WO2023191549A1 - M1 대식세포 표지용 형광 프로브 및 이를 이용한 m1 대식세포 모니터링 시스템 - Google Patents
M1 대식세포 표지용 형광 프로브 및 이를 이용한 m1 대식세포 모니터링 시스템 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2023191549A1 WO2023191549A1 PCT/KR2023/004294 KR2023004294W WO2023191549A1 WO 2023191549 A1 WO2023191549 A1 WO 2023191549A1 KR 2023004294 W KR2023004294 W KR 2023004294W WO 2023191549 A1 WO2023191549 A1 WO 2023191549A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- formula
- independently
- macrophages
- alkyl
- integer
- Prior art date
Links
- 210000003690 classically activated macrophage Anatomy 0.000 title claims abstract description 86
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 238000002372 labelling Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 41
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 150000001719 carbohydrate derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 9
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 39
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 31
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 31
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims description 17
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 15
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 claims description 14
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 11
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 150000002367 halogens Chemical group 0.000 claims description 11
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 11
- 108091006296 SLC2A1 Proteins 0.000 claims description 10
- 108091052347 Glucose transporter family Proteins 0.000 claims description 8
- 102000042092 Glucose transporter family Human genes 0.000 claims description 7
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 7
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 6
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 4
- -1 -CH 3 Chemical compound 0.000 claims 1
- 102000018711 Facilitative Glucose Transport Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 102000058063 Glucose Transporter Type 1 Human genes 0.000 claims 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 abstract description 6
- 102100023536 Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 1 Human genes 0.000 description 15
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 13
- 210000004322 M2 macrophage Anatomy 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 101000906283 Homo sapiens Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 1 Proteins 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 7
- QUTFFEUUGHUPQC-ILWYWAAHSA-N (2r,3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxy-2-[(4-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-7-yl)amino]hexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C2=NON=C12 QUTFFEUUGHUPQC-ILWYWAAHSA-N 0.000 description 5
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 3
- 206010023232 Joint swelling Diseases 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-ZZWDRFIYSA-N L-glucose Chemical compound OC[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-ZZWDRFIYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 3
- JVHIPYJQMFNCEK-UHFFFAOYSA-N cytochalasin Natural products N1C(=O)C2(C(C=CC(C)CC(C)CC=C3)OC(C)=O)C3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 JVHIPYJQMFNCEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMAODHOXRBLOQO-UHFFFAOYSA-N cytochalasin-A Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(=O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 ZMAODHOXRBLOQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 2
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N Naphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940124639 Selective inhibitor Drugs 0.000 description 2
- MWPLVEDNUUSJAV-UHFFFAOYSA-N anthracene Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3C=C21 MWPLVEDNUUSJAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WDECIBYCCFPHNR-UHFFFAOYSA-N chrysene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=C3C4=CC=CC=C4C=CC3=C21 WDECIBYCCFPHNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N phenanthrene Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=CC2=C1 YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGQPRVWTFNBUHA-UHFFFAOYSA-N 4-[[(4-tert-butylphenyl)sulfonylamino]methyl]-n-pyridin-3-ylbenzamide Chemical compound C1=CC(C(C)(C)C)=CC=C1S(=O)(=O)NCC1=CC=C(C(=O)NC=2C=NC=CC=2)C=C1 NGQPRVWTFNBUHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010003267 Arthritis reactive Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000053028 CD36 Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010045374 CD36 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 206010012434 Dermatitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- 206010012442 Dermatitis contact Diseases 0.000 description 1
- 102000000476 Fatty Acid Transport Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010055870 Fatty Acid Transport Proteins Proteins 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007821 HATU Substances 0.000 description 1
- 208000003456 Juvenile Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 206010059176 Juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 description 1
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- FHNINJWBTRXEBC-UHFFFAOYSA-N Sudan III Chemical compound OC1=CC=C2C=CC=CC2=C1N=NC(C=C1)=CC=C1N=NC1=CC=CC=C1 FHNINJWBTRXEBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SLGBZMMZGDRARJ-UHFFFAOYSA-N Triphenylene Natural products C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C3=CC=CC=C3C2=C1 SLGBZMMZGDRARJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006536 aerobic glycolysis Effects 0.000 description 1
- 208000002029 allergic contact dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 150000001449 anionic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N diphenyl Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RMBPEFMHABBEKP-UHFFFAOYSA-N fluorene Chemical compound C1=CC=C2C3=C[CH]C=CC3=CC2=C1 RMBPEFMHABBEKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 150000002256 galaktoses Chemical class 0.000 description 1
- 150000002303 glucose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 230000037417 hyperactivation Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910001412 inorganic anion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 201000002215 juvenile rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 150000002703 mannose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- NIHNNTQXNPWCJQ-UHFFFAOYSA-N o-biphenylenemethane Natural products C1=CC=C2CC3=CC=CC=C3C2=C1 NIHNNTQXNPWCJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002891 organic anions Chemical class 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 208000002574 reactive arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 125000003003 spiro group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-M triflate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000005580 triphenylene group Chemical group 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
Definitions
- the present disclosure relates to a fluorescent probe for labeling M1 macrophages and an M1 macrophage monitoring system using the same.
- Macrophages are important immune cells and control the immune response by protecting our body through cytokine secretion and binding to other immune cells.
- a notable characteristic of macrophages is their plasticity: unactivated macrophages (M0) migrate from circulating monocytes to tissues to initiate an immune response and then polarize into two representative types, M1 and M2, depending on the environment. . Macrophages are generally classified into two representative polarization states: M1 (pro-inflammatory) and M2 (anti-inflammatory). Considering the plasticity of macrophages, it is very important to develop fluorescent probes that can detect specific subpopulations of macrophages.
- M1 macrophages are characterized by producing pro-inflammatory cytokines and exhibiting bactericidal activity.
- persistent hyperactivation of the pro-inflammatory function of M1 macrophages can lead to chronic inflammation that leads to autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis (Funes, S.C., Rios, M., Escobar-Vera, J. & Kalergis, A. M. Implications of macrophage polarization in autoimmunity. Immunology 154, 186-195 (2016).
- One embodiment seeks to provide a novel compound containing a carbohydrate derivative and a fluorophore.
- Another embodiment seeks to provide a fluorescent probe for labeling M1 macrophages containing the above compound.
- Another embodiment seeks to provide a composition for visualizing M1 macrophages and a visualization kit including the fluorescent probe according to the above embodiment.
- Another embodiment seeks to provide an M1 macrophage monitoring system including the fluorescent probe according to the above embodiment.
- Another embodiment is intended to provide a method of providing information on M1 macrophages by administering a composition containing a fluorescent probe according to the above embodiment to a biological sample.
- Another embodiment is intended to provide a method of providing information necessary for diagnosis of an inflammatory disease using the fluorescent probe according to the above embodiment.
- One embodiment provides a compound represented by the following formula (1) or a hydrate thereof.
- A is a carbohydrate derivative represented by Formula 2 or Formula 3 below:
- X is a fluorophore represented by any of the following formulas 4 to 7:
- L 1 is each independently C 1-10 alkylene
- R 1 is each independently hydrogen, C 1-10 alkyl, or ego;
- R 2 is each independently hydrogen, C 1-10 alkyl, or ego;
- R 11 of R 1 and R 2 is each independently C 6-20 aryl, and C 6-20 aryl is one or more substituents selected from the group consisting of halogen, C 1-5 alkyl, and C 1-5 alkoxy. may be substituted; c is each independently an integer from 0 to 10;
- a and b are each independently an integer from 1 to 3;
- L 2 is each independently C 1-10 alkylene
- R 3 and R 4 are each independently hydrogen, halogen, C 1-10 alkyl, or C 1-10 alkoxy;
- R 5 and R 6 are each independently hydrogen or C 1-10 alkyl
- R 7 is each independently hydrogen or C 1-10 alkyl
- d is each independently an integer of 1 to 3;
- e is each independently an integer from 1 to 4;
- f and g are each independently 1 or 2;
- h is each independently an integer from 0 to 10;
- Y - is an anion
- Another embodiment provides a fluorescent probe for labeling M1 macrophages containing the compound according to the above embodiment or a hydrate thereof.
- Another embodiment provides a composition for visualizing M1 macrophages, including the fluorescent probe for labeling M1 macrophages according to the above embodiment.
- Another embodiment provides a kit for visualizing M1 macrophages including a fluorescent probe for labeling M1 macrophages according to the above embodiment.
- Another embodiment provides a method of providing information on M1 macrophages by administering a composition containing a fluorescent probe for labeling M1 macrophages according to the above embodiment to a biological sample.
- Another embodiment is a method of providing information necessary for the diagnosis of an inflammatory disease, comprising contacting a biological sample isolated from a subject with a fluorescent probe for labeling M1 macrophages according to the above embodiment, and obtaining a fluorescent image. provides.
- Another embodiment provides a method of diagnosing an inflammatory disease using the fluorescent probe for labeling M1 macrophages according to the above embodiment.
- the present disclosure relates to a novel compound containing carbohydrate derivatives and fluorophores, a fluorescent probe for labeling M1 macrophages containing the same, and a composition and kit for visualization containing the fluorescent probe.
- the fluorescent probe for labeling M1 macrophages shows excellent selectivity for M1 macrophages, so it can be used for an M1 macrophage monitoring system, a method for providing information on M1 macrophages, and the diagnosis of inflammatory diseases. Applicable to methods of providing necessary information.
