CN113564186A - 苹果黄蚜Tre基因及其核酸干扰剂制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种苹果黄蚜Tre基因及其核酸干扰剂制备方法与应用。Tre基因为苹果黄蚜的致死基因，核酸干扰剂配方为包含根据苹果黄蚜Tre基因合成的dsRNA、昆虫体壁渗透剂脂肪醇聚氧乙烯醚(JFC)、氮酮与乳化剂NP‑10。其制备方法包括引物设计、基因扩增、纯化、dsRNA合成、制剂配制等。本发明的苹果黄蚜致死基因与海藻糖酶的活性有关，根据苹果黄蚜该基因合成的RNA干扰剂可抑制海藻糖酶的活性，使得苹果黄蚜血糖代谢受阻，最终导致苹果黄蚜死亡。可喷洒使用Tre基因核酸干扰剂应用于苹果生产中防治苹果黄蚜，具有较高的田间可操作性、杀虫特异性、对天敌及哺乳动物无害、杀虫效率高、对环境友好等优势。

Description

苹果黄蚜Tre基因及其核酸干扰剂制备方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种苹果黄蚜Tre(Trehalase)基因及其应用、核酸干扰剂及其制备方法与应用。
背景技术
苹果黄蚜是我国苹果产区危害严重的叶面害虫，其在刺吸危害的同时还可传播植物病毒病，诱发果树发生多种病害，其排出的蜜露覆盖于叶面及果实，诱发叶片霉污病，严重影响叶片的光合作用和果品质量。目前，使用化学农药仍是控制苹果黄蚜的主要方法，但高强度的农药选择压力逐渐加剧了其抗药性的发展、“3R”问题日益突出，果品农残超标率居高不下，不仅影响果品出口，增加害虫治理成本和难度，还严重影响生态安全。因此，开发对环境友好的可持续的苹果黄蚜治理策略已成当务之急。开发基于RNAi的苹果黄蚜绿色防控新技术是解决上述问题的新策略。
RNA干扰(RNAi)是一种转录后基因沉默现象，是指内源性或外源性与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA在细胞内特异降解该mRNA，从而使相应基因沉默，达到阻止基因表达的目的，现已被国际上公认为“第四代杀虫剂”核心技术。目前对昆虫进行RNAi主要是通过注射和饲喂dsRNA的方式，但是这两种方式很难应用到生产实践中，由于昆虫体壁的阻挡，单独喷洒dsRNA分子对害虫无效，因此，开发可喷洒使用的具有触杀作用的dsRNA制剂尤为重要。根据苹果黄蚜致死基因及基因沉默技术原理，开发可喷洒使用的基因干扰制剂，对苹果黄蚜进行高效、绿色、精准防控。该技术对防治苹果黄蚜具有特异性，对天敌及其他哺乳动物无害，不污染环境，大幅降低果园化学农药的使用，保障果品品质及食品安全。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足，本发明要解决的技术问题是苹果克服现有RNAi害虫防治技术的不足，提供一种苹果黄蚜致死基因及其应用、核酸干扰剂及核酸干扰剂的制备方法和应用，苹果黄蚜致死基因与海藻糖酶的活性有关，根据致死基因设计dsRNA可以抑制海藻糖酶的活性，使得苹果黄蚜的血糖代谢受阻，最终导致苹果黄蚜死亡。将合成的dsRNA与昆虫体壁渗透剂脂肪醇聚氧乙烯醚(JFC)、氮酮、NP-10混配，将其制备成可喷洒使用的核酸干扰剂，可以对苹果黄蚜进行高效精准防治，具有杀虫特异性强、环境友好、防效高等优势。
为实现上述目的，本发明提供了一种苹果黄蚜Tre(Trehalase)基因，所述Trehalase基因为苹果黄蚜致死基因，所述Trehalase基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。通过提取苹果黄蚜的总RNA，反转录合成cDNA第一条链，以第一条链为模板，设计上下游引物对Trehalase的cDNA片段进行PCR扩增。
进一步的，所述上游引物DNA序列为CATGAACATATTCTTGGAAAT；下游引物DNA序列为：ATTTCCAAGAATATGTTCATG。
基于一个总的构思，本发明还提供了一种苹果黄蚜Trehalase基因在防治苹果黄蚜中的的应用。
基于一个总的构思，本发明还提供了一种核酸干扰剂，所述核酸干扰剂的主效成分为dsTrehalase(dsRNA)，所述dsTrehalase为权利要求1所述的Trehalase基因的cDNA片段合成的特异性dsRNA，所述dsTrehalase的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
基于一个总的构思，本发明还提供了一种核酸干扰剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：根据Trehalase基因的cDNA序列合成特异性引物，以苹果黄蚜整虫cDNA为模板，进行PCR扩增获得扩增产物，并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到纯化的目的DNA片段；
步骤2：将目的DNA片段合成为目的dsRNA，获得核酸干扰剂的主效成分；
步骤3：将获得的dsRNA与渗透剂进行混配，得到可喷洒使用的核酸干扰剂。
