射性同位素改性的荧光染料。官能团可以是硫氰酸酯(-SCN)基团或异硫氰酸酯(-NCS)基团。荧光染料选自Cy3、Cy5、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(RITC)、Alexa、4,4,-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚满(BODIPY)、德克萨斯红、NOTA和生物素中的一种或多于一种。
并且,对于由化学式3表示的化合物,荧光染料或放射性同位素可以通过无铜点击化学结合。可以从由化学式5表示的化合物(叠氮化合物)中引入荧光染料或放射性同位素。
由于通过与巨噬细胞,特别是M1型巨噬细胞表面存在的CD80特异性相互作用,卡拉胶衍生物有效结合炎症相关的细胞的表面,因此其可用于检测和诊断炎症的存在。
通常,当NHS、丙烯酸酯、硫醇或马来酰亚胺基团被引入到衍生物的表面时,通过与存在于细胞表面的蛋白质的胺基或硫醇基的共价键合,无论细胞类型如何都会形成相互作用。然而,在本公开中,通过取代和还原卡拉胶来合成卡拉胶衍生物,使其能够与炎症相关的巨噬细胞特异性结合。通过这种方式,可以与炎症相关的巨噬细胞特别是M1型巨噬细胞特异性形成相互作用。
通过以下过程合成卡拉胶衍生物:
步骤1)通过将具有由化学式1表示的重复单元的卡拉胶与氧化剂反应来制备具有由化学式1和化学式4表示的重复单元的卡拉胶-醛;
步骤2)通过将步骤1)中制备的卡拉胶-醛与由化学式2或化学式3表示的化合物反应,用化学式2或化学式3的化合物取代卡拉胶-醛的醛基;以及
步骤3)将步骤2)中制备的经取代的卡拉胶衍生物与还原剂反应。
1)通过将具有由化学式1表示的重复单元的卡拉胶与氧化剂反应来制备具有由化学式1和化学式4表示的重复单元的卡拉胶-醛。
化学式1
化学式2
化学式3
化学式4
在以上化学式中,R1至R5各自独立地选自-H、-OH、-CH3、-CH2OH、-COOH和-OSO3 -中的任一个,n和m各自为1至10000的整数,并且o为1至10的整数。
为了防止聚集,具有由化学式1表示的重复单元的卡拉胶的浓度可以具体地低于10mg/mL,最具体地为1mg/mL至5mg/mL。
通过步骤1),当脂肪族环结构如半乳糖或3,6-脱水半乳糖被打开(开环)时,氧化剂氧化具有由化学式1表示的重复单元的卡拉胶并且卡拉胶的2位、3位或两个位置的羟基变为醛基。结果是制备了具有由化学式1和4表示的重复单元的卡拉胶-醛。具体地,卡拉胶-醛的氧化度(定义为在所有卡拉胶重复单元中打开具有形成为卡拉胶的环结构的醛基的重复单元(化学式4)的摩尔比(%))可由0至1或0摩尔%至100摩尔%之间的值表示。具体地,在步骤1)之后构成卡拉胶-醛的重复单元可以包含60摩尔%至99摩尔%的化学式1的重复单元和1摩尔%至40摩尔%的化学式4的重复单元,具体地,80摩尔%至90摩尔%的化学式1的重复单元和10摩尔%至25摩尔%的化学式4的重复单元。
当卡拉胶-醛的由化学式1和化学式4表示的重复单元的摩尔%满足上述条件时,由于可以保证荧光染料和放射性同位素足以与巨噬细胞中的CD80结合并充分相互作用,因此可以实现预期的巨噬细胞靶向作用。
由于生物相容的、可生物降解的聚合物的卡拉胶可以安全地应用于人体,并且通过与荧光染料或放射性同位素缀合,通过打开环结构,卡拉胶的骨架结构与保持完整的巨噬细胞特异性结合,从而可以特异性标记巨噬细胞(其为炎症相关的细胞),从而最大化卡拉胶的巨噬细胞特异性递送特征,其可用于早期炎症相关的巨噬细胞的各种检测和诊断。
只要能破坏卡拉胶的环状结构,对氧化剂没有特别限制。具体地,可以使用过碘酸钠(NaIO4)。
具体地,每单元具有由化学式1表示的重复单元的卡拉胶添加1摩尔当量至10摩尔当量、更具体地1摩尔当量至5摩尔当量的氧化剂。具体地,氧化剂可以反应1分钟至180分钟,更具体地10分钟至60分钟。
具体地,在本公开中,可以添加至少1摩尔当量至10摩尔当量的氧化剂,使得90%或多于90%的卡拉胶衍生物被Tc-99m或荧光染料标记。
与氧化剂反应后,还可包括用蒸馏水透析的纯化步骤。
然后,2)通过将步骤1)中制备的卡拉胶-醛与由化学式2或化学式3表示的化合物反应,将卡拉胶-醛的醛基取代为化学式2或化学式3的化合物。
具体地,将步骤1)中制备的卡拉胶-醛溶于蒸馏水中后,通过添加由化学式2或化学式3表示的化合物进行反应。例如,通过添加化学式2或化学式3的化合物,可以使卡拉胶-醛的醛基与化学式2或化学式3的化合物的胺基反应。由于化学式2或化学式3的化合物,例如半胱胺或DBCO具有胺基,因此在步骤2)中使用的化学式2或化学式3的化合物可以单独使用而无需制备过程。此外,由于卡拉胶-醛与化学式2或化学式3的化合物是水溶性的,因此可以通过溶于水中而在水溶液中进行反应。
由于卡拉胶-醛的醛基反应性很强,如果不与由化学式2或化学式3表示的化合物反应而残留,则其后与巨噬细胞的CD80相互作用时准确度可能会下降。
因此,优选以过量的量混合由化学式2或化学式3表示的化合物。由化学式2或化学式3表示的化合物的量可以根据卡拉胶-醛的氧化度来适当选择。具体地,可以添加1摩尔当量至100摩尔当量的卡拉胶-醛的醛基,并且反应时间为10分钟至240分钟,具体为30分钟至180分钟。
如果步骤2)后的卡拉胶-醛中残留未反应的醛基,还可以包括将其封闭的步骤。对于封闭,可以使用能够与羧基或醛基反应的物质而没有特别限制。具体地,可以使用胺。更具体地,胺可以是C1-5直链或带支链的氨基甲酸烷醇酯或C1-5低级烷醇胺。