- FIG. 1 is a diagram showing the metabolic pathways of M1 and M2 macrophages.
- M1 macrophages upregulate glucose transporters (GLUTs) to take up carbohydrates and drive aerobic glycolysis, while M2 macrophages highly express CD36 to generate energy from OXPHOS and ⁇ -oxidation.
- GLUTs glucose transporters
- Figure 2 is a diagram showing the results of a glucose (D/L-glucose) competition test using CDr17.
- Figure 3 is a diagram showing the results of a test to inhibit CDr17 uptake through GLUT using Cytochalasin B19, a GLUT inhibitor.
- Figure 4 is a diagram showing the results of analyzing the expression levels of 13 known mouse (RAW264.7) GLUT genes in M0, M1, and M2 macrophages.
- Figures 5 and 6 show the mechanism and results for monitoring the inhibitory effect by blocking the function of GLUT1 in M1 macrophages using STF-3121, a selective inhibitor of GLUT1, and then processing CDr17 to analyze the fluorescence intensity.
- Figures 7 and 8 are diagrams showing the mechanism and results for monitoring the inhibitory effect by performing GLUT1 KO (knockout) in M1 macrophages via CRISPR/Cas9 and then processing CDr17 and analyzing the fluorescence intensity of CDr17. .
- Figures 9 and 10 show the results of analyzing fluorescence intensity by treating M0, M1, and M2 macrophages with CDr17 at a concentration of 0.5 ⁇ M.
- CDr17 can kill M0 and M2 macrophages and M1 macrophages even at low concentrations. It was confirmed that it was sufficient to distinguish.
- Figure 11 is a diagram showing the results of analyzing the fluorescence intensity by treating M0, M1, and M2 macrophages with 2-NBDG, a commonly used fluorescent probe, at various concentrations.
- 2-NBDG fluoresces only when the concentration is increased to 100 ⁇ M. Not only was it possible to observe the signal, but it was confirmed that M1 and M2 macrophages could not be clearly distinguished at any concentration.
- Figure 12 is a flowchart of a collagen antibody cocktail test performed to confirm whether CDr17 can be applied to the diagnosis of rheumatoid arthritis.
- Figure 13 is a diagram showing the results of observing joint swelling and redness 10 days after administering LPS to mice by intraperitoneal (ip) injection 3 days after antibody injection (iv) in a collagen antibody cocktail test.
- Figure 14 is a diagram showing the results of analyzing the correlation between CDr17 intensity and joint selling grade, through which it was confirmed that there was a positive correlation between swelling grade and CDr17 intensity.
- Numerical ranges as used herein include lower and upper limits and all values within that range, increments logically derived from the shape and width of the range being defined, all doubly defined values, and upper and lower limits of numerical ranges defined in different forms. Includes all possible combinations of As an example, if the content of the composition is limited to 10% to 80% or 20% to 50%, the numerical range of 10% to 50% or 50% to 80% should also be interpreted as described herein. Unless otherwise specified herein, values outside the numerical range that may occur due to experimental error or rounding of values are also included in the defined numerical range.
- alkylene used herein refers to a straight or branched diradical with a saturated carbon bond, and may be substituted with any substituent.
- alkyl used herein refers to a straight-chain or branched radical with a saturated carbon bond, and may be substituted with any substituent.
- aryl as used herein is not limited to being a bridged ring, a spiro ring, or a fused ring.
- the aryl may be, for example, benzene, naphthalene, fluorene, anthracene, phenanthrene, bibenzene, triphenylene, pyrene, or chrysene.
- each substituent defined herein as “each independently” may be the same or different.
- a number of R 1 may be the same or different from each other.
- One embodiment provides a compound represented by the following formula (1) or a hydrate thereof.
- A is a carbohydrate derivative represented by Formula 2 or Formula 3 below:
- X is a fluorophore represented by any of the following formulas 4 to 7:
- L 1 is each independently C 1-10 alkylene
- R 1 is each independently hydrogen, C 1-10 alkyl, or ego;
- R 2 is each independently hydrogen, C 1-10 alkyl, or ego;
- R 11 of R 1 and R 2 is each independently C 6-20 aryl, and C 6-20 aryl is one or more substituents selected from the group consisting of halogen, C 1-5 alkyl, and C 1-5 alkoxy. may be substituted; c is each independently an integer from 0 to 10;
- a and b are each independently an integer from 1 to 3;
- L 2 is each independently C 1-10 alkylene
- R 3 and R 4 are each independently hydrogen, halogen, C 1-10 alkyl, or C 1-10 alkoxy;
- R 5 and R 6 are each independently hydrogen or C 1-10 alkyl
- R 7 is each independently hydrogen or C 1-10 alkyl
- d is each independently an integer of 1 to 3;
- e is each independently an integer from 1 to 4;
- f and g are each independently 1 or 2;
- h is each independently an integer from 0 to 10;
- Y - is an anion.
- the Y - is not particularly limited as it can be appropriately selected according to the manufacturing method, and can be selected from known organic or inorganic anions without limitation.
- an anion it is not necessarily limited to the above.
- A may be a carbohydrate derivative represented by Formula 2-1, Formula 2-2, Formula 2-3, or Formula 3-1 below.
- Each L 1 is independently C 1-5 alkylene
- R 1 is each independently hydrogen, C 1-5 alkyl or ego;
- R 2 is each independently hydrogen, C 1-5 alkyl or ego;
- R 11 of R 1 and R 2 is each independently C 6-10 aryl, and C 6-10 aryl is one or more substituents selected from the group consisting of halogen, C 1-5 alkyl, and C 1-5 alkoxy. may be substituted; c is each independently an integer from 1 to 5;
- a and b may each independently be an integer of 1 to 3.
- L 1 may each independently be C 1-3 alkylene or -CH 2 CH 2 -.
- R 1 is each independently hydrogen, C 1-3 alkyl, -CH 3 or It may be, and R 11 is C 6 each independently substituted with one or more substituents selected from the group consisting of halogen, C 1-3 alkyl, C 1-3 alkoxy, -CH 3 and -OCH 3 It may be -10 aryl, and c may be 1.
- R 1 and R 2 are each independently hydrogen, -CH 3 , or It can be.
- Formula 4 may be a fluorophore represented by Formula 4-1, Formula 4-2, Formula 4-3, or Formula 4-4:
- Formula 5 may be a fluorophore represented by Formula 5-1:
- Each L 2 is independently C 3-8 alkylene
- R 3 and R 4 are each independently hydrogen or C 1-5 alkyl
- R 5 and R 6 are each independently C 1-5 alkyl
- Each of R 7 is independently C 1-5 alkyl
- the i may each independently be an integer from 0 to 5.
- R 3 and R 4 may be hydrogen.
- R 5 and R 6 may be -CH 3 .
- Formula 6 may be a fluorophore represented by Formula 6-1 or Formula 6-2:
- Formula 7 may be a fluorophore represented by Formula 7-1, Formula 7-2, or Formula 7-3.
- the compound represented by Formula 1 may be a compound selected from the following compound group or a hydrate thereof:
- Another embodiment provides a fluorescent probe for labeling M1 macrophages containing the compound represented by Formula 1 of the above embodiment or a hydrate thereof.
- the fluorescent probe for labeling M1 macrophages targets glucose transporters (GLUTs).
- the fluorescent probe according to one embodiment may target GLUT1, which is significantly expressed in M1 macrophages.
- Compounds according to one embodiment may show differences in selectivity for M1 macrophages depending on the structure of the carbohydrate derivative and fluorophore. Specifically, compounds containing glucose derivatives may show better selectivity compared to galactose derivatives and mannose derivatives. Additionally, among the fluorophores according to Table 2 below, the cy5 group may show superior selectivity compared to the cy3 group.
- the probe according to one embodiment may be processed with a known staining reagent.
- One embodiment provides a composition and/or a visualization kit for visualizing M1 macrophages, including the fluorescent probe for labeling M1 macrophages according to the above embodiment.
- the visualization composition and visualization kit are not necessarily limited to specific uses as long as they are compositions and kits for visualizing M1 macrophages using a fluorescent probe for labeling M1 macrophages according to one embodiment.
- the imaging composition Or it may be an imaging kit.
- the components that can be included in the composition for visualizing M1 macrophages and/or the kit for visualizing M1 macrophages may further include known components since there are no particular restrictions on composition other than the fluorescent probe for labeling M1 macrophages.
- Another embodiment provides an M1 macrophage monitoring system including a fluorescent probe for labeling M1 macrophages and a fatty acid transport protein according to the above embodiment.
- Another embodiment provides a method of providing information on M1 macrophages by administering a composition containing a fluorescent probe for labeling M1 macrophages according to the above embodiment to a biological sample. Specifically, one embodiment provides a method of providing information on the location and amount of M1 macrophages.
- Another embodiment is a method of providing information necessary for the diagnosis of an inflammatory disease, comprising contacting a biological sample isolated from a subject with a fluorescent probe for labeling M1 macrophages according to the above embodiment, and obtaining a fluorescent image. provides.
- the step of obtaining the fluorescence image information regarding the location and amount of M1 macrophages can be obtained, and the step may be a step of obtaining information through the location and/or intensity of fluorescence.