进一步的，所述步骤1中的特异性引物包括上游引物以及下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步的，所述步骤1中的PCR扩增反应体系为：25μL 2×Taq PCR Master Mix，2μL cDNA模板，2μL上游引物，2μL下游引物，19μL ddH2O。
PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min，然后进入下述循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35次循环；最后在72℃下延伸10min。
进一步的，所述步骤2具体为：采用T7RiboMAX Express RNAi system(Promega)dsRNA合成试剂盒将所述DNA片段进行合成，得到核酸干扰剂主效成分dsRNA；
dsRNA合成反应体系为：8μL dNTP(100mM)，1μg DNA，2μL 10×Reaction Buffer，2μLT7 RNAPolymerase Mix，加ddH2O补足到总体积为20μL；
dsRNA合成PCR反应条件为：37℃，4h；70℃，10min；25℃，20min。
进一步的，所述步骤3中可喷洒使用的核酸干扰剂配方为：在主效dsRNA水溶液中加入2％(v/v)的脂肪醇聚氧乙烯醚(JFC)、1％(v/v)的氮酮、0.5％(v/v)的NP-10。
基于一个总的构思，本发明还提供了一种核酸干扰剂在防治苹果黄蚜中的应用。
进一步的，一种核酸干扰剂在防治苹果黄蚜中的应用，包括以下步骤：
步骤1：将核酸干扰剂加水配制成0.9μg/μL的溶液；
步骤2：采用喷雾的方式将上述核酸干扰剂溶液喷洒在苹果黄蚜体表。
本发明的有益效果是：
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种苹果黄蚜Tre(Trehalase)基因，所述Trehalase基因为苹果黄蚜致死基因，Trehalase基因编码海藻糖酶，是苹果黄蚜糖代谢中的关键酶。本发明根据苹果黄蚜Trehalase基因进行设计，开发能够抑制Trehalase基因表达的生物制剂，从而阻碍苹果黄蚜的糖代谢能力，并导致苹果黄蚜死亡。这种生物制剂是特异针对苹果黄蚜Trehalase基因片段设计的，与哺乳动物不具有同源性，仅对苹果黄蚜具有杀灭效果，特异性高，环境友好，害虫不易产生抗性，是一种害虫绿色防控新途径。
(2)本发明提供了一种可喷洒使用的核酸干扰剂，该干扰剂的主效成分是基于Trehalase设计合成的dsRNA，该dsRNA可以高效降解苹果黄蚜体内Trehalase的mRNA，导致苹果黄蚜糖代谢受阻，最终导致虫体死亡。目前本技术领域内对于dsRNA的递送方式主要以饲喂和注射为主，多数昆虫饲喂dsRNA是无效的，且注射的方式不能应用于农业生产中，本发明通过将dsRNA与渗透剂与扩散剂混配，开发出可以喷洒使用，以触杀的作用方式杀灭苹果黄蚜的核酸干扰剂，该制剂具有特异性强、对哺乳动物及天敌无害、发挥作用快、致死率高的优势，为基于RNA干扰的害虫精准核酸防控提供了新策略与新方法。
附图说明
图1为本发明实施例一中喷施不同浓度Trehalase基因核酸干扰剂后Trehalase基因的干扰效率对比图；
图2为本发明中喷洒Trehalase基因核酸干扰剂对苹果黄蚜的防治效果对比图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，单并不因此而限制本发明的保护范围。
为实现本发明目的而提供了一种苹果黄蚜Tre(Trehalase)基因，所述Trehalase基因为苹果黄蚜致死基因，所述Trehalase基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。通过提取苹果黄蚜的总RNA，反转录合成cDNA第一条链，以第一条链为模板，以Trehalase-F(CATGAACATATTCTTGGAAAT)和Trehalase-R(ATTTCCAAGAATATGTTCATG)为引物，进行PCR扩增。
基于一个总的构思，本发明还提供了一种苹果黄蚜Trehalase基因在防治苹果黄蚜中的的应用。
基于一个总的构思，本发明还提供了一种核酸干扰剂，所述核酸干扰剂的主效成分为dsTrehalase(dsRNA)，所述dsTrehalase为权利要求1所述的Trehalase基因的cDNA片段合成的特异性dsRNA，所述dsTrehalase的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
