CN113564189A - 一种高产靛蓝的工程菌制备靛蓝及其染布的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高产靛蓝的工程菌制备靛蓝及其染布的方法，所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2能够异源表达吲哚氧化酶iifC2D2；所述吲哚氧化酶iifC2D2包含了两个组分，分别是加氧酶组分iifC2和还原酶组分iifD2；通过所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2制备靛蓝的方法如下：步骤1，利用LB培养基培养所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2；步骤2，配制表面响应优化的色氨酸培养基；步骤3，利用步骤1中所述高产靛蓝的E.coliBL21(DE3)工程菌制备靛蓝；步骤4，得到微生物合成靛蓝粉末；步骤5，利用步骤4中得到的微生物合成靛蓝粉末染布。本发明靛蓝生产及染布的方法具有培养时间短、靛蓝产量高、合成过程绿色无毒等优势，具有优秀的工业应用潜力。

Description

一种高产靛蓝的工程菌制备靛蓝及其染布的方法
技术领域
本发明涉及一种微生物菌种培育及其应用的技术领域，更具体地说，涉及一种高产靛蓝的工程菌制备靛蓝及其染布的方法。
背景技术
靛蓝是人类历史上使用最古老的色素之一，最早可以追溯到6000年前，具有染料活性好、色彩鲜艳持久等特点。根据相关数据统计，2017年全球靛蓝行业产能为10.5万吨，产量为8.35万吨，市场需求量巨大。靛蓝的传统合成途径是从菘蓝、马蓝、蓼蓝和木蓝等植物中提取靛蓝，但是因其存在植物种植时间长、效率低下等原因而逐渐被取代。现今，合成靛蓝的主流途径是化学合成靛蓝，有着合成效率高、产量大等优势。但同时，化学合成靛蓝途径中存在着大量的环境污染问题。靛蓝的化学合成的工业原料为苯胺，是一种有毒有害的化学品，是由石油制品苯衍生得到的。此外，合成过程涉及多种危险化学物质，包括甲醛、氢氰酸、氨基钠等。因此，寻求一种更为环保、高效的合成技术成为了目前亟需解决的问题。近年来，微生物合成靛蓝因其环境友好、反应条件温和、能耗低等优势成为了目前的研究热点。
1928年，Gray等在研究菌株降解吲哚的过程中首次发现菌株能够转化吲哚产生靛蓝类色素。此后，大量文献表明Comamonassp.、Pseudomonasputida、Arthrobactersp.等多种具有吲哚羟化能力的菌属均具有合成靛蓝的能力。通过对菌株降解吲哚的机理进行研究时，研究人员发现野生菌降解吲哚的第一步是将吲哚羟化形成吲哚酚，而吲哚酚则可以在空气中自发氧化二聚生成靛蓝。1983年，Ensley等将具有羟化吲哚能力的萘双加氧酶在大肠杆菌中异源表达，大肠杆菌体内原有的色氨酸酶将培养基中的色氨酸转化为吲哚，然后表达萘双加氧酶将吲哚最终转化为靛蓝，该实验为后续靛蓝微生物合成研究奠定了基础。此外，被证明具有羟化靛蓝能力的酶有萘双加氧酶，苯乙烯双加氧酶，黄素加氧酶和细胞色素P450单加氧酶等。1992年，美国Amgen公司对PseudomonasputidaNDO菌株的萘双加氧酶活性、稳定性和色氨酸合成途径进行改造，最终优化靛蓝产量达到135mg/L。而后在2002年，美国Genencor公司利用代谢工程的手段对此途径进行进一步改造，实现了短暂的工业化。但受限于成本等多方面因素，微生物合成靛蓝工业化最终未能实现。因此，开发更为新颖、产量更高的合成靛蓝工程菌是极其重要的。2017年，本实验室在Mol.Microbiol.(2017,106:905-918)发表了一种新颖的吲哚加氧酶，且该酶较其他芳烃加氧酶对吲哚羟化具有更优异的专一性。本实验室从长期运行的处理吲哚的SBR反应器中，筛选得到多株能够以吲哚为唯一碳源生长的菌株，这些菌株均具有不需要其他芳香化合物诱导便可以降解吲哚的能力，并在这些菌株中鉴定出了多株相似性在30％以上的吲哚加氧酶。其中，涉及的吲哚加氧酶iifC2D2来源于野生菌Burkholdeiasp.IDO3，关于异源表达吲哚加氧酶的工程菌(E.coli_IifC2D2)的构建过程及功能验证发表在Int.Biodeter.Biodegra.(2019,142:36-42)，但关于E.coli_IifC2D2在多重条件转化色氨酸合成靛蓝，并应用于染布工程的方法尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是研制一种更为环保、高效的可以与工业靛蓝粉相媲美的生物靛蓝合成技术，以及将生物靛蓝应用到工业染色领域的技术。