- the inflammatory disease may be, for example, an autoimmune disease
- the autoimmune disease may be, for example, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, psoriasis, peripheral arthritis (particularly psoriatic arthritis, rheumatoid arthritis, reactive arthritis) , systemic juvenile idiopathic arthritis), axial arthritis (especially Bekterev's disease), chronic inflammatory bowel disorders (especially Crohn's disease, ulcerative colitis), atopic dermatitis, or allergic eczema/contact dermatitis.
- the compounds according to the Examples and Reference Examples consist of carbohydrate derivatives shown in Table 1 below and fluorophores shown in Table 2 below, and the specific combinations of carbohydrates and fluorophores of the Example and Reference Example compounds are shown in Table 3. indicated.
- Example 8 the representative manufacturing method of Example 8 is as follows.
- Example and Reference Example compounds can be prepared by referring to the preparation method of the compound of Example 8, and can be prepared by selecting each starting compound instead of glucosamine and cy51 and appropriately adjusting the amount of solvent added.
- a fluorescence intensity heat map was used as follows. First, M1 and M2 macrophages were distinguished from quiescent M0 of the mouse cell line RAW264.7. M0, M1 and M2 macrophages were seeded in 96 well plates and then treated with the compounds. After culturing for 1 hour, images of the cells were taken with an automated fluorescence microscope, the fluorescence intensity of each cell type was quantified, and the selectivity index (SI) of M1 for M0 or M2 macrophages was calculated according to Equation 1 below. The calculations were made and the results were shown in a heatmap (Table 5, Table 6).
- 'F' refers to the average value of fluorescence values obtained from the corresponding macrophages
- ' ⁇ ' refers to the standard deviation value of the fluorescence values obtained from the corresponding macrophages
- the compounds according to the examples showed different activities depending on the type of carbohydrate and fluorophore, but showed significantly better selectivity for M1 macrophages than the compounds of the reference examples. Meanwhile, among the example compounds, Example 8, consisting of carbohydrate B and fluorophore Cy52, showed the most remarkable selectivity, and was named CDr17 (Compound Designation red 17).
- the CDr17 compound of Example 8 was used as follows.
- a glucose competition test was performed as follows. Medium for glucose-free M1 macrophages differentiated from RAW264.7 cells, containing 10% Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum (Gibco) and various concentrations (0 (Cont.), 20, 60 mM) of D/L-glucose. After culturing in medium containing 1% penicillin streptomycin (WELGENE) for 5 minutes, CDr17 (1 ⁇ M) was added. Nuclei were stained with Hoechst33342 (1 ⁇ g/mL), and after 30 minutes, the medium was replaced with fresh medium. Fluorescence microscopy imaging was performed with Operetta High Throughput screening with a 40x objective.
- a GLUT inhibition test was performed using Cytochalasin B19, a common GLUT inhibitor. After incubating various concentrations (0, 0.03, 0.1, 0.3 ⁇ M) of the inhibitor with M1 macrophages for 30 minutes, the cells were treated with CDr17 and the fluorescence intensity was analyzed ( Figure 3). As a result, it was confirmed that cytochalasin B19 blocks the absorption of CDr17 through GLUT in a dose-dependent manner.
- CDr17 acts as a substrate for GLUT like D-glucose.
- GLUT1 KO knockout was performed in M1 macrophages via CRISPR/Cas9 and then treated with 1 ⁇ M CDr17 for 30 minutes to analyze the fluorescence intensity of CDr17.
- Knockout tests were performed using M1 macrophages from RAW264.7 cells, and TrueCutTMCas9 Protein v2 (InvitrogenTM, A36498) and LipofectamineTM CRISPRMAXTM Cas9 Transfection Reagent (InvitrogenTMCMAX00008) were used according to the manufacturer's guidelines.
- sgRNA was purchased and used from Horizon (Target ID, SG-044254-01-0005). Fluorescence intensity analysis showed an 80% decrease in intensity compared to control M1 macrophages ( Figures 7 and 8).
- CDr17 targets GLUT1 in M1 macrophages.
- 2-NBDG a commonly used fluorescent probe
- THP-1 a human macrophage cell line.
- concentration of 0.5 ⁇ M for CDr17 was M0 and M2. It was sufficient to distinguish between macrophages and M1 macrophages (FIGS. 9 and 10).
- 2-NBDG not only enabled the observation of a fluorescence signal only when the concentration was increased up to 100 ⁇ M, but also showed no difference between M1 and M2 at any concentration. Phagocytes could not be clearly distinguished (Figure 11).
- CDr17 realizes excellent selectivity and universality for M1 macrophages.
- Macrophages in rheumatoid arthritis are known to be composed of mostly M1 and a small number of M2.
- CDr17 was tested using the collagen antibody cocktail method (FIG. 12).
- Three days after antibody injection (iv) LPS was administered to mice by intraperitoneal (ip) injection, and joint swelling and redness were observed 10 days later (arrows in FIG. 13).
- In vivo images were collected at various time points (0, 15, 30, 45, and 60 min) after injection of CDr17 (2 mM, 100 ⁇ L) via iv ( Figure 13). As a result, the highest peak occurred after 15 minutes, confirming that inflammatory areas can be distinguished within a short period of time using CDr17.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
본 개시는 탄수화물(carbohydrates) 유도체와 형광단(fluorophores)을 포함하는 신규한 화합물, 이를 포함하는 M1 대식세포 표지용 형광 프로브, 상기 형광 프로브를 포함하는 시각화용 조성물 및 키트에 관한 것이다. 일 구현예에 따른 상기 M1 대식세포 표지용 형광 프로브는 M1 대식세포에 대해 우수한 선택성을 보이므로, 이를 이용하여 M1 대식세포 모니터링 시스템, M1 대식세포에 대한 정보를 제공하는 방법 및 염증성 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 적용 가능하다.
Description
본 개시는 M1 대식세포 표지용 형광 프로브 및 이를 이용한 M1 대식세포 모니터링 시스템에 관한 것이다.
대식세포는 중요한 면역 세포이며 사이토카인 분비 및 다른 면역 세포와의 결합을 통해 우리 몸을 보호함으로써 면역 반응을 제어한다. 대식세포의 두드러진 특징은 가소성(plasticity)으로, 활성화되지 않은 대식세포(M0)는 면역반응을 시작하기 위해 혈액 순환 단핵구로부터 조직으로 이동한 후, 환경에 따라 두가지 대표적인 형태인 M1과 M2로 분극화한다. 대식세포는 일반적으로 다음의 두 가지 대표적인 분극 상태로 분류된다: M1(전염증성, pro-inflammatory), M2(항염증성, anti-inflammatory). 이러한 대식세포의 가소성을 고려할 때 대식세포의 특정 하위 집단을 감지할 수 있는 형광 프로브를 개발하는 것은 매우 중요하다.
M1 대식세포는 염증 촉진성(pro-inflammatory) 사이토카인을 생성하고 살균 활성을 나타내는 것이 특징이다. 그러나 M1 대식세포의 염증 촉진 기능의 지속적인 과활성화는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)과 같은 자가 면역 질환을 발생시키는 만성 염증으로 이어질 수 있다(Funes, S.C., Rios, M., Escobar-Vera, J. & Kalergis, A.M. Implications of macrophage polarization in autoimmunity. Immunology 154, 186-195 (2018).
일 구현예는 탄수화물 유도체 및 형광단을 포함하는 신규한 화합물을 제공하고자 한다.
다른 일 구현예는 상기 화합물을 포함하는 M1 대식세포 표지용 형광 프로브를 제공하고자 한다.
다른 일 구현예는 상기 일 구현예에 따른 형광 프로브를 포함하는 M1 대식세포 시각화용 조성물 및 시각화용 키트를 제공하고자 한다.
다른 일 구현예는 상기 일 구현예에 따른 형광 프로브를 포함하는 M1 대식세포 모니터링 시스템을 제공하고자 한다.
다른 일 구현예는 상기 일 구현예에 따른 형광 프로브를 포함하는 조성물을 생물학적 시료에 투여하여 M1 대식세포에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다.
다른 일 구현예는 상기 일 구현예에 따른 형광 프로브를 이용하여 염증성 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다.
일 구현예는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 수화물을 제공한다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
A는 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 탄수화물 유도체이며:
[화학식 2]
[화학식 3]
X는 하기 화학식 4 내지 화학식 7 중 어느 하나로 표시되는 형광단(fluorophores)이다:
[화학식 4]
[화학식 5]
상기 화학식 4 및 화학식 5에서,
L1은 각각 독립적으로 C1-10알킬렌이고;
R1은 각각 독립적으로 수소, C1-10알킬 또는 
이고;
R2는 각각 독립적으로 수소, C1-10알킬 또는 
이고;
상기 R1 및 R2의 R11은 각각 독립적으로 C6-20아릴이고, 상기 C6-20아릴은 할로겐, C1-5알킬 및 C1-5알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환기가 치환될 수 있고; c는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이고;
a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수이다;
[화학식 6]
[화학식 7]
상기 화학식 6 및 화학식 7에서,
L2는 각각 독립적으로 C1-10알킬렌이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-10알킬 또는 C1-10알콕시이고;
R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소 또는 C1-10알킬이고;
R7은 각각 독립적으로 수소 또는 C1-10알킬이고;
d는 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수이고;
e는 각각 독립적으로 1 내지 4의 정수이고;
f 및 g는 각각 독립적으로 1 또는 2이고;
h는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이고;
Y-는 음이온이다.