具体地,步骤2)可以在蒸馏水或缓冲溶液中进行。缓冲溶液pH可以为5至7,更具体地pH 5至6.5。
每个卡拉胶-醛分子或卡拉胶分子可以反应一至十个,具体地二至六个本公开的由化学式2或化学式3表示的化合物的分子。
随后,3)将步骤2)中制备的取代的卡拉胶衍生物与还原剂反应,制备卡拉胶衍生物。
步骤2)中制备的经取代的卡拉胶衍生物可以通过加入还原剂进行反应。还原剂还原由化学式2或化学式3表示的化合物的胺基与卡拉胶-醛的醛基反应形成的双键。
还可以根据取代度(指由化学式2或化学式3表示的化合物的改性度/取代度)适当选择还原剂。具体地,可以加入2摩尔当量至100摩尔当量,更具体地10摩尔当量至50摩尔当量的由化学式2或化学式3表示的化合物,并且反应进行10分钟至240分钟,具体地30分钟至180分钟。
还原剂可以是氰基硼氢化钠(NaCNBH3)或硼氢化钠。
具体地,在与还原剂反应后,还可以包括用蒸馏水透析的纯化步骤。
在制备卡拉胶衍生物时,最重要的是用Tc-99m或荧光染料标记它。对于至少90%的标记,除了氧化剂之外,化学式2或化学式3的化合物和还原剂的浓度也很重要。因此,建议化学式2或化学式3的化合物和还原剂的浓度在上述范围内。用于标记巨噬细胞的探针可以从上述制备的卡拉胶衍生物的点击化学反应获得。具体地,基于1摩尔的卡拉胶衍生物,可以引入1摩尔当量或多于1摩尔当量,最具体地1摩尔当量至10摩尔当量的由化学式5表示的叠氮化合物。
本公开的另一个方面涉及一种用于成像巨噬细胞的试剂盒,其包括荧光染料或放射性同位素;以及一种用于标记与卡拉胶衍生物结合的巨噬细胞的探针。
根据本公开的用于标记巨噬细胞的探针克服了使用18F-FDG诊断炎症的局限性并告知炎症是否正在恶化或愈合。首先,由于FDG是葡萄糖类似物,它受血液中葡萄糖和代谢相关的激素影响。因此,由于不容易保持身体状况,检查前必须禁食。另外,它的使用限于高血糖症,如糖尿病等。相比之下,因为它没有代谢限制,本发明的用于标记巨噬细胞的探针不需要禁食,并且因为它与其他代谢相关的激素的状况没有关系,即使在糖尿病的情况下也可以不受限制地用于诊断动脉粥样硬化。另外,虽然使用FDG不能诊断脑和心脏的病灶,但本公开的用于标记巨噬细胞的探针不存在此类问题。此外,尽管使用FDG不能选择性诊断促炎M1巨噬细胞的存在,但本公开的用于标记巨噬细胞的探针允许更准确地诊断炎症。
具体地,巨噬细胞在通过吞噬作用清除身体的外来物质或废物和先天免疫方面发挥着核心作用,并且其在通过抗原加工来调节获得性免疫方面也发挥着重要作用。还已知巨噬细胞的活性或功能提高通常会导致身体中病理状况。
巨噬细胞与单核细胞不同,并且根据组织微环境巨噬细胞具有多种表型。在脂多糖(LPS)和T淋巴细胞分泌的细胞因子如干扰素(IFN)-γ的作用下,它们分化为M1型巨噬细胞,M1型巨噬细胞通过炎性细胞因子的分泌和吞噬作用参与组织清创和炎症反应。相反,在炎性细胞因子如IL-4或IL-13占主导的环境下,它们分化为M2型巨噬细胞,M2型巨噬细胞表达甘露糖受体、dectin-1、精氨酸酶等,并且参与组织修复。周围的炎症环境决定巨噬细胞的这些表型,但调节单核细胞向巨噬细胞分化的整体机制尚未阐明。
也就是说,虽然M1巨噬细胞在早期阶段更为丰富并介导其他效应细胞的清除和募集,但M2巨噬细胞在炎症结束时占主导地位并促进血管形成和新组织形成。因此,通过标记巨噬细胞,尤其是M1型巨噬细胞,可以更准确地诊断炎症过程。
用于标记巨噬细胞的探针或用于成像巨噬细胞的试剂盒(包括该探针)产生具有区别于环境的特定光学特性的图像信号,用于巨噬细胞结构的可视化以及巨噬细胞CD80表达的位置、程度、持续时间等。用于标记巨噬细胞的探针和用于成像巨噬细胞的试剂盒(包括该探针)能够通过结合到卡拉胶衍生物的放射性同位素或荧光染料使用荧光和荧光改变实现高度可靠的生物成像,通过体内天然存在的荧光物质与背景噪声区分开来。
因此,用于标记巨噬细胞的探针或包含该探针的用于成像巨噬细胞的试剂盒(包括该探针)可以通过标记巨噬细胞来诊断和检测相关的疾病。可诊断的疾病包括动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、缺血性疾病、再狭窄、高血压、纤维血管疾病(糖尿病、系统性红斑狼疮等)、神经退行性疾病(例如阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、脊髓小脑变性、肌萎缩侧索硬化等)、脑损伤、脑血管意外(例如中风、癫痫、神经损伤和中枢神经系统再生等)、造血障碍、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、癌症(特别是白血病,包括成人T细胞白血病)和实体癌、自身免疫性疾病、感染(例如HIV感染、AIDS等)、纤维增生性疾病(例如银屑病等)、慢性和急性炎症性疾病(例如关节风湿病、克罗恩病、炎症性肠病等)、肾小球疾病、脓毒症、移植排斥、移植物抗宿主病、骨病、以可变形纤维增生/炎症反应为特征的心脏和其他血管的病理状况,如以白细胞浸润受损的部位,如缺氧或缺糖组织(如中风、心肌梗死等)为特征的疾病。
荧光染料可以是用官能团改性的荧光染料。官能团可以是硫氰酸酯(-SCN)基团或异硫氰酸酯(-NCS)基团。荧光染料可以选自Cy3、Cy5、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(RITC)、Alexa、4,4,-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚满(BODIPY)、德克萨斯红、NOTA和生物素中的一种或多于一种。