基于一个总的构思，本发明还提供了一种核酸干扰剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：根据Trehalase基因的cDNA序列合成特异性引物，特异性引物包括上游引物以及下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的序列如SEQ IDNO.4所示，以苹果黄蚜整虫cDNA为模板，进行PCR扩增获得扩增产物，PCR扩增反应体系为：25μL 2×Taq PCR MasterMix，2μLcDNA模板，2μL上游引物，2μL下游引物，19μL ddH2O，PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min，然后进入下述循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35次循环；最后在72℃下延伸10min，并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到纯化的目的DNA片段，
步骤2：将目的DNA片段通过Promega dsRNA合成试剂盒合成为目的dsRNA，获得核酸干扰剂的主效成分，dsRNA合成反应体系为：8μL dNTP(100mM)，1μg DNA，2μL 10×ReactionBuffer，2μL T7 RNAPolymerase Mix，加ddH2O补足到总体积为20μL；dsRNA合成PCR反应条件为：37℃，4h；70℃，10min；25℃，20min。
步骤3：将获得的dsRNA与渗透剂进行混配，得到可喷洒使用的核酸干扰剂，可喷洒使用的核酸干扰剂配方为：在主效dsRNA水溶液中加入2％(v/v)脂肪醇聚氧乙烯醚(JFC)、1％(v/v)的氮酮、0.5％(v/v)的NP-10。
基于一个总的构思，本发明还提供了一种核酸干扰剂在防治苹果黄蚜中的应用。包括以下步骤：
步骤1：将核酸干扰剂加水配制成0.9μg/μL的溶液；
步骤2：采用喷雾的方式将上述核酸干扰剂溶液喷洒在苹果黄蚜体表。
实施例一
一种苹果黄蚜致死基因，苹果黄蚜致死基因为Trehalase，通过克隆获得苹果黄蚜致死基因(Trehalase)的cDNA，所述Trehalase的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
具体步骤如下：
Trehalase基因cDNA克隆于苹果黄蚜成蚜，提取成蚜的总RNA，通过反转录合成cDNA。以cDNA为模板，Trehalase-F(CATGAACATATTCTTGGAAAT)和Trehalase-R(ATTTCCAAGAATATGTTCATG)为引物，进行PCR扩增。
所述Trehalase的cDNA序列具体如下：
ATGCCTCAAAGTGCGGGCGTACTTACAAATTCTGTTATGATAACTTTAATACTACTGATCAGTTCCTTGTGTGGATGTTGGAGTTCTGATGCGGATCAACATGTTGCTTCGTCTCCCACATGTGACAGTAATATTTACTGTTATGGACCATTGCTGCATGCGATTCAAATGTCGAGCATATTCCCAGATTCAAAAACGTTTGTTGACATGAAAATGAAATATTCGCCTAATGAGACCATGAACATATTCTTGGAAATGATGAAAAGAACAGGACAAAGGCCATCAAAATTAGAACTGGAGATTTTCCTCAATGATACTTTCGAGAAGGAAGGTAGTGAATTTGAAATTTGGGATCCCTCCGATTGGAAGCCAGAGCCAAAATTTATAAGTGAAATTAAAGATCCAAATTTTCAAGAATGGGCTAGAGGTTTACATTTACTATGGAAACTGCTCGGTAAAAAAATCAAAGATGATGTTCGTTTACATCCCGACCATTATTCGATTATCTATGTTCCATATCCGGTAATCGTGCCCGGAGGCCGGTTCCGTGAATTCTACTATTGGGATTCTTACTGGATTATTAGAGGTCTGTTATTGTCTGAGATGTATACTACAGTCAAAGGAATGCTTAGCAACTTTTTATCAATTATTAACACCTACGGTCATATTCCAAACGGCGGTAGAGTTTATTATGCCATGCGGTCTCAACCCCCCATGCTAGTTCCAATGATGAAAAGTTACATCGAAGCTACAAATGACACTATTTTCCTCAAAGAAAATGTAGATATACTGGAAAAAGAATTCAGTTATTGGATGTTAAATCATACAGTAGACATAGAAAAAGACGGAAAAATGTACACATTAGCAAGATATAAAGATTCGTCAACAGGACCAAGGCCCGAATCATACAGGGAAGATATCATGAGCGCACAAACACTAAAGACCGATAACGATAAAGAAAATTACTATTCTGAACTAAAGGCCGCTGCGGAATCTGGATGGGATTTTTCCAGTAGATGGTTTATTCTAAATGGAACAAATAAAGGAAACTTGACCAACCTAAAAACACGGTTCATCATTCCGGTTGACTTGAACGCTCTGGTGTATTGGAACGCCAAGATACTGAGTGACTTTTACCGAGAGTTGAATGTGTCCGACAAAGCGCTAAAATACGAAAACATCGCAAATAAATGGATAGAAGCAGTGACGGCGGTACTGTGGCACGAAGAAGTAGGCGCATGGCTCGATTATGACATGTTGAATGAAATCAAGCGAGATTATTTTTACCCAACCAATATATCGCCGCTATGGACAGGATGTTATGACCCAAAGAAAACCGATGACTTTGTGTCTCGAACGCTTAAGTACTTGGAAAAAACACAAATAATGAACAACCTGGGGGGCATACCGACTACCTTGGAGCACTCCGGTGAACAGTGGGACTATCCAAATGCGTGGCCCCCTCTCCAGTACATAATGGTCATGTCACTGGATGCTTCAGGCGACAACTGGGCCCAGGACTTGGCGTTCGAGATAGCTGAGCGATGGATGAGGTCCAACTACAAGGCATACAACGAGACCAACGCTATGTATGAAAAGTATGATGCAACCGTACCTGGAGGTCACGGTAGTGGAGGAGAGTACGAGGTGCAGCTAGGCTTTGGCTGGACTAACGGTATAATCCTTGAGTTCCTTCAGAAGTATGGATCCAGGGTCACGGCTGAAGACAAGTTCATTGAGGCACCGCAGACCAGCGCCAATATAGATGCCAGCAGAAGCAGCACTGACTACAACACCAAGACCGTATCTTCAGCGACGCAAGTCATGACTGCCACGCTTGCGATACTGGCCACGATATCGGCCGGATGCATAGGGTTTGCCGTGTACAAAAAACGGTACCAGCTTTACGCGTCCGATCGAGCCCTGTGCAAGAAAATGTGCGGAGGCTACACTGAGCTCAAAGACCTGACGAGCGACTAG
实施例二
一种核酸干扰剂的制备方法，其制备方法包括以下步骤：
(1)获得载有Trehalase基因cDNA片段
1.1、Trehalase基因cDNA克隆于苹果黄蚜成蚜，提取成蚜的总RNA，通过反转录合成cDNA；
(2)dsRNA(dsTrehalase)的合成
2.1、设计dsRNA合成引物；
上游引物序列SEQ ID NO：3所示，具体为：
AATACGACTCACTATAGGCATGAACATATTCTTGGAAAT。
下游引物序列SEQ ID NO：4所示，具体为：
AATACGACTCACTATAGGATTTCCAAGAATATGTTCATG。
2.2、将载有Trehalase基因cDNA片段，并已验证成功的菌液提取质粒，以质粒为模板，以上述dsRNA合成引物进行PCR扩增，反应体系为：25μL 2×Taq PCRMasterMix，2μLcDNA模板，2μL上游引物，2μL下游引物，19μL ddH2O；
PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min，然后进入下述循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35次循环；最后在72℃下延伸10min。
2.3、对上述PCR产物进行纯化，以纯化产物为模板，并参照T7RiboMAX ExpressRNAi system(Promega)试剂盒说明书合成长度为517bp的dsTrehalase；
dsRNA合成反应体系为：8μL dNTP(100mM)，1μg DNA，2μL 10×Reaction Buffer，2μLT7 RNAPolymerase Mix，加ddH2O补足到总体积为20μL；
dsRNA合成PCR反应条件为：37℃，4h；70℃，10min；25℃，20min。并用Nanodrop检测合成的dsTrehalase的浓度，置于-20℃保存待用。
苹果黄蚜dsTrehalase序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：
CAUGAACAUAUUCUUGGAAAUGAUGAAAAGAACAGGACAAAGGCCAUCAAAAUUAGAACUGGAGAUUUUCCUCAAUGAUACUUUCGAGAAGGAAGGUAGUGAAUUUGAAAUUUGGGAUCCCUCCGAUUGGAAGCCAGAGCCAAAAUUUAUAAGUGAAAUUAAAGAUCCAAAUUUUCAAGAAUGGGCUAGAGGUUUACAUUUACUAUGGAAACUGCUCGGUAAAAAAAUCAAAGAUGAUGUUCGUUUACAUCCCGACCAUUAUUCGAUUAUCUAUGUUCCAUAUCCGGUAAUCGUGCCCGGAGGCCGGUUCCGUGAAUUCUACUAUUGGGAUUCUUACUGGAUUAUUAGAGGUCUGUUAUUGUCUGAGAUGUAUACUACAGUCAAAGGAAUGCUUAGCAACUUUUUAUCAAUUAUUAACACCUACGGUCAUAUUCCAAACGGCGGUAGAGUUUAUUAUGCCAUGCGGUCUCAACCCCCCAUGCUAGUUCCAAUGAUGAAAAGUUACAUCGAAGCUACA。