为了达到上述目的，本发明提供了一种高产靛蓝的工程菌制备靛蓝及其染布的方法，所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2能够异源表达吲哚氧化酶iifC2D2；所述吲哚氧化酶iifC2D2包含了两个组分，分别是加氧酶组分iifC2和还原酶组分iifD2；所述高产靛蓝的工程菌是以大连理工大学长期运行的处理吲哚的活性污泥体系中野生菌Burkholderiasp.IDO3全基因组为模板，通过聚合酶链式反应分别得到加氧酶组分iifC2和所述还原酶组分iifD2的序列后，再利用酶切法将目的基因和质粒pET-28a(+)相连，最后导入外源表达宿主大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中合成高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2。
通过所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2制备靛蓝的方法如下：
步骤1，利用LB培养基培养所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2；
步骤1.1，将所述LB培养基至于121±5℃、0.15±0.01MPa高温高压灭菌环境中20±5min后，加入终浓度50±0.01μg/L硫酸卡那霉素备用；
步骤1.2，在步骤1.1所述的LB培养基中按照接菌量1±0.01％(V/V)接种所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2，然后在温度为30±0.5℃，转速为150±5r/min的条件下，培养12±1h后得到菌液，备用；
步骤2，配制表面响应优化的色氨酸培养基；
所述色氨酸培养基的组成为：NaCl15±0.01g/L、酵母浸粉6.71±0.01g/L、色氨酸4.87±0.01g/L、去离子水；所述色氨酸培养基的pH值在6.7～7.2之间；
将所述色氨酸培养基置于121±5℃，0.15±0.01MPa高温高压灭菌的条件下20±5min后，再加入终浓度为50±0.01μg/L硫酸卡那霉素和0.5±0.01mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)混合，备用；
步骤3，利用步骤1中所述高产靛蓝的E.coliBL21(DE3)工程菌制备靛蓝；
在步骤2所述的色氨酸培养基中接种步骤1中所述的高产靛蓝的工程菌，接菌量为1±0.01％(V/V)，在30±0.5℃，150±5r/min条件下培养24±2h后，形成含有微生物和靛蓝的色氨酸培养基；
步骤4，对步骤3中所述的含有微生物和靛蓝的色氨酸培养基用高速滤膜进行抽滤，将滤饼放置于80±5℃烘箱中烘干3～4h，得到微生物合成靛蓝粉末，并分别对培养基中的靛蓝和微生物合成靛蓝粉末中的靛蓝净含量进行定量；
靛蓝净含量的定量方法为：
步骤4.1，将步骤3中所述的含有微生物和靛蓝的色氨酸培养基放入台式冷冻离心机在转速10000±5r/min下离心10±1min后，利用二甲基亚砜反复萃取，得到含有靛蓝的萃取液；
步骤4.2，将步骤4.1所述的萃取液放入台式冷冻离心机在转速10000±5r/min下离心10±1min后在616nm处测定萃取液吸光度；
步骤4.3，利用靛蓝浓度和616nm吸光度呈线性关系这一特性，将步骤4.2得到的所述萃取液吸光度通过标准曲线计算出靛蓝浓度；
步骤5，利用步骤4中得到的微生物合成靛蓝粉末染布的方法：
步骤5.1，向靛蓝染色体系中加入靛蓝净含量为3.5±0.2g/L所述步骤4中的微生物合成靛蓝粉末进行搅拌后，再继续投加4.0±0.1g/L氢氧化钠和去离子水保持pH值在13.0～13.5之间，然后，加热至90±5℃后加入5±0.1g/L保险粉，持续搅动溶液直至靛蓝被还原为隐色体，即靛蓝染色体系变为黄绿色后停止加热；
步骤5.2，将布料投入步骤5.1所述的靛蓝染色体系中浸染15±5min，挤干水分晾晒15±5min后布料上附着的隐色体在空气中氧化为靛蓝；重复三次后，进行皂煮固色清洗，最终晾干。
优选方式下，所述质粒pET-28a(+)中包含卡那抗性。
优选方式下，所述加氧酶iifC2基因序列的Genbank登录号为APT36898，所述还原酶iifD2基因序列的Genbank登录号APT36899。
优选方式下，所述LB培养基的组成成分包括：NaCl10±0.01g/L、胰蛋白胨10±0.01g/L、酵母浸粉5±0.01g/L，以及去离子水；所述LB培养基的pH值6.7～7.2。