放射性同位素可以是C-11、F-18、Ga-67、Ga-68、Cu-64、I-123、I-124、I-125、Zr-89、In-111、Tc-99m、Y-90、Re-186、Re-188、Lu-177、Ac-225、At-211和I-131中的一种或多于一种。
用于标记巨噬细胞的探针或包含该探针的用于成像巨噬细胞的试剂盒还可包含药学上可接受的载体。
载体包括医疗领域常用的载体和媒介。具体地,它包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、缓冲剂(例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾或饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物)、水、盐或电解质(例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠或锌盐)、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素衍生物、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙二醇、羊毛脂等,但不限于此。用于标记巨噬细胞的探针或包含该探针的用于成像巨噬细胞的试剂盒除了上述成分外,还可以包括润滑剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。
用于标记巨噬细胞的探针或包含该探针用于成像巨噬细胞的试剂盒可以制备成水溶液以用于肠胃外施用。具体地,可以使用缓冲溶液,例如汉克溶液、林格溶液或缓冲生理盐水。可以将用于增加黏度的物质如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖添加到用于注射的水悬浮液中。
在另一个具体的示例性实施方案中,用于标记巨噬细胞的探针或包括该探针用于成像巨噬细胞的试剂盒可以是无菌可注射水性或油性悬浮液的形式。根据本领域已知的技术,使用合适的分散剂或润湿剂(例如吐温80)和悬浮剂可以配制该悬浮液。无菌可注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂(例如在1,3-丁二醇中的溶液)中的无菌可注射溶液或悬浮液。作为媒介或溶剂,可以使用甘露醇、水、林格溶液或等渗氯化钠溶液。另外,无菌非挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为此,可以使用任何非挥发性油,包括合成甘油单酯或甘油二酯。
用于标记巨噬细胞的探针或包含该探针用于成像巨噬细胞的试剂盒可以施用于生物或样品。可以通过放射性同位素或荧光染料检测从生物或样品发出的信号来获取图像,并且可以通过紫外线辐射诱导光转换来去除背景噪声。这将使基于特定靶部位的荧光发射的癌症和特定疾病的诊断、生物信号机制的研究、干细胞分化的研究等成为可能。
本文使用的术语“样品”是指从待诊断的对象分离的组织或细胞。用于标记巨噬细胞的探针或包含该探针用于成像巨噬细胞的试剂盒可以通过医学领域中常用的途径注射到生物或样品中。优选肠胃外施用。例如,它可以静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下或局部施用。此外,通过将用于标记巨噬细胞的探针或包括该探针用于成像巨噬细胞的试剂盒添加到细胞培养物中并观察与细胞中巨噬细胞的CD80的结合,可获得用于研究巨噬细胞,特别是M1型巨噬细胞的重要信息。
通过靶标成像,例如单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、正电子发射断层扫描(PET)、微型PET、计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI),或通过使用选自荧光显微镜、共焦荧光显微镜、分光光度计、荧光分析仪、CCD摄像机、实时监测活细胞的显微镜(DeltaVision)及其组合(其可包括在用于成像巨噬细胞的试剂盒中)可检测从本公开的用于标记巨噬细胞的探针或包括该探针用于成像巨噬细胞的试剂盒发射的信号。
本公开的另一个方面涉及一种用于制备用于标记巨噬细胞的探针的方法,其包括:
步骤a)通过将具有由化学式1表示的重复单元的卡拉胶与氧化剂反应来制备具有由化学式1和化学式4表示的重复单元的卡拉胶-醛;
步骤b)通过将步骤a)中制备的卡拉胶-醛与由化学式2或化学式3表示的化合物反应,用化学式2的化合物取代卡拉胶-醛的醛基;
步骤c)将步骤b)中制备的取代的卡拉胶衍生物与还原剂反应;以及
步骤d)使步骤c)中制备的卡拉胶衍生物与放射性同位素或异硫氰酸酯改性的荧光染料反应:
化学式1
化学式2
化学式3
化学式4
在以上化学式中,R1至R5各自独立地选自-H、-OH、-CH3、-CH2OH、-COOH和-OSO3 -中的任一个,n和m各自是1至10000的整数,并且o是1至10的整数。
因为上文已经描述了包括步骤1)、2)和3)的卡拉胶衍生物的制备过程,包括步骤a)、b)和c)的卡拉胶衍生物的制备过程的详细描述将被省略。