(3)核酸干扰剂制剂的配制
3.1将合成的dsTrehalase(dsRNA)加水稀释成浓度为0.3-0.9μg/μL的溶液；
3.2在溶液中加入2％(v/v)的快速渗透剂T、1％(v/v)的氮酮、0.5％(v/v)的NP-10，混匀后即为Trehalase核酸干扰剂制剂。
实施例三
一种核酸干扰剂的应用，具体应用步骤如下：
RNAi对苹果黄蚜dsTrehalase基因干扰效率的测试
(1)取发育一致无翅成蚜分为四组，三组为干扰组，一组为对照组；
(2)干扰组分别喷洒浓度为0.3、0.6、0.9μg/μL的dsTrehalase核酸干扰剂(喷雾塔喷雾时间为3s)，对照组喷洒浓度为0.9μg/μL的dsGFP制剂；
(3)处理后将试虫转移到新鲜苹果枝条上；
(4)处理24小时后，将50头虫体置于匀浆器中，Trizol法提取苹果黄蚜总RNA，根据反试录剂盒(Takara)反转为cDNA，以cDNA为模板，设计Trehalase的荧光定量PCR检测引物：(上游引物为F：ATGAAATCAAGCGAGATTATT；下游引物为R：TGGAGAGGGGGCCACGCATTT)；
(5)以β-Actin(上游引物为F：CGCCATACTCCGTCTGGACTTG；下游引物为R：CCGATAGTTATCACCTGACCGTCTG)与GAPDH(上游引物为F：GAAGGTGGTGAAGCAGGCATCT；下游引物为R：CGGCATCGAAGGTGGAAGAGTG)作为内参基因，采用实时荧光定量PCR方法检测Trehalase基因的表达量。
荧光定量反应的总体系为20μL，其中SYBR-Green Mix10μL，10μmol/L的上下游引物各1μL，模板1μL，ddH2O补足至20μL；
反应的条件为：95℃预变性60s，95℃10s，58℃50s，共40个循环，每个样本重复测定3次，苹果黄蚜Trehalase的干扰效率结果参见图1。
图1中，不同字母代表处理间差异显著，字母相同代表差异不显著。
从图1可知，随着Trehalase基因核酸干扰剂的浓度升高，苹果黄蚜Trehalase基因的表达量降低，Trehalase核酸干扰剂对Trehalase基因的干扰效率逐渐升高，在浓度0.9μg/μL时干扰效率最高。
实施例四
一种核酸干扰剂的应用，具体应用步骤如下：
喷洒核酸干扰剂后苹果黄蚜的死亡率
(1)取发育一致的苹果黄蚜无翅成蚜600头，分为两组，一组为处理组，一组为对照组；
(2)在试虫体表喷洒浓度为0.9μg/μL的Trehalase基因核酸干扰剂(喷雾塔喷雾时间为3s)；
(3)处理后将试虫转移到新鲜苹果枝条上；
(4)统计72h小时内苹果黄蚜的死亡率，结果参见表1。
表1喷洒Trehalase基因核酸干扰剂后苹果黄蚜的死亡率
Figure BDA0003166855430000121
从表1可以看出，喷洒Trehalase基因核酸干扰剂后，随着时间的延长，苹果黄蚜的死亡率逐渐上升，在72h苹果黄蚜的死亡率最高，达到80.2％。
结合实施例三和实施例四可知：
本发明过克隆苹果黄蚜Trehalase基因并合成dsRNA，通过添加助剂制备了可喷洒使用的Trehalase基因核酸干扰剂，通过喷施该核酸干扰剂，苹果黄蚜Trehalase基因可以被显著干扰，当核酸干扰剂浓度0.9μg/μL时，24h后干扰效率经检测可达75％；喷施0.9μg/μLTrehalase基因核酸干扰剂后，随着时间的推移，苹果黄蚜的死亡率逐渐增加，处理72h后死亡率达到80.2％。结果表明本发明研发的Trehalase基因核酸干扰剂对苹果黄蚜有较好的防治效果。
以上实施例不局限于该实施例自身的技术方案，实施例之间可以相互结合成新的实施例。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而并非对其进行限制，凡未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明技术方案的范围内。
Figure BDA0003166855430000131
Figure BDA0003166855430000141
Figure BDA0003166855430000151
序列表
<110> 山西大学
<120> 苹果黄蚜Tre基因及其核酸干扰剂制备方法与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1980
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcctcaaa gtgcgggcgt acttacaaat tctgttatga taactttaat actactgatc 60
agttccttgt gtggatgttg gagttctgat gcggatcaac atgttgcttc gtctcccaca 120