다른 일 구현예는 상기 일 구현예에 따른 화합물 또는 이의 수화물을 포함하는 M1 대식세포 표지용 형광 프로브를 제공한다.
다른 일 구현예는 상기 일 구현예에 따른 M1 대식세포 표지용 형광 프로브를 포함하는 M1 대식세포 시각화용 조성물을 제공한다.
다른 일 구현예는 상기 일 구현예에 따른 M1 대식세포 표지용 형광 프로브를 포함하는 M1 대식세포 시각화용 키트를 제공한다.
다른 일 구현예는 상기 일 구현예에 따른 M1 대식세포 표지용 형광 프로브를 포함하는 조성물을 생물학적 시료에 투여하여 M1 대식세포에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
다른 일 구현예는 피검체로부터 분리된 생물학적 시료를 상기 일 구현예에 따른 M1 대식세포 표지용 형광 프로브와 접촉시켜, 형광 이미지를 수득하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
다른 일 구현예는 상기 일 구현예에 따른 M1 대식세포 표지용 형광 프로브를 이용하여 염증성 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
본 개시는 탄수화물(carbohydrates) 유도체와 형광단(fluorophores)을 포함하는 신규한 화합물, 이를 포함하는 M1 대식세포 표지용 형광 프로브, 상기 형광 프로브를 포함하는 시각화용 조성물 및 키트에 관한 것이다. 일 구현예에 따른 상기 M1 대식세포 표지용 형광 프로브는 M1 대식세포에 대해 우수한 선택성을 보이므로, 이를 이용하여 M1 대식세포 모니터링 시스템, M1 대식세포에 대한 정보를 제공하는 방법 및 염증성 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 적용 가능하다.
도 1은 M1 및 M2 대식세포의 대사 경로를 나타낸 도면이다. M1 대식세포는 탄수화물을 흡수하고 호기성 당분해를 작동시키기 위해 포도당 수송체(glucose transpoters, GLUTs)를 상향 조절하는 반면, M2 대식세포는 CD36을 높게 발현하여 OXPHOS 및 β-산화로부터 에너지를 생성한다.
도 2는 CDr17을 이용한 포도당(D/L-글루코스) 경쟁 시험 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 GLUT 억제제인 사이토칼라신 B19(Cytochalasin B19)을 이용하여 GLUT를 통한 CDr17 흡수 억제 시험을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 M0, M1 및 M2 대식세포에서 알려진 13개의 마우스(RAW264.7) GLUT 유전자 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5와 도 6은 M1 대식세포에서 GLUT1의 선택적 억제제인 STF-3121를 이용하여 GLUT1의 기능을 차단한 후 CDr17를 처리하여 형광 강도를 분석함으로써 억제 효과를 모니터링하기 위한 메커니즘 및 그 결과를 나타낸 도면이다.
도 7 및 도 8은 CRISPR/Cas9를 통해 M1 대식세포에서 GLUT1 KO(녹아웃)을 수행한 후 CDr17를 처리한 후 CDr17의 형광 강도를 분석함으로써 억제 효과를 모니터링하기 위한 메커니즘 및 그 결과를 나타낸 도면이다.
도 9 및 도 10은 CDr17을 0.5 μM의 농도로 M0, M1 및 M2 대식세포에 처리하여 형광 강도를 분석한 결과를 나타낸 도면으로, CDr17은 적은 농도로도 M0 및 M2 대식세포와 M1 대식세포를 구별하기에 충분함을 확인하였다.
도 11은 일반적으로 사용되는 형광 프로브인 2-NBDG를 다양한 농도로 M0, M1 및 M2 대식세포에 처리하여 형광 강도를 분석한 결과를 나타낸 도면으로, 2-NBDG는 100 μM까지 농도를 높여야만 형광 신호의 관찰이 가능했을 뿐만 아니라, 어떠한 농도에서도 M1와 M2 대식세포를 명확히 구별할 수 없었음을 확인하였다.
도 12는 CDr17이 류마티스 관절염의 진단에 적용될 수 있는지 확인하기 위하여 수행한 collagen antibody cocktail 시험의 흐름도를 나타낸 도면이다.
도 13은 collagen antibody cocktail 시험에서 항체 주사(iv) 3일 후 마우스에 LPS를 복강내(ip) 주사로 투여한 후, 10일 후 관절 부종 및 발적을 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 14은 CDr17 강도와 관절 부종 등급(joint selling grade)의 상관 관계를 분석한 결과를 나타낸 도면으로, 이를 통해 부종 등급과 CDr17 강도 사이에 양의 상관 관계가 있음을 확인하였다.
본 명세서에 기재된 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으므로, 일 구현예에 따른 기술이 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함한다", "구비한다", "함유한다", 또는 "가진다"는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미하며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 수치 범위는 하한치와 상한치와 그 범위 내에서의 모든 값, 정의되는 범위의 형태와 폭에서 논리적으로 유도되는 증분, 이중 한정된 모든 값 및 서로 다른 형태로 한정된 수치 범위의 상한 및 하한의 모든 가능한 조합을 포함한다. 일 예로써 조성의 함량이 10% 내지 80% 또는 20% 내지 50%으로 한정된 경우 10% 내지 50% 또는 50% 내지 80%의 수치범위도 본 명세서에 기재된 것으로 해석되어야 한다. 본 명세서에서 특별한 정의가 없는 한 실험 오차 또는 값의 반올림으로 인해 발생할 가능성이 있는 수치범위 외의 값 역시 정의된 수치범위에 포함된다.
이하 본 명세서에서 특별한 정의가 없는 한, “약”은 명시된 값의 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 이내의 값으로 고려될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "알킬렌"은 탄소 포화결합의 직쇄 또는 분지쇄의 디라디칼(diradical)을 의미하며, 임의의 치환기로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "알킬"은 탄소 포화결합의 직쇄 또는 분지쇄의 라디칼(radical)을 의미하며, 임의의 치환기로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "아릴"은 다리 걸친(bridged) 고리이거나, 스파이로(spiro) 고리이거나, 융합(fused) 고리인 것에 제한이 없다. 상기 아릴은 예를들면 벤젠, 나프탈렌, 플루오렌, 안트라센, 페난트렌, 바이벤젠, 트라이페닐렌, 피렌 또는 크리센일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "
" 표시는 다른 결합기와 결합이 형성되는 부분을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "
" 표시는 "
" 또는 "
"인 것에 제한이 없음을 의미한다.
본 명세서에서 "각각 독립적으로" 정의된 각 치환기는 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어 각각 독립적인 치환기 (R1)a의 경우, a개의 R1은 서로 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다.
이하, 일 구현예에 따른 신규한 화합물을 구체적으로 설명한다.
일 구현예는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 수화물을 제공한다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
A는 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 탄수화물 유도체이며:
[화학식 2]
[화학식 3]
X는 하기 화학식 4 내지 화학식 7중 어느 하나로 표시되는 형광단(fluorophores)이다:
[화학식 4]
[화학식 5]
상기 화학식 4 및 화학식 5에서,
L1은 각각 독립적으로 C1-10알킬렌이고;
R1은 각각 독립적으로 수소, C1-10알킬 또는 
이고;
R2는 각각 독립적으로 수소, C1-10알킬 또는 
이고;
상기 R1 및 R2의 R11은 각각 독립적으로 C6-20아릴이고, 상기 C6-20아릴은 할로겐, C1-5알킬 및 C1-5알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환기가 치환될 수 있고; c는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이고;
a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수이다;
[화학식 6]
[화학식 7]
상기 화학식 6 및 화학식 7에서,
L2는 각각 독립적으로 C1-10알킬렌이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-10알킬 또는 C1-10알콕시이고;
R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소 또는 C1-10알킬이고;
R7은 각각 독립적으로 수소 또는 C1-10알킬이고;
d는 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수이고;
e는 각각 독립적으로 1 내지 4의 정수이고;
f 및 g는 각각 독립적으로 1 또는 2이고;
h는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이고;
Y-는 음이온이다. 상기 Y-는 제법에 따라 적절히 선택될 수 있으므로 특별히 제한되지 않으며, 공지된 유기 또는 무기 음이온 중에서 제한 없이 선택될 수 있다. 예를 들면 I-, Br-, Cl-, F-, NO3
-, ClO4-, PF6-, TFSI, BAFR, BF4
-, SO3
-, 포름산염(formate), 아세테이트(aceate) 또는 이의 유도체(예를 들면, 트리플루오로아세테이트), 트리플레이트(triflate), 설페이트(sulfate), 포스페이트(phosphate) 등의 1가 음이온일 수 있다. 다만 상기는 음이온의 일 예시일 뿐이므로 반드시 상기에 한정되지 않는다.
일 실시예에서, 상기 A는 하기 화학식 2-1, 화학식 2-2, 화학식 2-3 또는 화학식 3-1로 표시되는 탄수화물 유도체일 수 있다.