优选方式下，步骤2所述表面响应优化的色氨酸培养基的制备步骤如下：
Step1，采用中心设计法，利用Design-expert-8.0.6软件对培养基中酵母浸粉、氯化钠和色氨酸浓度进行了优化；
Step2，预实验；
Step2.1，将酵母浸粉、氯化钠和色氨酸分别设置为考察因子A、B和C，以靛蓝产量为响应值，确定每个考察因子的影响范围；
Step3，后续实验；
Step3.1，利用DesignExpert-8.0.6软件设计后续实验方案；
Step3.2，根据Step3.1得到的后续实验方案配比色氨酸培养基；
Step4，Step3.2得到的色氨酸培养基中以1±0.01％(V/V)接菌量，在30±0.5℃，150±5r/min条件下培养24±2h；
Step5，利用靛蓝定量方法对Step4得到的色氨酸培养基进行定量，最后利用Design-expert-8.0.6软件对结果进行拟合，并进一步对结果进行可靠性分析得到优化的色氨酸培养基配比。
本发明靛蓝生产及染布的方法具有培养时间短、靛蓝产量高、合成过程绿色无毒等优势。通过本发明对高产靛蓝的工程菌合成靛蓝所需的培养基组成及培养条件的多重优化，按照本发明制备靛蓝的步骤产出的靛蓝产量高，得到的合成靛蓝粉末具有不亚于工业靛蓝粉的染色能力。结合捆扎，折叠等传统扎染方式，更是能得到多种图案的布样，这株高产靛蓝的工程菌合成的靛蓝粉末具有优秀的工业应用潜力。
附图说明
图1是本发明所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2合成靛蓝培养皿及平板涂布的对比照片。
图2是本发明所述色氨酸培养基的不同pH值下和与其对应所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2合成靛蓝浓度的柱状图。
图3是本发明所述色氨酸培养基在加入IPTG不同时间下和与其对应所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2合成靛蓝浓度的柱状图。
图4是本发明所述色氨酸培养基在不同转速下和与其对应的所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2合成靛蓝浓度的柱状图。
图5是所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2合成靛蓝过程中酵母浸粉和色氨酸相互作用的响应图。
图6是所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2合成靛蓝过程中氯化钠和色氨酸相互作用的响应图。
图7是所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2合成靛蓝过程中酵母浸粉和氯化钠相互作用的响应图。
图8是本发明中所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2微生物合成靛蓝粉末的染布效果图。
具体实施方式
本发明为一种高产靛蓝的工程菌制备靛蓝及其染布的方法，所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2能够异源表达吲哚氧化酶iifC2D2；所述吲哚氧化酶iifC2D2包含了两个组分，分别是加氧酶组分iifC2和还原酶组分iifD2；加氧酶(iifC2)蛋白序列的Genbank登录号APT36898，还原酶(iifD2)蛋白序列的Genbank登录号APT36899。
其中：加氧酶(iifC2)蛋白序列为：
MRKIGIVGGGQAGFHLAFGLLDRGHEVTVYTDRTPDQLLAGKIPSTAFLFNETLDWERRLGLNFWEDVAPAGEGMLVDFREPSGASVMTVKGRLHDRSGQAIDQRTKFARWTQEFERRGGTLVFRAVDIDELDDIAGANDLTLIASGKGAINALFARDAARSAHDKPPRNLAAMLLKGPQIVGDRPWPKADFRPLRFNFIFGVGEFFSLPFYSHAVGECRSFLFEARPGGDMDRFQAATDGNELLEIARGVLRDFAPEDASLLDDAQLTDPNAWLKGAFTPTVRHPVGRLASGRIVMGVGDTVCLNDPIAGQGANNASRMADHLMKAIDVHGREPFDADWMQQTFDTFWDESARYTTAFTNALLEPPGDAVMHVLRAASTQRAVADDFVRCFQRPREFWPWIADLPEAQRFVAERVACDAA