tgtgacagta atatttactg ttatggacca ttgctgcatg cgattcaaat gtcgagcata 180
ttcccagatt caaaaacgtt tgttgacatg aaaatgaaat attcgcctaa tgagaccatg 240
aacatattct tggaaatgat gaaaagaaca ggacaaaggc catcaaaatt agaactggag 300
attttcctca atgatacttt cgagaaggaa ggtagtgaat ttgaaatttg ggatccctcc 360
gattggaagc cagagccaaa atttataagt gaaattaaag atccaaattt tcaagaatgg 420
gctagaggtt tacatttact atggaaactg ctcggtaaaa aaatcaaaga tgatgttcgt 480
ttacatcccg accattattc gattatctat gttccatatc cggtaatcgt gcccggaggc 540
cggttccgtg aattctacta ttgggattct tactggatta ttagaggtct gttattgtct 600
gagatgtata ctacagtcaa aggaatgctt agcaactttt tatcaattat taacacctac 660
ggtcatattc caaacggcgg tagagtttat tatgccatgc ggtctcaacc ccccatgcta 720
gttccaatga tgaaaagtta catcgaagct acaaatgaca ctattttcct caaagaaaat 780
gtagatatac tggaaaaaga attcagttat tggatgttaa atcatacagt agacatagaa 840
aaagacggaa aaatgtacac attagcaaga tataaagatt cgtcaacagg accaaggccc 900
gaatcataca gggaagatat catgagcgca caaacactaa agaccgataa cgataaagaa 960
aattactatt ctgaactaaa ggccgctgcg gaatctggat gggatttttc cagtagatgg 1020
tttattctaa atggaacaaa taaaggaaac ttgaccaacc taaaaacacg gttcatcatt 1080
ccggttgact tgaacgctct ggtgtattgg aacgccaaga tactgagtga cttttaccga 1140
gagttgaatg tgtccgacaa agcgctaaaa tacgaaaaca tcgcaaataa atggatagaa 1200
gcagtgacgg cggtactgtg gcacgaagaa gtaggcgcat ggctcgatta tgacatgttg 1260
aatgaaatca agcgagatta tttttaccca accaatatat cgccgctatg gacaggatgt 1320
tatgacccaa agaaaaccga tgactttgtg tctcgaacgc ttaagtactt ggaaaaaaca 1380
caaataatga acaacctggg gggcataccg actaccttgg agcactccgg tgaacagtgg 1440
gactatccaa atgcgtggcc ccctctccag tacataatgg tcatgtcact ggatgcttca 1500
ggcgacaact gggcccagga cttggcgttc gagatagctg agcgatggat gaggtccaac 1560
tacaaggcat acaacgagac caacgctatg tatgaaaagt atgatgcaac cgtacctgga 1620
ggtcacggta gtggaggaga gtacgaggtg cagctaggct ttggctggac taacggtata 1680
atccttgagt tccttcagaa gtatggatcc agggtcacgg ctgaagacaa gttcattgag 1740
gcaccgcaga ccagcgccaa tatagatgcc agcagaagca gcactgacta caacaccaag 1800
accgtatctt cagcgacgca agtcatgact gccacgcttg cgatactggc cacgatatcg 1860
gccggatgca tagggtttgc cgtgtacaaa aaacggtacc agctttacgc gtccgatcga 1920
gccctgtgca agaaaatgtg cggaggctac actgagctca aagacctgac gagcgactag 1980