放射性同位素是C-11、F-18、Ga-67、Ga-68、Cu-64、I-123、I-124、I-125、Zr-89、In-111、Tc-99m、Y-90、Re-186、Re-188、Lu-177、Ac-225、At-211和I-131中的一种或多于一种。具体地,其可以是Tc-99m。Tc-99m由于其半衰期较短为6小时,且仅发射140keV的γ射线,γ射线具有强穿透能力,对人体的毒性较小,因此通过施于人体优选Tc-99m以获得图像。
当放射性同位素的价数为+5时,如Tc-99m,它可与具有电子给体性质的原子(如氮、硫等)配位。因此,仅由氧和原子组成的卡拉胶不能与Tc-99m稳定配位。相比之下,因为它在化合物中具有此类原子,如氮、硫等,上述制备的卡拉胶衍生物可以与Tc-99m稳定配位。由于Tc-99m从发生器洗脱时的氧化态为+7,因此在使用还原剂还原到+5后,它可以与含氮或硫的葡萄糖衍生物配位。可以用相同的方法标记放射性同位素188Re和186Re。
还原剂可以是选自抗坏血酸、硫酸铜水合物(CuSO4·5H2O)、氯化锡水合物(SnCl2·2H2O)和硫酸锡(SnSO4)中的任一种。还原剂通过还原放射性同位素促进用放射性同位素标记卡拉胶衍生物。
制备的用于标记巨噬细胞的探针的优点在于当其用于成像巨噬细胞时,不会降低标记效率。包含在分子结构中的放射性同位素可以使用X射线源成像。
由于卡拉胶衍生物充当金属螯合剂,根据本公开的用于标记巨噬细胞的探针可以与造影剂中使用的放射性同位素形成稳定的键。参见,例如,实施例1中的反应方案2作为实例。
同时,荧光染料是一种物质,它被特定波长的光激发后,将吸收的能量以特定波长的光放出,并返回到它的基态能级。它可以选自Cy3、Cy5、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基罗丹明异硫氰酸(RITC)、Alexa、4,4,-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚满(BODIPY)、德克萨斯红、NOTA和生物素中的一种或多于一种。
通过卡拉胶衍生物与荧光染料反应制备用于标记巨噬细胞的探针,并且荧光染料可以是一种用一个或多于一个官能团化学改性的荧光染料。
用官能团改性的荧光染料可以用硫醇(-SH)、胺基(-NH2)、氰基(-CN)、异氰基(-CNO)、硫氰酸酯基(-SCN)、异硫氰酸酯基(-NCS)、二硫化物基团(-SS-)或叠氮化合物基团(-N3)改性。具体地,它可以用异硫氰酸酯基改性。
改性的荧光染料通过与卡拉胶衍生物的巯基反应形成稳定的硫脲,可以制备具有稳定结构的用于标记巨噬细胞的探针。
通过上述方法由卡拉胶衍生物与一种或更多种荧光染料或放射性同位素结合形成的用于标记巨噬细胞的探针可以靶向/标记炎症相关的巨噬细胞,特别是M1型巨噬细胞,用于活细胞成像和诊断成像。
本公开的另一个方面涉及一种用于制备用于标记巨噬细胞的探针的方法,其包括:
步骤i)通过将具有由化学式1表示的重复单元的卡拉胶与氧化剂反应来制备具有由化学式1和化学式4表示的重复单元的卡拉胶-醛;
步骤ii)通过将步骤i)中制备的卡拉胶-醛与由化学式2或化学式3表示的化合物反应,用化学式3的化合物取代卡拉胶-醛的醛基;
步骤iii)将步骤ii)中制备的取代的卡拉胶衍生物与还原剂反应:以及
步骤iv)将步骤iii)中制备的卡拉胶衍生物与由化学式5表示的叠氮化合物进行无铜点击反应。
因为上文已经描述了包括步骤a)、b)和c)的卡拉胶衍生物的制备过程,包括步骤i)、ii)和iii)的卡拉胶衍生物的制备过程的详细描述将被省略。
化学式1
化学式2
化学式3
化学式4
在以上化学式中,R1至R5各自独立地选自-H、-OH、-CH3、-CH2OH、-COOH和-OSO3 -中的任一个,n和m各自是1至10000的整数,并且o是1至10的整数。
化学式5
在化学式5中,A选自Cy3、Cy5、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基罗丹明异硫氰酸(RITC)、Alexa、4,4,-二氟-4-硼-3a、4a-二氮杂-s-茚满(BODIPY)、德克萨斯红、NOTA和生物素、C-11、F-18、Ga-67、Ga-68、Cu-64、I-123、I-124、I-125、Zr-89、In-111、Tc-99m、Y-90、Re-186、Re-188、Lu-177、Ac-225、At-211和I-131中的任一种。
具体地,通过卡拉胶衍生物与用荧光染料或放射性同位素标记的叠氮化合物(化学式5)进行无铜点击反应,可以快速制备用于标记巨噬细胞的探针且放射化学产率高。
更具体地,由于制备的卡拉胶衍生物含有由化学式3表示的二苯并环辛炔(DBCO),因此与由化学式5表示的含叠氮基(-N3)化合物的无铜点击反应可在短时间内进行且产率高。因此,只要它是被二苯并环辛炔化合物(化学式3)取代的一种,对卡拉胶衍生物没有特别限制,并且通过使用本公开的荧光染料或放射性同位素标记的叠氮化合物来容易地结合放射性同位素或荧光染料,可以制备用于标记巨噬细胞的探针。
可以根据任何已知的合成方法合成荧光染料或放射性同位素标记的叠氮化合物,没有特别限制。
此外,只要使用本公开的用荧光染料或放射性同位素标记的叠氮化合物(化学式5)可以发生无铜点击反应,本公开步骤iv)中使用的本公开的卡拉胶衍生物不受特别限制。具体地,可以使用含有二苯并环辛炔的卡拉胶衍生物。
通过将荧光染料或放射性同位素标记的叠氮化合物与二苯并环辛炔取代的卡拉胶衍生物进行无铜点击反应,得到结合/共轭荧光染料或放射性同位素的卡拉胶衍生物(用于标记巨噬细胞的探针)。