还原酶(iifD2)蛋白序列为：
MRHDHDIVEHAWHHHHEIPQAPGDFRRALGCFATGVTVVTTVDGDGRRIGLTANSFSSVSIDPPLILWSLARRSPSLSAFEHCRFFAVNVLAGSQQAICTRFATPIDDRFSGVDTVDGQGGVPLISGALAQFECENEIVHAGGDHAIFIGRVNRFRWREQVPLVFCMGALRELDTNRQER
所述高产靛蓝的工程菌是以大连理工大学长期运行的处理吲哚的活性污泥体系中野生菌Burkholderiasp.IDO3全基因组为模板，通过聚合酶链式反应分别得到加氧酶组分iifC2和所述还原酶组分iifD2的序列后，再利用酶切法将目的基因和质粒pET-28a(+)相连，最后导入外源表达宿主大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中合成高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2。所述质粒pET-28a(+)中包含卡那抗性。
通过所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2制备靛蓝的方法如下：
步骤1，利用LB培养基培养所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2；
步骤1.1，将所述LB培养基至于121±5℃、0.15±0.01MPa高温高压灭菌环境中20±5min后，加入终浓度50±0.01μg/L硫酸卡那霉素备用；所述LB培养基的组成成分包括：NaCl10±0.01g/L、胰蛋白胨10±0.01g/L、酵母浸粉5±0.01g/L，以及去离子水；所述LB培养基的pH值6.7～7.2。
步骤1.2，在步骤1.1所述的LB培养基中按照接菌量1±0.01％(V/V)接种所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2，然后在温度为30±0.5℃，转速为150±5r/min的条件下，培养12±1h后得到菌液，备用；
步骤2，配制表面响应优化的色氨酸培养基；
所述色氨酸培养基的组成为：NaCl 15±0.01g/L、酵母浸粉6.71±0.01g/L、色氨酸4.87±0.01g/L、去离子水；所述色氨酸培养基的pH值在6.7～7.2之间；
步骤2所述表面响应优化的色氨酸培养基的制备步骤如下：
Step1，采用中心设计法，利用Design-expert-8.0.6软件对培养基中酵母浸粉、氯化钠和色氨酸浓度进行了优化；
Step2，预实验；
Step2.1，将酵母浸粉、氯化钠和色氨酸分别设置为考察因子A、B和C，以靛蓝产量为响应值，确定每个考察因子的影响范围；
Step3，后续实验；
Step3.1，利用DesignExpert-8.0.6软件设计后续实验方案；
Step3.2，根据Step3.1得到的后续实验方案配比色氨酸培养基；
Step4，Step3.2得到的色氨酸培养基中以1±0.01％(V/V)接菌量，在30±0.5℃，150±5r/min条件下培养24±2h；
Step5，利用靛蓝定量方法对Step4得到的色氨酸培养基进行定量，最后利用Design-expert-8.0.6软件对结果进行拟合，并进一步对结果进行可靠性分析得到优化的色氨酸培养基配比。
将所述色氨酸培养基置于121±5℃，0.15±0.01MPa高温高压灭菌的条件下20±5min后，再加入终浓度为50±0.01μg/L硫酸卡那霉素和0.5±0.01mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)混合，备用；
步骤3，利用步骤1中所述高产靛蓝的E.coliBL21(DE3)工程菌制备靛蓝；
在步骤2所述的色氨酸培养基中接种步骤1中所述的高产靛蓝的工程菌，接菌量为1±0.01％(V/V)，在30±0.5℃，150±5r/min条件下培养24±2h后，形成含有微生物和靛蓝的色氨酸培养基；
步骤4，对步骤3中所述的含有微生物和靛蓝的色氨酸培养基用高速滤膜进行抽滤，将滤饼放置于80±5℃烘箱中烘干3～4h，得到微生物合成靛蓝粉末，并分别对培养基中的靛蓝和微生物合成靛蓝粉末中的靛蓝净含量进行定量；
靛蓝净含量的定量方法为：
步骤4.1，将步骤3中所述的含有微生物和靛蓝的色氨酸培养基放入台式冷冻离心机在转速10000±5r/min下离心10±1min后，利用二甲基亚砜反复萃取，得到含有靛蓝的萃取液；