[화학식 2-1]
[화학식 2-2]
[화학식 2-3]
[화학식 3-1]
일 실시예에서, 상기 화학식 4 및 화학식 5에서,
상기 L1은 각각 독립적으로 C1-5알킬렌이고;
상기 R1은 각각 독립적으로 수소, C1-5알킬 또는 
이고;
상기 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-5알킬 또는 
이고;
상기 R1 및 R2의 R11은 각각 독립적으로 C6-10아릴이고, 상기 C6-10아릴은 할로겐, C1-5알킬 및 C1-5알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환기가 치환될 수 있고; c는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고;
a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 L1은 각각 독립적으로 C1-3알킬렌 또는 -CH2CH2-일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 R1은 각각 독립적으로 수소, C1-3알킬, -CH3 또는 
일 수 있고, 상기 R11은 각각 독립적으로 할로겐, C1-3알킬, C1-3알콕시, -CH3 및 -OCH3로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환기가 1개 이상 치환된 C6-10아릴일 수 있고, c는 1일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, -CH3, 
또는 
일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 화학식 4는 하기 화학식 4-1, 화학식 4-2, 화학식 4-3 또는 화학식 4-4로 표시되는 형광단일 수 있다:
[화학식 4-1]
[화학식 4-2]
[화학식 4-3]
일 실시예에서, 상기 화학식 5는 하기 화학식 5-1로 표시되는 형광단일 수 있다:
[화학식 5-1]
일 실시예에서, 상기 화학식 6 및 화학식 7에서,
상기 L2는 각각 독립적으로 C3-8알킬렌이고;
상기 R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-5알킬이고;
상기 R5 및 R6은 각각 독립적으로 C1-5알킬이고;
상기 R7은 각각 독립적으로 C1-5알킬이고;
상기 i는 각각 독립적으로 0 내지 5의 정수일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 R3 및 R4는 수소일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 R5 및 R6는 -CH3일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 화학식 6은 하기 화학식 6-1 또는 화학식 6-2로 표시되는 형광단일 수 있다:
[화학식 6-1]
[화학식 6-2]
일 실시예에서, 상기 화학식 7은 하기 화학식 7-1, 화학식 7-2 또는 화학식 7-3으로 표시되는 형광단일 수 있다.
[화학식 7-1]
[화학식 7-2]
[화학식 7-3]
일 실시예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물군으로부터 선택되는 것인, 화합물 또는 이의 수화물일 수 있다:
(1)
;(2)
;(3)
;(4)
;(5)
;(6)
;(7)
;(8)
;(9)
;(10)
;(11)
;(12)
;(13)
;(14)
;(15)
;(16)
;(17)
;(18)
;(19)
;(20)
;(21)
;(22)
;(23)
;(24)
;(25)
;(26)
;(27)
;(28)
;(29)
;(30)
;(31)
;(32)
;(33)
;(34)
;(35)
;(36)
.
다른 일 구현예는 상기 일 구현예의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 수화물을 포함하는 M1 대식세포 표지용 형광 프로브를 제공한다.
일 실시예에 따른 상기 M1 대식세포 표지용 형광 프로브는 포도당 수송체(glucose transpoters, GLUTs)를 표적으로 한다. 일 실시예에 따른 형광 프로브는 M1 대식세포에서 현저히 발현되는 GLUT1을 표적으로 할 수 있다.
일 실시예에 따른 화합물은 탄수화물 유도체 및 형광단의 구조에 따라 M1 대식세포에 대한 선택성에 차이를 보일 수 있다. 구체적으로 갈락토스(galactose) 유도체 및 만노스(mannose) 유도체에 비해 글루코스(glucose) 유도체를 포함하는 화합물이 더 우수한 선택성을 보일 수 있다. 또한 하기 표 2에 따른 형광단 중에서 cy5 그룹이 cy3 그룹에 비해 우수한 선택성을 보일 수 있다.
일 실시예에 따른 상기 프로브는 공지된 염색 시약과 함께 처리될 수 있다.
일 구현예는 상기 일 구현예에 따른 M1 대식세포 표지용 형광 프로브를 포함하는 M1 대식세포의 시각화용 조성물 및/또는 시각화용 키트를 제공한다. 상기 시각화용 조성물 및 시각화용 키트는 일 구현예에 따른 M1 대식세포 표지용 형광 프로브를 이용하여 M1 대식세포를 시각화하기 위한 조성물 및 키트라면 반드시 특정 용도에만 제한되는 것은 아니며, 예를 들면 영상화용 조성물 또는 영상화용 키트일 수 있다. 또한 상기 M1 대식세포의 시각화용 조성물 및/또는 시각화용 키트에 포함될 수 있는 요소에는, M1 대식세포 표지용 형광 프로브 외에는 특별한 구성의 제한이 없으므로 공지된 구성요소를 더 포함할 수 있다.
다른 일 구현예는 상기 일 구현예에 따른 M1 대식세포 표지용 형광 프로브 및 지방산 수송 단백질을 포함하는 M1 대식세포 모니터링 시스템을 제공한다.
다른 일 구현예는 상기 일 구현예에 따른 M1 대식세포 표지용 형광 프로브를 포함하는 조성물을 생물학적 시료에 투여하여 M1 대식세포에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 구체적으로 일 구현예는 M1 대식세포의 위치, 양 등에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
다른 일 구현예는 피검체로부터 분리된 생물학적 시료를 상기 일 구현예에 따른 M1 대식세포 표지용 형광 프로브와 접촉시켜, 형광 이미지를 수득하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 형광 이미지를 수득하는 단계를 통해 M1 대식세포에 대한 위치, 양 등에 관한 정보를 수득할 수 있으며, 상기 단계는 형광의 위치 및/또는 강도를 통해 정보를 수득하는 단계일 수 있다.
일 실시예에서 상기 염증성 질환은 예를 들어 자가 면역 질환일 수 있고, 상기 자가 면역 질환은 예를 들면, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 건선, 말초 관절염 (특히 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 반응성 관절염, 전신 소아 특발성 관절염), 축성 관절염 (특히 베크테레브병), 만성 염증성 장 장애 (특히 크론병, 궤양성 결장염), 아토피성 피부염, 또는 알레르기성 습진/접촉성 피부염일 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 하기에 구체적으로 예시하여 설명한다. 다만, 후술하는 실시예 및 실험예는 일 구현 양태의 일부를 예시하는 것일 뿐이므로, 본 명세서에 기재된 기술이 이에 한정되는 것으로 해석해서는 안된다.
<실시예 1 내지 실시예 36 및 참조예 1 내지 참조예 44>
실시예 및 참조예에 따른 화합물은 하기 표 1의 탄수화물(carbohydrates) 유도체와 하기 표 2의 형광단(fluorophores)으로 구성되며, 실시예 및 참조예 화합물의 구체적인 탄수화물 및 형광단의 조합을 표 3에 나타내었다.
| A | B | C | D | E | F | G | H |
 |
 |
 |
 |
||||
| c1 | c2 | c3 | c4 |
 |
 |
 |
 |
| c5 | c6 | n1 | n2 |
 |
 |
 |
 |
| d1 | d2 | f1 | f2 |
 |
 |
 |
 |
| b1 | b2 | b3 | b4 |
 |
 |
 |
 |
| b5 | b6 | cy31 | |
 |
 |
 |
|
| cy32 | cy51 | ||
 |
 |
||
| cy52 | cy71 | ||
 |
 |
||
| 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| A | c1 (참조예 1) |
c2 (참조예 2) |
c3 (참조예 3) |
n1 (참조예 4) |
n2 (참조예 5) |
d1 (참조예 6) |
d2 (참조예 7) |
f1 (참조예 8) |
f2 (참조예 9) |
b1 (참조예 10) |
| B | b2 (실시예 1) |
b3 (실시예 2) |
b4 (실시예 3) |
b5 (실시예 4) |
b6 (참조예 11) |
cy31 (실시예 5) |
cy32 (실시예 6) |
cy51 (실시예 7) |
cy52 (실시예 8) |
cy71 (실시예 9) |
| C | c1 (참조예 12) |
c2 (참조예 13) |
c4 (참조예 14) |
c5 (참조예 15) |
c6 (참조예 16) |
n1 (참조예 17) |
n2 (참조예 18) |
d1 (참조예 19) |
d2 (참조예 20) |
f1 (참조예 21) |
| D | b1 (참조예 22) |
b2 (실시예 10) |
b3 (실시예 11) |
b4 (실시예 12) |
b5 (실시예 13) |
cy31 (실시예 14) |
cy32 (실시예 15) |
cy51 (실시예 16) |
cy52 (실시예 17) |
cy71 (실시예 18) |
| E | c1 (참조예 23) |
c2 (참조예 24) |
c4 (참조예 25) |
c5 (참조예 26) |
c6 (참조예 27) |
n1 (참조예 28) |
n2 (참조예 29) |
d1 (참조예 30) |
d2 (참조예 31) |
f1 (참조예 32) |
| F | b1 (참조예 33) |
b2 (실시예 19) |
b3 (실시예 20) |
b4 (실시예 21) |
b5 (실시예 22) |
cy31 (실시예 23) |
cy32 (실시예 24) |
cy51 (실시예 25) |
cy52 (실시예 26) |
cy71 (실시예 27) |
| G | c1 (참조예 34) |
c2 (참조예 35) |
c4 (참조예 36) |
c5 (참조예 37) |
c6 (참조예 38) |
n1 (참조예 39) |
n2 (참조예 40) |
d1 (참조예 41) |
d2 (참조예 42) |
f1 (참조예 43) |
| H | b1 (참조예 44) |
b2 (실시예 28) |
b3 (실시예 29) |
b4 (실시예 30) |
b5 (실시예 31) |
cy31 (실시예 32) |
cy32 (실시예 33) |
cy51 (실시예 34) |
cy52 (실시예 35) |
cy71 (실시예 36) |
상기 실시예 및 참조예 화합물 중 대표적으로 실시예 8의 제조방법은 다음과 같다.