在另一个方面中,本公开提供了一种用于提供关于巨噬细胞位置的信息的方法,其包括将用于标记巨噬细胞的探针施于分离的生物样品并识别产生选自颜色、近红外荧光、辐射及其组合的信号的位置的步骤。
在本公开中,术语“对象”是指由于炎症而发生炎症相关的症状和病变的活体,可以向其施用本公开的用于标记巨噬细胞的探针或试剂盒。
当本公开提供的用于标记巨噬细胞的探针施于活体内后,其可以与体内炎症相关的巨噬细胞,特别是M1型巨噬细胞结合,并且通过颜色、近红外荧光、辐射或其组合标记巨噬细胞的位置。由于通过检测标记可以实时检测巨噬细胞的位置、大小等。因此,可以诊断与炎症相关的疾病,并且可以监测炎症的状态和进展。
此外,由于与其他与染料结合的复合物相比,本公开用于标记巨噬细胞的探针可以选择性地标记巨噬细胞,而不管新陈代谢,因此它可以不受患者状况的限制,容易地检测巨噬细胞的位置,甚至在脑和心脏的病灶中。
发明实施例
在下文中,将通过实施例等更详细地描述本公开。然而,不应理解为通过实施例等减少或限制本公开的范围和内容。此外,显然对于没有具体给出实验结果的事项,具有常识的人员可以基于包括实施例的本公开的内容容易地实施本公开,并且这种变化和修改属于所附权利要求的范围。
以下给出的实验结果仅为实施例和对比例的代表性的实验结果。
制备例1卡拉胶衍生物的合成
反应方案1
反应方案1显示了通过氧化、取代和还原卡拉胶(CGN)合成作为巨噬细胞的CD80配体的卡拉胶衍生物的过程。
在合成之前,使用10mg/mL CGN溶液(以DW计)研究物理性质(溶解度)。通过动态光散射(DLS)确认聚集。
基于物理性质,制备10mL 2.5mg/mL的CGN水溶液。2mL CGN水溶液用于反应。在CGN水溶液中添加0.02毫摩尔(4.3mg)作为氧化剂的过碘酸钠后,通过在室温下氧化30分钟,打开卡拉胶的环结构来制备卡拉胶-醛。使用PD-10柱用蒸馏水过滤卡拉胶-醛。然后,向经过滤的溶液中添加0.02毫摩尔(1.5mg)半胱胺后,通过在室温下反应1小时,合成卡拉胶-醛的醛基被半胱胺基取代的卡拉胶。然后,在半胱胺基取代的卡拉胶中添加0.02毫摩尔(0.75mg)作为还原剂的硼氢化钠后,通过在冰浴中反应1小时,合成卡拉胶衍生物。通过加入浓盐酸中和卡拉胶衍生物后,使用蒸馏水过滤PD-10柱。以等摩尔量使用化合物。
制备例2由λ-卡拉胶合成卡拉胶衍生物
反应方案2
反应方案2显示了通过氧化、取代和还原λ-卡拉胶合成作为巨噬细胞的CD80配体的卡拉胶衍生物的过程。λ-卡拉胶是每两个糖单元具有三个硫酸基的聚合物。
将NaIO4(3.9mg,0.018毫摩尔)和H2SO4(2μL)的混合物添加到5mLλ-卡拉胶溶液(7mg/mL)中。在室温下搅拌反应混合物30分钟后,使用PD-10柱(SephadexTM G-25Medium,GEHealthcare Bio-Sciences Corp,NJ,USA)纯化反应混合物。通过连续回收1mL的馏分3次来制备卡拉胶-醛。通过将卡拉胶-醛溶解在蒸馏水中来制备2.5mL卡拉胶-醛溶液。然后基于包含在溶液中氧化的λ-卡拉胶,混合过量的100摩尔当量半胱胺(2.1mg,0.018毫摩尔)。在室温下搅拌混合物60分钟后,添加硼氢化钠(NaBH4,0.687mg,0.018毫摩尔)。通过在冰浴中搅拌反应混合物60分钟来合成卡拉胶衍生物。
制备例3 DBCO-卡拉胶衍生物的合成
不同于制备例1和制备例2的用于制备卡拉胶衍生物的方法,用于制备用于标记巨噬细胞的探针的卡拉胶衍生物可以通过点击反应来制备。
除了添加由化学式3表示的化合物代替半胱胺之外,以与制备例1中相同的方式合成DBCO-卡拉胶衍生物。
化学式3
在制备例3中,使用由化学式3表示的化合物,o为1。
实施例1用于标记巨噬细胞的Tc-99m标记的探针
反应方案3
反应方案3显示了制备如制备例1中所述的卡拉胶衍生物(也称为改性的卡拉胶)并用Tc-99m标记卡拉胶衍生物以合成用于标记巨噬细胞的探针的过程。
首先,制备2.5mg/mL SnCl2溶液,并且制备2.5mg/mL制备例1中合成的卡拉胶衍生物溶液。为了防止胶体现象,使用0.1M HCl作为溶剂。在制备例1中合成的200μL卡拉胶衍生物溶液中加入SnCl2溶液(10μL)后,加入99mTc(20μL,盐水中140μCi)并涡旋混合溶液。在室温下反应20分钟后,使用盐水和柠檬酸的混合物作为洗脱液进行放射性薄层色谱法(radio-TLC)。反应进行1小时(最多2小时)。此外,通过向洗脱液中加入柠檬酸盐、盐水和丙酮来进行层析。
实施例2用于标记巨噬细胞的RITC标记的探针
反应方案4
反应方案4显示了用RITC标记制备例2中合成的卡拉胶衍生物的过程。为了用RITC标记卡拉胶衍生物(制备于制备例1和制备例2中),必须使用异硫氰酸酯改性的RITC。也就是说,通过卡拉胶衍生物的巯基(硫醇基)与RITC的异硫氰酸酯反应以生成稳定的硫脲的机制,制备一种用于标记巨噬细胞的探针。将具体描述合成过程。
通过将制备例2中合成的卡拉胶衍生物与碳酸钠缓冲液(pH=9.5)和scn-RITC(1mg,0.0018毫摩尔)一起搅拌,反应过夜,然后用PBS纯化,来制备用于标记巨噬细胞的RITC标记的探针。使用nano-drops(测试例2)研究用于标记巨噬细胞的RITC标记的探针的RITC浓度。
实施例3通过点击化学反应制备的用于标记巨噬细胞的探针