步骤4.2，将步骤4.1所述的萃取液放入台式冷冻离心机在转速10000±5r/min下离心10±1min后在616nm处测定萃取液吸光度；
步骤4.3，利用靛蓝浓度和616nm吸光度呈线性关系这一特性，将步骤4.2得到的所述萃取液吸光度通过标准曲线计算出靛蓝浓度；
步骤5，利用步骤4中得到的微生物合成靛蓝粉末染布的方法：
步骤5.1，向靛蓝染色体系中加入靛蓝净含量为3.5±0.2g/L所述步骤4中的微生物合成靛蓝粉末进行搅拌后，再继续投加4.0±0.1g/L氢氧化钠和去离子水保持pH值在13.0～13.5之间，然后，加热至90±5℃后加入5±0.1g/L保险粉，持续搅动溶液直至靛蓝被还原为隐色体，即靛蓝染色体系变为黄绿色后停止加热；
步骤5.2，将布料投入步骤5.1所述的靛蓝染色体系中浸染15±5min，挤干水分晾晒15±5min后布料上附着的隐色体在空气中氧化为靛蓝；重复三次后，进行皂煮固色清洗，最终晾干。
下面结合具体的实施例对本发明的高产靛蓝的工程菌制备靛蓝，以及所制备的靛蓝染布的效果进行验证：
实施例1：高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2合成靛蓝的验证
挑取高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2单菌株接入到含50±0.01μg/L硫酸卡那霉素的LB培养基中，在30±0.5℃、150±5r/min下培养12±1h得到接种液。高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2靛蓝合成条件为色氨酸培养基，灭菌后加入终浓度为50±0.01μg/L硫酸卡那霉素和0.5±0.01mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，向培养基中以加入菌液在30±0.5℃、150±5r/min下培养24±2h。将固体色氨酸培养基(固体色氨酸培养基：向上述的色氨酸培养基中加入2±0.01％琼脂粉制得)灭菌后加入终浓度为50±0.01μg/L硫酸卡那霉素和0.5±0.01mmol/L IPTG，倒入培养皿凝固后，利用接种液进行平板涂布，最终将培养皿倒置在30±0.5℃的培养箱中16±1h。最终得到的菌液和平板如图1所示，菌液颜色呈深蓝色，固体平板上菌株呈蓝色圆点状，证明工程菌E.coli_IifC2D2在色氨酸培养基中具有合成大量靛蓝色素的能力。
实施例2：不同时间加入IPTG对于E.coli_IifC2D2合成靛蓝浓度的影响
将实施例1中得到的接种液，以1±0.01％(V/V)接菌量接入到色氨酸培养基中，并向其中加入终浓度为50±0.01μg/L硫酸卡那霉素，在30±0.5℃、150±5r/min下培养至OD600分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8后，分别向各培养基中加入终浓度为0.5±0.01mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，培养24±2h。取50mL菌液离心去上清，用二甲基亚砜反复萃取离心后得到菌体，将萃取混合液离心并测定上清中616nm处吸光度，计算其中靛蓝合成浓度。如图3所示，不同时间加入IPTG会明显影响所述工程菌合成靛蓝的浓度。IPTG对于常规工程菌具有一定的毒性作用，因此过早加入IPTG的时间通常降低工程菌表达的酶量。但对于本实验中，在初始接菌过程中加入IPTG并没有降低靛蓝产量，反而是最高的，诱导时间越晚最终靛蓝的产量越低，由此可以大大简化所述工程菌在培养过程中的步骤。
实施例3：不同pH对于E.coli_IifC2D2合成靛蓝浓度的影响
将实施例1中得到的接种液，以1±0.01％(V/V)接菌量接入到不同pH(5.0、6.0、6.7、7.0、8.0和9.0)的色氨酸培养基中，加入终浓度为50±0.01μg/L硫酸卡那霉素和0.5±0.01mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在30±0.5℃，150±5r/min下培养24±2h后利用实施例2中的方法定量培养基中合成靛蓝的浓度。如图2所示，不同pH会影响工程菌合成靛蓝的能力，但所述菌株对于pH的耐受度较好，在pH 5.0～9.0均能稳定产生至少200mg/L靛蓝。
实施例4：不同转速对于E.coli_IifC2D2合成靛蓝浓度的影响