<210> 2
<211> 517
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caugaacaua uucuuggaaa ugaugaaaag aacaggacaa aggccaucaa aauuagaacu 60
ggagauuuuc cucaaugaua cuuucgagaa ggaagguagu gaauuugaaa uuugggaucc 120
cuccgauugg aagccagagc caaaauuuau aagugaaauu aaagauccaa auuuucaaga 180
augggcuaga gguuuacauu uacuauggaa acugcucggu aaaaaaauca aagaugaugu 240
ucguuuacau cccgaccauu auucgauuau cuauguucca uauccgguaa ucgugcccgg 300
aggccgguuc cgugaauucu acuauuggga uucuuacugg auuauuagag gucuguuauu 360
gucugagaug uauacuacag ucaaaggaau gcuuagcaac uuuuuaucaa uuauuaacac 420
cuacggucau auuccaaacg gcgguagagu uuauuaugcc augcggucuc aaccccccau 480
gcuaguucca augaugaaaa guuacaucga agcuaca 517
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatacgactc actataggca tgaacatatt cttggaaat 39
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatacgactc actataggat ttccaagaat atgttcatg 39

Claims (9)

1.一种苹果黄蚜Tre基因，其特征在于：所述Tre基因为苹果黄蚜致死基因，所述Tre基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述的一种苹果黄蚜Tre基因在防治苹果黄蚜中的应用。
3.一种核酸干扰剂，其特征在于：所述核酸干扰剂的主效成分为dsTre，所述dsTre为权利要求1所述的Tre基因的cDNA片段合成的特异性dsRNA，所述dsTre的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
4.一种权利要求3所述的一种核酸干扰剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：根据Tre基因的cDNA序列合成特异性引物，以苹果黄蚜整虫cDNA为模板，进行PCR扩增获得扩增产物，并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到纯化的目的DNA片段；
步骤2：将目的DNA片段合成为目的dsRNA，获得核酸干扰剂的主效成分；
步骤3：将获得的dsRNA与渗透剂进行混配，得到可喷洒使用的核酸干扰剂。
5.根据权利要求4所述的一种核酸干扰剂的制备方法，其特征在于：所述步骤1中的特异性引物包括上游引物以及下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求4所述的一种RNA干扰剂的的制备方法，其特征在于：所述步骤1中的PCR扩增反应体系为：25μL 2×Taq PCR Master Mix，2μL cDNA模板，2μL上游引物，2μL下游引物，19μL ddH2O；
PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min，然后进入下述循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35次循环；最后在72℃下延伸10min。
7.根据权利要求4所述的一种核酸干扰剂的的制备方法，其特征在于：所述步骤2具体为：将所述DNA片段通过Promega dsRNA合成试剂盒进行合成；
dsRNA合成反应体系为：8μL dNTP(100mM)，1μg DNA，2μL 10×Reaction Buffer，2μLT7 RNA Polymerase Mix，加ddH2O补足到总体积为20μL；
dsRNA合成PCR反应条件为：37℃，4h；70℃，10min；25℃，20min。
8.根据权利要求8所述的一种核酸干扰剂的的制备方法，其特征在于：所述步骤3中可喷洒使用的核酸干扰剂配方为：2％(v/v)脂肪醇聚氧乙烯醚(JFC)、1％(v/v)的氮酮、0.5％(v/v)的NP-10。
9.一种如权利要求3所述的一种核酸干扰剂在防治苹果黄蚜中的应用。
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