将7nmol(1mg)制备例3中制备的DBCO卡拉胶衍生物和70nmol(0.02mg)由化学式5表示的叠氮化合物(购自Click Chemistry Tools)溶于0.1mL蒸馏水中后,通过进行无铜点击化学反应,可以容易获得引入荧光染料或放射性同位素的用于标记巨噬细胞的探针。在该实施例中,使用由化学式5表示的叠氮化合物,A是Cy3或NOTA。
化学式5
当如实施例1和实施例2中引入同位素或荧光染料时,根据目的必须分开制备卡拉胶衍生物。然而,当通过点击化学反应制备用于标记巨噬细胞的探针时,通过使用制备例3的卡拉胶衍生物不仅可以引入同位素,还可以引入荧光染料。
测试例1实施例1中制备的用于标记巨噬细胞的探针的标记效率的分析
研究99mTc标记效率,以确认实施例1中制备的用于标记巨噬细胞的探针的合成结果。
图1显示了瞬时薄层色谱(iTLC)的结果以确认实施例1中制备的用于标记巨噬细胞的Tc-99m标记的探针的合成。使用柠檬酸、盐水和丙酮作为洗脱液,且标记效率>90%。
如图1所示,当使用柠檬酸、盐水和丙酮进行瞬时薄层色谱(iTLC)-硅胶(SC)5分钟时(游离:游离形式的99mTc),标记效率>90%。可以看出由于表示存在游离形式的99mTc的峰几乎消失,90%或大于90%的99mTc与卡拉胶衍生物结合。
测试例2实施例2中制备的用于标记巨噬细胞的探针的分析
研究RITC标记效率,以确认实施例2中制备的用于标记巨噬细胞的探针的合成结果。由于没有明显观察到峰,因此使用PD-10柱计算效率。
图2显示了根据RITC浓度(1mg/mL至0.01mg/mL)的UV校准曲线,且图3显示了实施例2中制备的用于标记巨噬细胞的RITC标记的探针的紫外吸光度。
在nano-drop溶液后(其中RITC稀释至1mg/mL至0.01mg/mL的浓度),通过测量紫外吸光度获得图2的校准曲线,以证实通过RITC与卡拉胶衍生物的结合来制备用于标记巨噬细胞的探针。通过测量实施例2中制备的用于标记巨噬细胞的探针的紫外吸光度的结果并将结果与图2的校准曲线拟合,由于实施例2的用于标记巨噬细胞的探针中的RITC浓度为0.2mg/mL,证实了RITC与卡拉胶衍生物结合。
测试例3实施例2中制备的用于标记巨噬细胞的探针的MALDI-TOF/TOF MS分析
进行MALDI-TOF/TOF MS分析以确定实施例2中制备的用于标记巨噬细胞的RITC标记的探针中卡拉胶缀合的半胱胺(制备例2的卡拉胶衍生物)和RITC单元的数量。
首先,将一部分样品溶液(10μL)与α-氰基-4-羟基肉桂酸饱和溶液(在乙腈和含有0.1%TFA的水(1:1,v/v)的混合物中的CHCA)混合后,将1μL混合溶液点在MALDI板上,然后在室温下完全干燥。然后,使用质量分析器分析该板,并收集每个点的光谱。以线性模式进行测量,加速电压为25kV。用337nm氮激光器处理点。每次扫描拍摄20次激光器照片,且总共进行125次扫描。实施例2中制备的用于标记巨噬细胞的探针(即改性的卡拉胶化合物)和λ-卡拉胶(图4)的平均分子量通过对2500次激光器照片的结果求平均值来计算。结果如表1所示。
图5显示了λ-卡拉胶、制备例2的卡拉胶衍生物和实施例2的用于标记巨噬细胞的RITC标记的探针的MALDI-TOF结果,图6显示了λ-卡拉胶的MALDI-TOF原始数据,图7显示了制备例2的卡拉胶衍生物的MALDI-TOF原始数据,以及图8显示了实施例2的用于标记巨噬细胞的RITC标记的探针的MALDI-TOF原始数据。
表1
根据表1和图5至图8,卡拉胶单元的分子量为579.5克/摩尔,并且由29至30个单元化合物组成的卡拉胶聚合物的分子量为16928.5克/摩尔。可以看出,由于每个卡拉胶聚合物平均连接了5.94个半胱胺(77.15克/摩尔),制备例2的卡拉胶衍生物(半胱胺-卡拉胶)的分子量增加至17387.0克/摩尔。
由于每个卡拉胶-半胱胺聚合物平均连接1.4个RITC-SCN(389.38克/摩尔),实施例2中制备的用于标记巨噬细胞的RITC标记的探针的分子量增加至17935.5克/摩尔。
也就是说,具体地,根据本公开的用于标记巨噬细胞的探针平均具有每29至30个λ-卡拉胶1至20个半胱胺改性的卡拉胶单元并且平均具有1至10个RITC标记的卡拉胶单元。更具体地,它平均具有每29至30个λ-卡拉胶单元5至10个半胱胺改性的卡拉胶单元,并且具有1至5个RITC标记的卡拉胶单元。
测试例4实施例2中制备的用于标记巨噬细胞的探针体外靶向活性的分析
研究实施例2中制备的用于标记巨噬细胞的探针是否真正标记了巨噬细胞。评估如下进行。
首先,将Raw264.7细胞分配到8孔载玻片上,每孔约5000个细胞。用PBS缓冲液清洗后,通过用冰甲醇(MeOH)处理15分钟来固定细胞。然后,用PBS缓冲液再次清洗后,用在各种浓度或标准RITC溶液(标准品)下实施例2中制备的用于标记巨噬细胞的探针(RITC-CGN)处理每孔30分钟。反应完成后,每孔用PBS缓冲液清洗150秒,然后用荧光显微镜观察。
将实施例2中制备的用于标记巨噬细胞的探针(RITC-CGN)稀释至0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL和100μg/mL的浓度,如图9所示。图中1000μg/mL表示浓度为1000μg/mL的RITC标准溶液,其用PBS缓冲液(pH 9.5,0.1M碳酸钠缓冲液)稀释。Ctrl表示未经处理的RaW264.7细胞。
图9显示了用在各种浓度或标准RITC溶液下实施例2制备的用于标记巨噬细胞的探针(RITC-CGN)处理后获得的活化的白细胞(Raw264.7)的荧光显微图像。