将实施例1中得到的接种液，以1±0.01％(V/V)接菌量接入到色氨酸培养基中，加入终浓度为50±0.01μg/L硫酸卡那霉素和0.5±0.01mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在30±0.5℃，不同转速下(50、100、150、200r/min)下培养24±2h。利用实施例2中的方法定量培养基中合成靛蓝的浓度。如图4所示，所述工程菌在150r/min转速下得到最多的靛蓝产量，并将其作为菌株合成靛蓝的最优条件应用于后续实验中。
实施例5：菌株E.coli_IifC2D2合成靛蓝过程中各因素相互作用的响应
利用DesignExpert-8.0.6设计实验，采用中心设计法针对酵母浸粉(A)、氯化钠(B)和色氨酸(C)几个因素进行表面响应优化，考察因子的范围为5～15g/L、5～15g/L和2～8g/L，得到实验设计如表1所示。根据设计得到的实验方案配比培养基后，以1±0.01％(V/V)接菌量，在30±0.5℃，150±5r/min条件下培养。24±2h后利用实施例2中靛蓝定量方法对培养基进行定量，最后利用软件对结果进行拟合，得到目标响应值与各个考察因子的回归方程为：
Y＝-92.86+14.26A+22.94B+60.83C-0.09AB-0.45AC+1.19BC+0.09A2-2.03B2-6.36C2
其中Y表示靛蓝产量，A表示酵母浸粉的浓度，B表示NaCl的浓度，C表示色氨酸的浓度。对回归方程进行模型可靠性分析，如表2所示，模型的P值<0.05，R2＝0.7786，说明这一模型是可信度为77.9％。其中A、B、C2、B2的P值均＜0.05，表明它们是整个模型的显著影响因素。
用3D响应面分析不同考察因子之间的相互影响。如图5、图6、图7可见，酵母浸粉、氯化钠、色氨酸两两之间有着明显的相互影响，最后得到所述工程菌合成靛蓝的最优条件为酵母浸粉15g/L、氯化钠6.71g/L、色氨酸4.87g/L，最终得到靛蓝产量为346.29mg/L。
Figure BDA0003112895850000091
表1 工程菌E.coli_IifC2D2合成靛蓝的优化实验设计
Figure BDA0003112895850000101
表2 模型的方差分析
实施例6：微生物合成靛蓝粉末染布效果
将实施例1中得到的接种液，以1±0.01％(V/V)接菌量接入到色氨酸培养基中，加入终浓度为50±0.01μg/L硫酸卡那霉素和0.5±0.01mmol/L IPTG，在30±0.5℃，不同转速下(50、100、150、200r/min)下培养24h后抽滤并烘干，最后利用实施例2中的方法定量粉末中靛蓝的浓度。靛蓝染色体系包含3.5±0.2g/L净含量靛蓝、4.0±0.1g/L氢氧化钠和去离子水，pH为13.0～13.5。将上述体系加热至90±5℃后加入5±0.1g/L保险粉，持续搅动溶液直至其变为黄绿色后停止加热，将布料投入体系中浸染15±5分钟，挤干水分晾晒15±5min，重复三次后，进行皂煮固色清洗，晾干。得到的布样结果如图8所示，所述工程菌得到的合成靛蓝粉末具有不亚于工业靛蓝粉的染色能力。结合捆扎，折叠等传统扎染方式，更是能得到多种图案的布样，可见所述工程菌合成的靛蓝粉末具有优秀的工业应用潜力。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种高产靛蓝的工程菌制备靛蓝及其染布的方法，其特征在于，
所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2能够异源表达吲哚氧化酶iifC2D2；所述吲哚氧化酶iifC2D2包含了两个组分，分别是加氧酶组分iifC2和还原酶组分iifD2；
所述高产靛蓝的工程菌是以大连理工大学长期运行的处理吲哚的活性污泥体系中野生菌Burkholderiasp.IDO3全基因组为模板，通过聚合酶链式反应分别得到加氧酶组分iifC2和所述还原酶组分iifD2的序列后，再利用酶切法将目的基因和质粒pET-28a(+)相连，最后导入外源表达宿主大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中合成高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2；
通过所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2制备靛蓝的方法如下：
步骤1，利用LB培养基培养所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2；
步骤1.1，将所述LB培养基至于121±5℃、0.15±0.01MPa高温高压灭菌环境中20±5min后，加入终浓度50±0.01μg/L硫酸卡那霉素备用；
步骤1.2，在步骤1.1所述的LB培养基中按照接菌量1±0.01％(V/V)接种所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2，然后在温度为30±0.5℃，转速为150±5r/min的条件下，培养12±1h后得到菌液，备用；
步骤2，配制表面响应优化的色氨酸培养基；
所述色氨酸培养基的组成为：NaCl15±0.01g/L、酵母浸粉6.71±0.01g/L、色氨酸4.87±0.01g/L、去离子水；所述色氨酸培养基的pH值在6.7～7.2之间；
将所述色氨酸培养基置于121±5℃，0.15±0.01MPa高温高压灭菌的条件下20±5min后，再加入终浓度为50±0.01μg/L硫酸卡那霉素和0.5±0.01mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)混合，备用；
步骤3，利用步骤1中所述高产靛蓝的E.coliBL21(DE3)工程菌制备靛蓝；
在步骤2所述的色氨酸培养基中接种步骤1中所述的高产靛蓝的工程菌，接菌量为1±0.01％(V/V)，在30±0.5℃，150±5r/min条件下培养24±2h后，形成含有微生物和靛蓝的色氨酸培养基；
步骤4，对步骤3中所述的含有微生物和靛蓝的色氨酸培养基用高速滤膜进行抽滤，将滤饼放置于80±5℃烘箱中烘干3～4h，得到微生物合成靛蓝粉末，并分别对培养基中的靛蓝和微生物合成靛蓝粉末中的靛蓝净含量进行定量；
靛蓝净含量的定量方法为：
步骤4.1，将步骤3中所述的含有微生物和靛蓝的色氨酸培养基放入台式冷冻离心机在转速10000±5r/min下离心10±1min后，利用二甲基亚砜反复萃取，得到含有靛蓝的萃取液；
步骤4.2，将步骤4.1所述的萃取液放入台式冷冻离心机在转速10000±5r/min下离心10±1min后在616nm处测定萃取液吸光度；
步骤4.3，利用靛蓝浓度和616nm吸光度呈线性关系这一特性，将步骤4.2得到的所述萃取液吸光度通过标准曲线计算出靛蓝浓度；
步骤5，利用步骤4中得到的微生物合成靛蓝粉末染布的方法：
步骤5.1，向靛蓝染色体系中加入靛蓝净含量为3.5±0.2g/L所述步骤4中的微生物合成靛蓝粉末进行搅拌后，再继续投加4.0±0.1g/L氢氧化钠和去离子水保持pH值在13.0～13.5之间，然后，加热至90±5℃后加入5±0.1g/L保险粉，持续搅动溶液直至靛蓝被还原为隐色体，即靛蓝染色体系变为黄绿色后停止加热；
步骤5.2，将布料投入步骤5.1所述的靛蓝染色体系中浸染15±5min，挤干水分晾晒15±5min后布料上附着的隐色体在空气中氧化为靛蓝；重复三次后，进行皂煮固色清洗，最终晾干。
2.根据权利要求1所述高产靛蓝的工程菌制备靛蓝及其染布的方法，其特征在于，所述质粒pET-28a(+)中包含卡那抗性。
3.根据权利要求1所述高产靛蓝的工程菌制备靛蓝及其染布的方法，其特征在于，所述加氧酶iifC2基因序列的Genbank登录号为APT36898，所述还原酶iifD2基因序列的Genbank登录号APT36899。
4.根据权利要求1所述高产靛蓝的工程菌制备靛蓝及其染布的方法，其特征在于，所述LB培养基的组成成分包括：NaCl10±0.01g/L、胰蛋白胨10±0.01g/L、酵母浸粉5±0.01g/L，以及去离子水；所述LB培养基的pH值6.7～7.2。
5.根据权利要求1所述高产靛蓝的工程菌制备靛蓝及其染布的方法，其特征在于，步骤2所述表面响应优化的色氨酸培养基的制备步骤如下：
Step1，采用中心设计法，利用Design-expert-8.0.6软件对培养基中酵母浸粉、氯化钠和色氨酸浓度进行了优化；
Step2，预实验；
Step2.1，将酵母浸粉、氯化钠和色氨酸分别设置为考察因子A、B和C，以靛蓝产量为响应值，确定每个考察因子的影响范围；
Step3，后续实验；
Step3.1，利用DesignExpert-8.0.6软件设计后续实验方案；
Step3.2，根据Step3.1得到的后续实验方案配比色氨酸培养基；
Step4，Step3.2得到的色氨酸培养基中以1±0.01％(V/V)接菌量，在30±0.5℃，150±5r/min条件下培养24±2h；
Step5，利用靛蓝定量方法对Step4得到的色氨酸培养基进行定量，最后利用Design-expert-8.0.6软件对结果进行拟合，并进一步对结果进行可靠性分析得到优化的色氨酸培养基配比。
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