글루코사민 (10.7 mg, 0.03 mmole), cy51 (5 mg, 0.01 mmole), HATU (22.8 mg, 0.03 mmole), DIEA (17.4 μL, 0.05 mmole)을 DMF (5 mL)에 용해시킨 후 2시간 교반하고, 혼합물을 진공속에서 농축시켰다. MeOH:DCM=1:15 내지 1:5를 이용하여 잔여물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제한 후, HPLC로 추가 정제하여 목적 화합물을 푸른색 고체(4.2 mg, 53%)로 수득하였다.
나머지 실시예 및 참조예 화합물은 상기 실시예 8 화합물의 제조방법을 참고하여 제조할 수 있으며, 글루코사민 및 cy51 대신 각각의 출발 화합물을 선택하고 용매 등의 첨가량을 적절히 조절하여 제조할 수 있다.
실시예 화합물의 LC-MS 데이터를 표 4에 정리하였다.
| No. | calcd. m/z [M+H]+ |
obs. m/z [M+H]+ |
순도 (%) |
No. | calcd. m/z [M+H]+ |
obs. m/z [M+H]+ |
순도 (%) |
| 1 | 504.2 | 504.2 | 99 | 2 | 552.2 | 552.3 | 90 |
| 3 | 622.3 | 622.3 | 99 | 4 | 672.3 | 672.6 | 99 |
| 5 | 604.3 | 604.4 | 99 | 6 | 698.3 | 698.2 | 99 |
| 7 | 658.4 | 658.4 | 99 | 8 | 724.3 | 724.3 | 99 |
| 9 | 750.3 | 750.3 | 95 | 10 | 504.2 | 504.2 | 99 |
| 11 | 594.2 | 594.2 | 97 | 12 | 622.3 | 622.3 | 99 |
| 13 | 630.3 | 630.4 | 99 | 14 | 604.3 | 604.3 | 99 |
| 15 | 698.3 | 698.23 | 99 | 16 | 658.4 | 658.4 | 99 |
| 17 | 724.3 | 724.3 | 95 | 18 | 750.3 | 750.3 | 99 |
| 19 | 504.2 | 504.2 | 96 | 20 | 594.2 | 594.2 | 99 |
| 21 | 622.3 | 622.3 | 99 | 22 | 672.2 | 672.2 | 95 |
| 23 | 604.3 | 604.3 | 99 | 24 | 698.3 | 698.3 | 99 |
| 25 | 658.4 | 658.4 | 86 | 26 | 724.3 | 724.3 | 99 |
| 27 | 750.3 | 750.3 | 95 | 28 | 504.2 | 504.2 | 97 |
| 29 | 594.2 | 594.2 | 99 | 30 | 622.3 | 622.3 | 99 |
| 31 | 672.2 | 672.2 | 95 | 32 | 604.3 | 604.3 | 99 |
| 33 | 698.3 | 698.3 | 99 | 34 | 658.4 | 658.4 | 99 |
| 35 | 724.3 | 724.3 | 99 | 36 | 750.3 | 750.3 | 95 |
<실험예 1> 형광 강도 히트맵 분석
상기 실시예 및 참조예에서 제조한 화합물의 M1 대식세포에 대한 선택성을 분석하기 위하여, 다음과 같이 형광 강도 히트맵을 이용하여 분석하였다. 먼저 M1 및 M2 대식세포를 마우스 세포주인 RAW264.7의 휴지 상태 M0으로부터 구별하였다. M0, M1 및 M2 대식세포를 96 웰 플레이트에 시딩한 후 상기 화합물을 처리하였다. 1시간 동안 배양한 후, 자동 형광 현미경으로 세포 이미지를 촬영하고, 각 세포 유형의 형광 강도를 정량화하여, 하기 식 1에 따른 M0 또는 M2 대식세포에 대한 M1의 선택성 지수(Selectivity index, SI)를 계산하고 그 결과를 히트맵으로 나타내었다 (표 5, 표 6).
표 5: M0에 대한 M1의 STI
표 6: M2에 대한 M1의 STI
[식 1]
선택성 지수(SI) = {F(M1)-F(M0 또는 M1)} / {σ(M1)+ σ(M0 또는 M1)}
(상기 식 1에서, 'F'는 해당 대식세포에서 얻어진 형광 값의 평균 값을 의미하며, 'σ'는 해당 대식세포에서 얻어진 형광 값의 표준편차 값을 의미한다)
| 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| A | -1.7 | -1.6 | -1.4 | 0 | 0 | -1.7 | -0.9 | 0 | -0.5 | -1.6 |
| B | 1.3 | -0.8 | 1.1 | 1.6 | 0 | 1.1 | 2.0 | 3.4 | 2.6 | 2.5 |
| C | -1.2 | -1.1 | -1.5 | -1.4 | -1.2 | -0.4 | 0.1 | 0.4 | -0.4 | -0.2 |
| D | 0.5 | 0.9 | -0.6 | 1.5 | 1.5 | 1.2 | 2.9 | 2.7 | 1.2 | 2.3 |
| E | -1.1 | -0.8 | -1.7 | -2.1 | 0 | 0 | -2.0 | 0.7 | -1.3 | 0 |
| F | 0 | 1.1 | 0 | 2.1 | 0.9 | 1.7 | 1.5 | 2.6 | 1.3 | 2.6 |
| G | -2.3 | -2.1 | -1.6 | -1.9 | -1.7 | 0 | 0 | 0 | -1.6 | 1.4 |
| H | 0 | 0 | -0.3 | 0.9 | 1.0 | 2.6 | 2.6 | 2.3 | 2.4 | 2.5 |
| 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| A | -0.6 | -1.2 | -0.6 | -0.7 | 1.0 | -1.9 | -3.0 | 0 | -0.2 | -1.9 |
| B | 1.3 | -0.9 | 1.1 | 2.7 | 0 | 1.6 | 1.8 | 3.0 | 2.7 | 2.5 |
| C | -0.4 | -0.5 | -0.7 | -0.2 | -0.8 | -0.6 | 1.7 | -0.4 | -0.8 | -0.1 |
| D | 0.3 | 1.2 | 0.1 | 1.4 | 2.4 | 1.0 | 2.5 | 2.7 | 0.9 | 1.7 |
| E | -0.3 | -1.2 | -1.2 | -0.9 | 0 | 0 | -1.5 | -0.6 | 0 | 0 |
| F | 0 | 0.9 | 0 | 2.3 | 1.7 | 1.4 | 1.1 | 2.6 | 1.4 | 2.1 |
| G | -1.4 | -1.3 | -0.5 | -0.7 | -1.1 | 0.7 | 0 | 0 | -3.5 | 0.2 |
| H | 0 | 0 | 1.2 | 1.0 | 1.5 | 1.6 | 2.1 | 2.3 | 2.5 | 2.5 |
상기 표 5 및 표 6을 통해 확인할 수 있듯이, 실시예에 따른 화합물은 탄수화물 및 형광단의 종류에 따라 다른 활성을 보이기는 하나, 참조예의 화합물에 비해 현저히 우수한 M1 대식세포에 대한 선택성을 보였다. 한편, 실시예 화합물 중 탄수화물 B, 형광단 Cy52로 구성되는 실시예 8이 가장 현저한 선택성을 보였으며, 이를 CDr17(Compound Designation red 17)이라 명명했다.
<실험예 2> M1 대식세포 선택성에 대한 메커니즘 분석
상기 실시예에 따른 화합물(프로브)의 선택성에 대한 메커니즘을 분석하기 위하여, 상기 실시예 8의 CDr17 화합물을 이용하여 다음과 같이 시험하였다.
먼저 CDr17의 선택성이 세포 내 GLUTs와 관련이 있는지를 분석하기 위해 다음과 같은 방법으로 포도당 경쟁 시험을 수행하였다. RAW264.7 세포에서 분화된 글루코스가 없는 M1 대식세포의 배지로써 10% Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum (Gibco) 및 다양한 농도 (0(Cont.), 20, 60 mM)의 D/L- 글루코스를 포함하는 1% 페니실린 스트렙토마이신(WELGENE)을 포함하는 배지를 5분 동안 배양한 후 CDr17(1 μM)을 첨가하였다. 핵을 Hoechst33342 (1 μg/mL)으로 염색하였으며, 30분 후 배지를 신선한 배지로 교체하였다. 형광 현미경 이미징은 40x 대물렌즈로 Operetta High Throughput 스크리닝으로 수행하였다.
형광 강도 분석 결과, CDr17의 강도는 D-글루코스에 의해 용량 의존적으로 감소했지만 L-글루코스는 M1 대식세포에 의한 CDr17 흡수에 영향을 미치지 않았다 (도 2).
다음으로 일반적인 GLUT 억제제인 사이토칼라신 B19(Cytochalasin B19)을 이용하여 GLUT 억제 시험을 수행하였다. 다양한 농도 (0, 0.03, 0.1, 0.3 μM)의 억제제를 M1 대식세포와 함께 30분 배양한 후, CDr17를 세포에 처리하고 형광 강도를 분석하였다 (도 3). 그 결과, 사이토칼라신 B19가 용량 의존적으로 GLUT를 통한 CDr17의 흡수를 차단함을 확인할 수 있었다.