如图9所示,证实了实施例2的用于标记巨噬细胞的探针(RITC-CGN)在体外对白细胞的非特异性附着以浓度依赖性方式增加。
具体地,对于正常细胞,因为细胞表面存在许多胺基(NH2),RITC可以容易地附着。然而,由于本公开的用于标记巨噬细胞的探针(RITC-CGN)具有化学稳定的硫脲基而不是胺基,因此RITC不再附着于非靶细胞的膜。此外,由于根据本公开的用于标记巨噬细胞的探针含有卡拉胶衍生物,卡拉胶衍生物作为靶巨噬细胞的CD80配体,因此本公开的用于标记巨噬细胞的探针仅标记细胞膜表面上具有CD80的巨噬细胞,并且正常细胞不被本公开的用于标记巨噬细胞的探针标记。
测试例5实施例2制备的用于标记巨噬细胞的探针对M1巨噬细胞体外靶向活性的分析
1)测试组(0.001μg/mL脂多糖)
将Raw264.7细胞分配到8孔载玻片上,每孔约5000个细胞。培养1至2天,然后每孔加入0.001μg/mL LPS(炎症诱导物质)溶液后,培养细胞24小时。通过在含有10%FBS和1%抗生素-抗真菌溶液的RPMI培养基中混合制备LPS溶液,并添加最终体积200μL。
然后,从各孔中除去培养基并用PBS缓冲溶液清洗后,用冰甲醇处理15分钟来固定细胞。然后用PBS缓冲溶液清洗细胞一次5分钟,然后用阻断抗体处理1小时。
抗体分别以0.025μg/μL、0.005μg/μL或0.01μg/μL处理TLR4(Abcam,ab47093)和CD80(Novus,B7-1,AF740)。
然后,用PBS缓冲液清洗每孔5分钟后,处理实施例2中制备的用于标记巨噬细胞的探针(RITC-CGN,0.5mg/mL,基于卡拉胶衍生物)20分钟。然后用PBS清洗两次3分钟且倒入100μL至200μL的PBS缓冲液后,用荧光显微镜观察孔。
2)阴性对照组(无脂多糖)
为了研究未发生炎症的细胞(阴性对照组)是否展现靶向活性,以与1)中相同的方式处理无LPS处理的Raw264.7细胞(无脂多糖)。
然后,用PBS缓冲液清洗每孔5分钟后,处理实施例2中制备的用于标记巨噬细胞的探针(RITC-CGN,0.5mg/mL,基于卡拉胶衍生物)20分钟。然后用PBS清洗两次3分钟且倒入100μL至200μL的PBS缓冲液后,用荧光显微镜观察孔。
3)实验结果
图10显示了用CD80抗体处理的测试组和阴性对照组的荧光显微图像,以及图11显示了用TPR4抗体处理的测试组和阴性对照组的荧光显微图像。
如图10和图11所示,在体外实验中,通过LPS(脂多糖)处理诱导巨噬细胞分化为M1型巨噬细胞后,用受体特异性CD80阻断抗体处理M1巨噬细胞,然后添加实施例2中制备的用于标记巨噬细胞的探针。结果是由于M1型巨噬细胞表面上存在的CD80被阻断,用实施例2中制备的用于标记巨噬细胞的探针(CGN-RITC)标记的细胞的数量(亮度)逐渐降低。相反,当存在于M1型巨噬细胞表面上的TLR4被阻断时,标记的细胞的数量没有变化。由此可以看出,根据本公开的用于标记巨噬细胞的探针(实施例2)与M1巨噬细胞的CD80特异性结合。
测试例6实施例2中制备的用于标记巨噬细胞的探针对M1巨噬细胞(M1极化的THP-1细胞)靶向活性的分析
1)M1极化的THP-1细胞的制备
首先,诱导THP-1细胞分化。具体地,将THP-1细胞分配到12孔板上,每孔500000个细胞。然后,用PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)溶液(最终浓度:100ng/mL)处理每孔后,培养细胞72小时。通过在含有10%FBS和1%抗生素-抗真菌溶液的RPMI培养基中混合制备PMA溶液,并添加最终体积1000μL。PMA充当诱导THP-1细胞从单核细胞分化为巨噬细胞的物质。
随后,诱导M1巨噬细胞极化为M1极化的THP-1细胞。具体地,从每孔中完全除去含有分化的THP-1细胞的培养基后,用PBS缓冲液清洗孔1次。然后,用脂多糖(LPS)(最终浓度:1000ng/mL)和干扰素-γ(IFNγ)(最终浓度:20ng/mL)处理每个孔后,培养细胞24小时。在补充有10%FBS和1%抗生素-抗真菌溶液的RPMI 1640培养基中混合后,施加LPS和IFNγ,最终体积为1000μL。
然后,制备M1极化的THP-1细胞。具体地,从含有M1极化的THP-1细胞的培养基中仅收集M1极化的THP-1细胞,然后转移至1.7毫升的管。将管以12000rpm离心1分钟,仅除去沉淀物以外的上清液。通过向含有剩余沉淀物的管中加入1mL PBS缓冲溶液清洗细胞后,通过离心M1极化的THP-1细胞(以沉淀物形式)与上清液分离,且通过除去上清液仅回收M1极化的THP-1细胞。
2)实验
为了研究本公开的用于标记巨噬细胞的RITC标记的探针是否特异性作用于M1型巨噬细胞,加入每个样品后通过流式细胞仪观察回收的M1极化的THP-1细胞。
没有东西处理(未染色)的组制备为对照组,并且用20μL/mL M1巨噬细胞靶向抗体FITC-CD197处理的CD197染色制备为对比组。用实施例2中制备的用于标记巨噬细胞的RITC标记的探针(RITC-CGN)以0.5mg/mL处理的CGN染色组制备为第一测试组,并且用RITC-CGN(实施例2)和FTIC-CD197处理的CD197+CGN染色组制备为第二测试组。加入各样品并在4℃反应30分钟后,加入500μL PBS缓冲液,并且通过流式细胞仪观察结果。
3)实验结果
图13显示了通过将M1巨噬细胞靶向抗体FITC-CD197、实施例2中制备的用于标记巨噬细胞的RITC标记的探针(RITC-CGN)或其混合物添加到M1极化的THP-1细胞来制备每组并通过流式细胞仪分析的结果。
M1巨噬细胞的特征可以从图13所示的未染色组鉴定出来。比较对比组、第一测试组和第二测试组的细胞分布与未染色组的细胞分布。
对比组(CD197染色)的细胞分布向Q1和Q2移动(未染色:0.985%,CD197染色:46.92%)。并且,观察到第一测试组(CGN染色)的细胞分布向Q2和Q3移动(未染色:0.415%,CGN染色:71.1%)。
观察到第二测试组(CD197+CGN染色)的细胞分布(其中M1巨噬细胞靶向抗体FITC-CD197与实施例2中制备的用于标记M1巨噬细胞的探针(RITC-CGN)混合)向Q2移动(CD197+CGN染色:31.3%)。
通过该实验,证实了实施例2中制备的用于标记M1巨噬细胞的探针(RITC-CGN)与M1巨噬细胞特异性反应。
Claims (21)
3.根据权利要求1所述的卡拉胶衍生物,其中卡拉胶衍生物充当巨噬细胞的CD80的配体。
4.根据权利要求3所述的卡拉胶衍生物,其中巨噬细胞是M1型巨噬细胞。
6.根据权利要求5所述的用于制备卡拉胶衍生物的方法,其中氧化剂是过碘酸钠。
7.根据权利要求5所述的用于制备卡拉胶衍生物的方法,其中每单位具有由化学式1表示的重复单元的卡拉胶添加1摩尔当量至10摩尔当量的氧化剂。
8.根据权利要求5所述的用于制备卡拉胶衍生物的方法,其中步骤1)在10℃至30℃下进行1分钟至180分钟。
9.根据权利要求5所述的用于制备卡拉胶衍生物的方法,其中在步骤2)中,进行反应使得每个卡拉胶-醛分子反应1个至10个由化学式2或化学式3表示的化合物分子。
10.根据权利要求5所述的用于制备卡拉胶衍生物的方法,其中在步骤3)中,每单位具有由化学式1表示的重复单元的卡拉胶添加1摩尔当量至100摩尔当量的还原剂。
11.根据权利要求5所述的用于制备卡拉胶衍生物的方法,其中步骤3)在-10℃至10℃下进行1分钟至240分钟。
12.根据权利要求5所述的用于制备卡拉胶衍生物的方法,其中还原剂为氰基硼氢化钠(NaCNBH3)或硼氢化钠。
13.一种用于标记巨噬细胞的探针,其中荧光染料或放射性同位素与根据权利要求1所述的卡拉胶衍生物结合。
14.根据权利要求13所述的用于标记巨噬细胞的探针,其中荧光染料选自Cy3、Cy5、异硫氰酸荧光素、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、Alexa、BODIPY、德克萨斯红、NOTA和生物素中的一种或多于一种。
15.根据权利要求13所述的用于标记巨噬细胞的探针,其中放射性同位素选自C-11、F-18、Ga-67、Ga-68、Cu-64、I-123、I-124、I-125、Zr-89、In-111、Tc-99m、Y-90、Re-186、Re-188、Lu-177、Ac-225、At-211和I-131中的一种或多于一种。
16.根据权利要求13所述的用于标记巨噬细胞的探针,其中巨噬细胞是由炎症诱导因子获得的。
17.根据权利要求13所述的用于标记巨噬细胞的探针,其中用于标记巨噬细胞的探针特异性标记M1型巨噬细胞。
18.一种用于制备用于标记巨噬细胞的探针的方法,其包括:
步骤a)通过将具有由化学式1表示的重复单元的卡拉胶与氧化剂反应来制备具有由化学式1和化学式4表示的重复单元的卡拉胶-醛;
步骤b)通过将步骤a)中制备的卡拉胶-醛与由化学式2表示的化合物反应,用化学式2的化合物取代卡拉胶-醛的醛基;
步骤c)将步骤b)中制备的经取代的卡拉胶衍生物与还原剂反应;以及
步骤d)使步骤c)中制备的卡拉胶衍生物与放射性同位素或异硫氰酸酯改性的荧光染料反应:
化学式1
化学式2
化学式4
其中R1至R5各自独立地选自-H、-OH、-CH3、-CH2OH、-COOH和-OSO3 -中的任一个,n和m各自是1至10000的整数,并且o是1至10的整数。
19.一种用于制备用于标记巨噬细胞的探针的方法,其包括:
步骤i)通过将具有由化学式1表示的重复单元的卡拉胶与氧化剂反应来制备具有由化学式1和化学式4表示的重复单元的卡拉胶-醛;
步骤ii)通过将步骤i)中制备的卡拉胶-醛与由化学式3表示的化合物反应,用化学式3的化合物取代卡拉胶-醛的醛基;
步骤iii)将步骤ii)中制备的经取代的卡拉胶衍生物与还原剂反应:以及
步骤iv)使步骤iii)中制备的卡拉胶衍生物与由化学式5表示的叠氮化合物进行无铜点击反应:
化学式1
化学式3
化学式4
其中R1至R5各自独立地选自-H、-OH、-CH3、-CH2OH、-COOH和-OSO3 -中的任一个,n和m各自是1至10000的整数,并且o是1至10的整数;
化学式5
其中A选自Cy3、Cy5、异硫氰酸荧光素、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、Alexa、BODIPY、德克萨斯红、NOTA、生物素、C-11、F-18、Ga-67、Ga-68、Cu-64、I-123、I-124、I-125、Zr-89、In-111、Tc-99m、Y-90、Re-186、Re-188、Lu-177、Ac-225、At-211和I-131中的任一种。
20.一种用于提供关于巨噬细胞位置的信息的方法,其通过向分离的生物样品施用包含根据权利要求13所述的用于标记巨噬细胞的探针的组合物来实现。
21.根据权利要求20所述的方法,其中巨噬细胞是炎症相关的M1型巨噬细胞。
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