상기 시험을 통해 CDr17이 D-글루코스처럼 GLUT의 기질로 작용함을 알 수 있다.
<실험예 3> CDr17의 구체적인 표적 확인
CDr17의 표적 범위를 구체적으로 확인하기 위해 다음과 같이 시험하였다.
먼저, M0, M1 및 M2 대식세포에서 알려진 13개의 마우스(RAW264.7) GLUT 유전자 발현 수준을 분석하였으며, 그 결과 M0 및 M2 대식세포에 비해 M1에서 GLUT1만이 현저하게 발현되는 것을 확인하였다 (도 4).
다음으로, RAW264.7의 M1 대식세포에서 GLUT1의 선택적 억제제인 STF-3121를 이용하여 GLUT1의 기능을 차단한 후 1 μM CDr17의 30분 동안 처리하여 억제 효과를 모니터링 하였다. 그 결과 STF-31의 용량 의존적으로 M1 세포로의 CDr17의 진입이 현저하게 감소함을 확인할 수 있었다 (도 5 및 도 6).
더 나아가 CRISPR/Cas9를 통해 M1 대식세포에서 GLUT1 KO(녹아웃)을 수행한 후 1 μM CDr17의 30분 동안 처리하여 CDr17의 형광 강도를 분석하였다. 녹아웃 시험은 RAW264.7 세포의 M1 대식세포를 이용하여 수행하였으며, TrueCut™Cas9 Protein v2 (Invitrogen™, A36498) 및 Lipofectamine™ CRISPRMAX™ Cas9 Transfection Reagent (Invitrogen™CMAX00008)을 제조사의 가이드 라인에 따라 이용하였다. sgRNA는 Horizon으로부터 구입하여 사용하였다 (Target ID, SG-044254-01-0005). 형광 강도 분석 결과, 대조군 M1 대식세포와 비교할 때 80%의 강도 감소가 나타났다 (도 7 및 도 8).
상기 시험을 통해 CDr17이 M1 대식세포에서 GLUT1을 표적으로 함을 확인할 수 있었다.
<실험예 4> M1 대식세포 선택성에 대한 비교 분석
CDr17의 M1 대식세포에 대한 선택성을 비교하기 위하여 일반적으로 사용되는 형광 프로브인 2-NBDG를 인간 기원 대식 세포주인 THP-1에 적용하여 시험하였다. 0.5 μM 농도의 CDr17 및 다양한 농도(1, 5, 10, 50, 100 μM)의 2-NBDG를 이용하여 각 대식세포에서의 형광강도를 분석한 결과, CDr17의 경우 0.5 μM의 농도는 M0 및 M2 대식세포와 M1 대식세포를 구별하기에 충분하였으나 (도 9 및 도 10), 이와 달리 2-NBDG는 100 μM까지 농도를 높여야만 형광 신호의 관찰이 가능했을 뿐만 아니라, 어떠한 농도에서도 M1와 M2 대식세포를 명확히 구별할 수 없었다 (도 11).
이를 통해 CDr17은 M1 대식세포에 대해 우수한 선택성 및 보편성을 구현함을 확인할 수 있었다.
<실험예 5> 류마티스 관절염 모델 진단 분석
류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA)의 대식세포는 대부분의 M1과 소수의 M2로 구성되어 있는 것으로 알려져 있다. CDr17이 류마티스 관절염의 진단에 적용될 수 있는지 확인하기 위하여 collagen antibody cocktail 방법을 이용하여 시험하였다 (도 12). 항체 주사(iv) 3일 후 마우스에 LPS를 복강내(ip) 주사로 투여한 후, 10일 후 관절 부종 및 발적을 관찰하였다 (도 13의 화살표). iv를 통해 CDr17 (2 mM, 100 μL)을 주입한 후 다양한 시점(0, 15, 30, 45, 60분)에서 생체 내 이미지를 수집하였다 (도 13). 그 결과 15분이 경과하였을 때 가장 높은 피크를 나타내어 CDr17을 이용하여 짧은 시간 안에 염증 부위를 구별할 수 있음을 확인할 수 있었다.
다음으로, CDr17 강도와 관절 부종 등급(joint swelling grade)의 상관 관계를 분석한 결과 부종 등급과 CDr17 강도 사이에 양의 상관 관계가 있음을 확인하였으며 (도 14), 이를 통해 CDr17을 이용하여 질병의 중증도를 추적할 수 있는 진단 프로브로 활용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
이상, 일 구현예를 실시예 및 실험예를 통해 상세히 설명하였으나, 일 구현예의 범위는 특정 실시예에 한정되는 것이 아니며, 첨부된 특허 청구범위에 의하여 해석되어야 할 것이다.
Claims (20)
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 수화물:[화학식 1]
상기 화학식 1에서,A는 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 탄수화물 유도체이며:[화학식 2]
[화학식 3]
X는 하기 화학식 4 내지 화학식 7중 어느 하나로 표시되는 형광단(fluorophores)이다:[화학식 4]
[화학식 5]
상기 화학식 4 및 화학식 5에서,L1은 각각 독립적으로 C1-10알킬렌이고;R1은 각각 독립적으로 수소, C1-10알킬 또는이고;
R2는 각각 독립적으로 수소, C1-10알킬 또는이고;
상기 R1 및 R2의 R11은 각각 독립적으로 C6-20아릴이고, 상기 C6-20아릴은 할로겐, C1-5알킬 및 C1-5알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환기가 치환될 수 있고; c는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이고;a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수이다;[화학식 6]
[화학식 7]
상기 화학식 6 및 화학식 7에서,L2는 각각 독립적으로 C1-10알킬렌이고;R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-10알킬 또는 C1-10알콕시이고;R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소 또는 C1-10알킬이고;R7은 각각 독립적으로 수소 또는 C1-10알킬이고;d는 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수이고;e는 각각 독립적으로 1 내지 4의 정수이고;f 및 g는 각각 독립적으로 1 또는 2이고;h는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이고;Y-는 음이온이다. - 제1항에 있어서,상기 A는 하기 화학식 2-1, 화학식 2-2, 화학식 2-3 또는 화학식 3-1로 표시되는 탄수화물 유도체인, 화합물 또는 이의 수화물:[화학식 2-1];
[화학식 2-2];
[화학식 2-3];
[화학식 3-1].
- 제1항에 있어서,상기 화학식 4 및 화학식 5에서,상기 L1은 각각 독립적으로 C1-5알킬렌이고;상기 R1은 각각 독립적으로 수소, C1-5알킬 또는이고;
상기 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-5알킬 또는이고;
상기 R1 및 R2의 R11은 각각 독립적으로 C6-20아릴이고, 상기 C6-20아릴은 할로겐, C1-5알킬 및 C1-5알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환기가 치환될 수 있고; c는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고;a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수인, 화합물 또는 이의 수화물. - 제1항에 있어서,상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, -CH3,또는
인, 화합물 또는 이의 수화물.
- 제1항에 있어서,상기 화학식 4는 하기 화학식 4-1, 화학식 4-2 또는 화학식 4-3로 표시되는 형광단인, 화합물 또는 이의 수화물:[화학식 4-1];
[화학식 4-2];
[화학식 4-3].
- 제1항에 있어서,상기 화학식 5는 하기 화학식 5-1로 표시되는 형광단인, 화합물 또는 이의 수화물:[화학식 5-1].
- 제1항에 있어서,상기 화학식 6 및 화학식 7에서,상기 L2는 각각 독립적으로 C3-8알킬렌이고;상기 R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-5알킬이고;상기 R5 및 R6은 각각 독립적으로 C1-5알킬이고;상기 R7은 각각 독립적으로 C1-5알킬이고;상기 i는 각각 독립적으로 0 내지 5의 정수인, 화합물 또는 이의 수화물.
- 제1항에 있어서,상기 화학식 6 및 화학식 7에서,상기 R3 및 R4는 수소이고;상기 R5 및 R6는 -CH3인, 화합물 또는 이의 수화물.
- 제1항에 있어서,상기 화학식 6은 하기 화학식 6-1 또는 화학식 6-2로 표시되는 형광단인, 화합물 또는 이의 수화물:[화학식 6-1];
[화학식 6-2].
- 제1항에 있어서,상기 화학식 7은 하기 화학식 7-1, 화학식 7-2 또는 화학식 7-3으로 표시되는 형광단인, 화합물 또는 이의 수화물:[화학식 7-1];
[화학식 7-2];
[화학식 7-3].
- 제1항에 있어서,상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물군으로부터 선택되는 것인, 화합물 또는 이의 수화물:(1);(2)
;(3)
;(4)
;(5)
;(6)
;(7)
;(8)
;(9)
;(10)
;(11)
;(12)
;(13)
;(14)
;(15)
;(16)
;(17)
;(18)
;(19)
;(20)
;(21)
;(22)
;(23)
;(24)
;(25)
;(26)
;(27)
;(28)
;(29)
;(30)
;(31)
;(32)
;(33)
;(34)
;(35)
;(36)
.
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 수화물을 포함하는 M1 대식세포 표지용 형광 프로브:[화학식 1]
상기 화학식 1에서,A는 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 탄수화물 유도체이며:[화학식 2]
[화학식 3]
X는 하기 화학식 4 내지 화학식 7중 어느 하나로 표시되는 형광단(fluorophores)이다:[화학식 4]
[화학식 5]
상기 화학식 4 및 화학식 5에서,L1은 각각 독립적으로 C1-10알킬렌이고;R1은 각각 독립적으로 수소, C1-10알킬 또는이고;
R2는 각각 독립적으로 수소, C1-10알킬 또는이고;
상기 R1 및 R2의 R11은 각각 독립적으로 C6-20아릴이고, 상기 C6-20아릴은 할로겐, C1-5알킬 및 C1-5알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환기가 치환될 수 있고; c는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이고;a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수이다;[화학식 6]
[화학식 7]
상기 화학식 6 및 화학식 7에서,L2는 각각 독립적으로 C1-10알킬렌이고;R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-10알킬 또는 C1-10알콕시이고;R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소 또는 C1-10알킬이고;R7은 각각 독립적으로 수소 또는 C1-10알킬이고;d는 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수이고;e는 각각 독립적으로 1 내지 4의 정수이고;f 및 g는 각각 독립적으로 1 또는 2이고;h는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이고;Y-는 음이온이다. - 제12항에 있어서,상기 M1 대식세포 표지용 형광 프로브는 포도당 수송체(glucose transpoters, GLUTs)를 표적으로 하는, M1 대식세포 표지용 형광 프로브.
- 제13항에 있어서,상기 포도당 수송체는 GLUT1인, M1 대식세포 표지용 형광 프로브.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 M1 대식세포 표지용 형광 프로브를 포함하는 M1 대식세포 시각화용 조성물.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 M1 대식세포 표지용 형광 프로브를 포함하는 M1 대식세포 시각화용 키트.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 M1 대식세포 표지용 형광 프로브를 포함하는 M1 대식세포 모니터링 시스템.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 M1 대식세포 표지용 형광 프로브를 포함하는 조성물을 생물학적 시료에 투여하여 M1 대식세포에 대한 정보를 제공하는 방법.
- 피검체로부터 분리된 생물학적 시료를 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 M1 대식세포 표지용 형광 프로브와 접촉시켜, 형광 이미지를 수득하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
- 제19항에 있어서,상기 염증성 질환은 자가 면역 질환을 포함하는, 염증성 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20220039430 | 2022-03-30 | ||
| KR10-2022-0039430 | 2022-03-30 | ||
| KR1020230041236A KR20230141610A (ko) | 2022-03-30 | 2023-03-29 | M1 대식세포 표지용 형광 프로브 및 이를 이용한 m1 대식세포 모니터링 시스템 |
| KR10-2023-0041236 | 2023-03-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2023191549A1 true WO2023191549A1 (ko) | 2023-10-05 |
Family
ID=88202839
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2023/004294 WO2023191549A1 (ko) | 2022-03-30 | 2023-03-30 | M1 대식세포 표지용 형광 프로브 및 이를 이용한 m1 대식세포 모니터링 시스템 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2023191549A1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200110232A (ko) * | 2019-03-14 | 2020-09-23 | 고려대학교 산학협력단 | 카라지난 유도체, 대식세포 표지용 프로브 및 이의 제조방법 |
-
2023
- 2023-03-30 WO PCT/KR2023/004294 patent/WO2023191549A1/ko unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200110232A (ko) * | 2019-03-14 | 2020-09-23 | 고려대학교 산학협력단 | 카라지난 유도체, 대식세포 표지용 프로브 및 이의 제조방법 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| CHO HEEWON, KWON HAW-YOUNG, SHARMA AMIT, LEE SUN HYEOK, LIU XIAO, MIYAMOTO NAOKI, KIM JONG-JIN, IM SIN-HYEOG, KANG NAM-YOUNG, CHAN: "Visualizing inflammation with an M1 macrophage selective probe via GLUT1 as the gating target", NATURE COMMUNICATIONS, vol. 13, no. 1, 10 October 2022 (2022-10-10), pages 5974, XP093094350, DOI: 10.1038/s41467-022-33526-z * |
| DOSHI MONA, NIERENBERG DANIEL A., FLORES-FERNANDEZ ORIELYZ, DEME PRAGNEY, BECERRA EDILU, KHALED ANNETTE R., PARTHASARATHY SAMPATH: "Cypate and Cypate-Glucosamine as Near-Infrared Fluorescent Probes for In Vivo Tumor Imaging", MOLECULAR PHARMACOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS, US, vol. 95, no. 5, 1 May 2019 (2019-05-01), US , pages 475 - 489, XP093094349, ISSN: 0026-895X, DOI: 10.1124/mol.118.114199 * |
| LICHA K, ET AL.: "Hydrophilic cyanine dyes as contrast agents for near‐infrared tumor imaging: Synthesis, photophysical properties and spectroscopic in vivo characterization SPECTROSCOPIC IN VIVO CHARACTERIZATION", PHOTOCHEMISTRY AND PHOTOBIOLOGY, WILEY-BLACKWELL PUBLISHING, INC., US, vol. 72, no. 03, 1 January 2000 (2000-01-01), US , pages 392 - 398, XP000992953, ISSN: 0031-8655, DOI: 10.1562/0031-8655(2000)072<0392:HCDACA>2.0.CO;2 * |
| TAKASUGI TOMOHIRO; HANAOKA KENJIRO; SASAKI AYAKO; IKENO TAKAYUKI; KOMATSU TORU; UENO TASUKU; YAMADA KATSUYA; URANO YASUTERU: "Development of a platform for activatable fluorescent substrates of glucose transporters (GLUTs)", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 27, no. 10, 1 January 1900 (1900-01-01), AMSTERDAM, NL, pages 2122 - 2126, XP085664276, ISSN: 0968-0896, DOI: 10.1016/j.bmc.2019.02.055 * |
| XU HU, LIU XINYU, YANG JINNA, LIU RAN, LI TAOLI, SHI YUNLI, ZHAO HONGXIA, GAO QINGZHI: "Cyanine-based 1-amino-1-deoxyglucose as fluorescent probes for glucose transporter mediated bioimaging", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, ELSEVIER, AMSTERDAM NL, vol. 474, no. 2, 1 May 2016 (2016-05-01), Amsterdam NL , pages 240 - 246, XP093094344, ISSN: 0006-291X, DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.03.133 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2012026765A2 (ko) | 신규한 헤테로고리 화합물 및 이를 이용한 염증성 질환 치료용 조성물 | |
| WO2021015544A1 (ko) | 벤조퀴놀리지늄계 화합물, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 조영제 조성물 | |
| WO2009139576A2 (ko) | 신규 벤즈옥사졸로 치환된 피리딘 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 이상세포 성장 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 | |
| WO2020149715A1 (ko) | 피롤로피리딘 유도체 및 단백질 키나아제 관련 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 이의 용도 | |
| EP3697787A1 (en) | Heterocyclic compound as a protein kinase inhibitor | |
| WO2020067800A1 (ko) | 유기 발광 소자용 잉크 조성물 | |
| WO2015160192A1 (ko) | 티에노피리미딘 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 백혈병 치료 및 예방용 약학 조성물 | |
| WO2023191549A1 (ko) | M1 대식세포 표지용 형광 프로브 및 이를 이용한 m1 대식세포 모니터링 시스템 | |
| WO2018199633A1 (ko) | 데커신 유도체를 유효성분으로 함유하는 노화 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물 | |
| WO2015102426A1 (en) | Novel indole derivative compound and pharmaceutical composition comprising the same | |
| WO2019039888A1 (ko) | 세포 소기관 내 글루타치온 측정용 실시간 형광 이미징 센서 및 이의 제조 방법 | |
| WO2022177302A1 (ko) | Dna-pk 억제 활성을 갖는 피리미딘-융합 고리 화합물 및 이의 용도 | |
| WO2021107657A1 (ko) | 신규한 퀴나졸린 리독스 유도체 및 bet 억제제로서의 용도 | |
| HASHIMOTO et al. | Structure of a base in DNA modified by Glu-P-1 | |
| WO2020185044A1 (ko) | 헤테로아릴 유도체 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 | |
| WO2021118003A1 (ko) | 신규 혈관누출 차단제의 고수율 제조방법 | |
| WO2014027826A1 (ko) | 부테놀라이드계 화합물과 그의 제조방법 및 그를 포함하는 약제학적 조성물 | |
| WO2010150927A1 (en) | Pharmaceutical composition for prevention and treatment of cancer diseases comprising benzamide derivatives | |
| WO2020050470A1 (ko) | 메로시아닌 화합물, 이의 이성질체를 포함하는 dsrna 검출용 조성물 및 dsrna 발현 분석을 이용한 암 진단을 위한 정보 제공 방법 | |
| WO2019088374A1 (ko) | 새로운 비타민 e 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용 | |
| WO2023282414A1 (ko) | p38 MAP 키나아제 억제제로 염증성 질환의 치료 효과를 나타내는 신규 화합물 | |
| WO2019231016A1 (ko) | 신규한 형광체-테트라진 화합물 및 이의 용도 | |
| WO2023229338A1 (ko) | 보디피 화합물 및 이를 포함하는 세포 소기관의 온도 감응용 형광 센서 | |
| WO2020040581A1 (ko) | 신규한 퀴놀린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 | |
| WO2024025393A1 (ko) | 이미다조[1,2-a]피리딘 화합물의 신규 염, 이의 결정형 및 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 23781400 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |