CN113564082A - 一种提高卷曲乳杆菌类细菌素产量的发酵培养基及培养条件 - Google Patents

一种提高卷曲乳杆菌类细菌素产量的发酵培养基及培养条件 Download PDF

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CN113564082A CN202110910199.1A CN202110910199A CN113564082A CN 113564082 A CN113564082 A CN 113564082A CN 202110910199 A CN202110910199 A CN 202110910199A CN 113564082 A CN113564082 A CN 113564082A
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Abstract

本发明属于微生物培养技术领域，具体公开了一种提高卷曲乳杆菌类细菌素产量的发酵培养基，其由乳清粉、葡萄糖和缓冲成分和水组成。此外，本发明还提供了一种利用所述的培养基改善卷曲乳杆菌类细菌素产量的方法。本发明研究发现，通过所述的成分比例的联合控制，能够意外地形成协同，能够显著改善卷曲乳杆菌类细菌素产量。

Description

一种提高卷曲乳杆菌类细菌素产量的发酵培养基及培养条件
技术领域
本发明属于微生物培养基技术领域，具体涉及一种能够提高阴道卷曲乳杆菌菌发酵上清液中类细菌素产量的发酵培养基和培养条件。
背景技术
念珠菌性阴道炎(Vulvovaginal candidiasis,VVC)是一种以白色念珠菌为主要致病菌的常见妇科疾病，具有高发病率(75％)、高复发性(40％～50％复发一次，8％复发3次)以及非致命性等特点，成为困扰全球女性身体健康的一大难题。健康女性阴道是一个复杂的动态的微生态系统，由正常菌群和机会致病菌组成。正常菌群由卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌等乳杆菌占主导优势，乳杆菌作为定植菌与机会致病菌(加德纳菌、白色念珠菌、光滑念珠菌等)共同寄居于阴道粘膜，乳杆菌能产生乳酸、过氧化氢、细菌素等多种代谢产物，维持健康妇女阴道内pH值3.8-4.4的弱酸性，抑制致病菌的定殖、生长和繁殖。当由于激素、免疫力降低、抗生素等因素的影响，阴道菌群之间的生态平衡被打破，致病菌大量繁殖，导致念珠菌性阴道炎发生，临床上常选用咪康唑、克霉唑和氟康唑等抗真菌唑类药物进行治疗。
近年来，推崇治疗药物联合微生态制剂的治疗方案，即使用药物抑制或杀灭致病菌后，再通过局部用药为阴道外源补充乳杆菌等益生菌，帮助阴道恢复由乳杆菌占主导优势的正常菌群。但是白色念珠菌对于常用抗真菌药物普遍出现多重耐药性，药物抑制或杀灭致病菌的效果很差，即使暂时治愈也容易复发；用药时间长(抗真菌药物治疗后还需要用益生菌进行治疗)，患者依从性较差；益生菌需要低温才能保持其活性，保存条件要求高，否则乳杆菌等益生菌会因丧失活性而失效。
卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus，L.crispatus)是阴道内占主导优势的一种重要的维持阴道生态环境的乳杆菌，在维持阴道微生态平衡上起着重要作用。已有大量研究证明，卷曲乳杆菌发酵上清液(CFS,Cell Free Supernatants)中存在一种热稳定性好、对蛋白酶敏感、分子量较小的类细菌素抑菌物质，若提取CFS中的类细菌素作为VVC的治疗药物，既有利于解决抗真菌药物产生的耐药性问题，又避免了像益生菌保存条件苛刻的问题，同时还有利于重新建立阴道微环境的平衡，恢复乳杆菌的主导地位，降低VVC的复发率，理论上是一种安全、有效的治疗复发性VVC的药物。
目前普遍用于培养L.crispatus的是MRS培养基(蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、柠檬酸氢二铵、葡萄糖、吐温80、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰)，MRS培养基有成熟的商业化产品。MRS培养基存在两方面的问题：一是类细菌素产量低(抑制率在20％左右，Jang sungJae,et al.,Scientific Reports,2019,9:8121)；二是成分多，成本高，会导致生产类细菌素的成本过高，难以实现工业化生产。目前也有一些乳清培养基的文献报道(①CN201410796931.7；②Sabrina S.Sabo,et al.,Journal ofDairy Science,2019,102(1):87-99)，但是这些乳清培养基的成分还是比较复杂，生产成本仍然较高。
发明内容
本发明第一目的在于，提供一种能够提高卷曲乳杆菌类细菌素产量的发酵培养基，旨在通过所述的培养基的控制提高卷曲乳杆菌类细菌素产量。
本发明第二目的在于，提供一种能够提高卷曲乳杆菌类细菌素产量的发酵方法。
一种提高卷曲乳杆菌类细菌素产量的发酵培养基，由乳清粉、葡萄糖和缓冲成分和水组成。
本发明提供了一种由乳清粉、葡萄糖和缓冲成分和水组成的封闭式液体发酵培养基，其能够基于成分的协同，能够意外地带来提高曲乳杆菌类细菌素产量的效果。
作为优选，所述的乳清粉为脱盐乳清粉、乳清粉、甜乳清粉中的至少一种；
优选地，所述的乳清粉为脱盐乳清粉，其主要成分及重量含量分别为：
乳糖75～85％、蛋白质10～12％、脂肪1～2％、灰分4～6％；余量为水。
作为优选，葡萄糖源为葡萄糖单糖或者能够在发酵过程转化成葡萄糖单糖的前体物质。
作为优选，缓冲成分为弱酸、弱碱中的至少一种；
优选地，所述的弱酸为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠中的至少一种；
优选地，所述的弱碱为磷酸氢二钾、磷酸氢二钠中的至少一种。
作为优选，所述的发酵培养基中，所述的乳清粉的浓度为10～25g/L；优选为20～25g/L，进一步优选为20～22.5g/L；
葡萄糖源的浓度大于0小于或等于8g/L；优选为2～6g/L，进一步优选为4～6g/L；
缓冲成分的浓度为0.5～0.75g/L，优选为0.7～0.75g/L；
发酵培养基的初始pH为6.9～7.1。
研究发现，在所述的三元协同成分下，进一步将各成分的浓度控制在所要求的范围下，能够进一步改善三元成分的协同性，可以进一步改善卷曲乳杆菌类细菌素产量。
作为优选，所述的发酵培养基由脱盐乳清粉、葡萄糖、磷酸氢二钾和水组成，其中，脱盐乳清粉的浓度为20～22.5g/L；葡萄糖的浓度为4～6g/L；磷酸氢二钾的浓度为0.7～0.75g/L；发酵培养基的初始pH为6.9～7.1。
本发明还提供了一种提高卷曲乳杆菌类细菌素产量的发酵方法，将卷曲乳杆菌接种在所述的发酵培养基中进行发酵培养，发酵后从其发酵液中分离卷曲乳杆菌类细菌素。
本发明研究发现，得益于所述的发酵培养基的乳清粉、葡萄糖源和缓冲成分以及浓度的联合控制，能够产生协同性，能够意外地改善卷曲乳杆菌类细菌素产量。
本发明所述的方法，可以基于现有的手段以及设备实现所述的发酵目标。
本发明中，所述的发酵的条件如接种量、发酵条件等均可以基于现有理论和手段进行控制。
例如，本发明中，卷曲乳杆菌的接种量为2％～4％。
本发明中，培养方式为摇床培养，其中摇床转速为110～130rpm。
优选地，培养温度为36～38℃。
优选地，发酵培养时间为24～36h。
有益效果
本发明提供了一种成分简单的发酵培养基，其基于其中的乳清粉、葡萄糖源和缓冲成分的协同，可以意外地改善卷曲乳杆菌类细菌素产量。
另外，研究还发现，在所述的乳清粉、葡萄糖源和缓冲成分成分协同基础上，进一步对成分的浓度进行联合控制，有助于进一步改善协同性，进一步改善卷曲乳杆菌类细菌素产量。
附图说明
图1为实施例4的乳清粉浓度和抑菌活性图；
图2为实施例4的葡萄糖浓度和抑菌活性图；
图3为实施例4的磷酸氢二钾浓度和抑菌活性图；
图4为有机酸、过氧化氢排除实验图；
图5为CFS用不同蛋白酶处理后抑菌活性变化图；
图6为CFS在不同温度加热处理后抑菌活性变化图；
图7为CFS在不同pH处理后抑菌活性变化图；
图8为不同培养基得到的CFS的抑菌活性图。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步阐述。其中实施例1～3为本发明培养基配方及培养条件；实例4为本发明培养基营养成分浓度优化；实例5为抑菌活性测试方法；实例6为类细菌素性质实验方法和结果。对比例1～6分别是MRS和现有的乳清培养基培养卷曲乳杆菌得到的CFS的抑菌活性对比。
这些实施例只是用于说明本发明，并不限制本发明，只要涉及到利用本发明的培养基培养卷曲乳杆菌，不管各成分配比如何，都在本发明的保护范围内。
以下案例中，所述的乳清粉，除特别申明外，均为脱盐乳清粉D90，其产自阿根廷，批号07X906，主要成分及含量：乳糖(79.07％)、蛋白质(11.45％)、脂肪(1.5％)、灰分(5.48％)和水分(2.5％)。
磷酸氢二钾，产自麦克林，产品号为P816387，用于分子生物学，≥99.0％(T)
葡萄糖，产自国药集团化学试剂有限公司，产品号为10010518，分析纯AR。
实施例1改良的乳清培养基及培养方法
称取脱盐乳清粉D9022.5 g，葡萄糖6g，磷酸氢二钾0.5g，溶于1L超纯水中，用5MNaOH调pH＝7，121℃高温灭菌15min，冷却至常温，4℃储存备用(改良乳清培养基)。
自健康人阴道分离的卷曲乳杆菌(CGMCC 1.2743，中国普通微生物菌种保藏管理中心)经划线培养后用接种环沾取少许至MRS液体培养基中，过夜培养，将菌液用MRS培养基稀释至OD600＝1.5，按2％的接种量，接种至改良乳清培养基中，摇床120rpm，37℃培养36h。培养结束后，分离菌体，收集上清液，得到CFS，测得抑菌活性(测定方法见实施例5)为44％。
实施例2改良的乳清培养基及培养方法
称取脱盐乳清粉D9020 g，葡萄糖4g，磷酸氢二钾0.75g，溶于1L超纯水中，用5MNaOH调pH＝7，121℃高温灭菌15min，冷却至常温，4℃储存备用。
照实施例1的方法将过夜培养的卷曲乳杆菌菌液用MRS培养基稀释至OD600＝1.5，按4％的接种量，接种至改良乳清培养基中，摇床120rpm，37℃培养32h。培养结束后，分离菌体，收集上清液，得到CFS，测得抑菌活性为47％。
实施例3改良的乳清培养基及培养方法
称取脱盐乳清粉D9022.5 g，葡萄糖4g，磷酸氢二钾0.75g，溶于1L超纯水中，用5MNaOH调pH＝7，121℃高温灭菌15min，冷却至常温，4℃储存备用。
照实施例1的方法将过夜培养的卷曲乳杆菌菌液用MRS培养基稀释至OD600＝1.5，按2％的接种量，接种至改良乳清培养基中，摇床120rpm，37℃培养24h。培养结束后，分离菌体，收集上清液，得到CFS，测得抑菌活性为49％。
实施例4培养基成分优化
选取乳清粉、磷酸氢二钾和葡萄糖作为培养基成分，进行培养基成分优化。
乳清粉浓度：
葡萄糖浓度定为4g/L，磷酸氢二钾浓度定为0.75g/L，分别称取一系列浓度梯度的乳清粉：10、12.5、15、17.5、20、22.5和25g/L。分别溶于1L超纯水中，用5M NaOH调pH＝7，随后121℃高温灭菌15min，冷却至常温，4℃储存备用。
照实施例1的方法将过夜培养的卷曲乳杆菌菌液用MRS培养基稀释至OD600＝1.5，按2％的接种量，接种至改良乳清培养基中，摇床120rpm，37℃培养24h。培养结束后，分离菌体，收集上清液，得到CFS，测抑菌活性，结果如图1，优选为20～25g/L，进一步优选为20～22.5g/L；
Figure BDA0003203228940000061
葡萄糖浓度：
磷酸氢二钾浓度定为0.75g/L，乳清粉浓度定为22.5g/L，分别称取一系列浓度梯度的葡萄糖：0、2、4、6和8g/L。分别溶于1L超纯水中，用5M NaOH调pH＝7，随后121℃高温灭菌15min，冷却至常温，4℃储存备用。
照实施例1的方法将过夜培养的卷曲乳杆菌菌液用MRS培养基稀释至OD600＝1.5，按2％的接种量，接种至改良乳清培养基中，摇床120rpm，37℃培养24h。培养结束后，分离菌体，收集上清液，得到CFS，测抑菌活性，结果如图2，葡萄糖源的浓度大于0小于或等于8g/L；优选为4～6g/L；
Figure BDA0003203228940000062
磷酸氢二钾：葡萄糖浓度定为4g/L，乳清粉浓度定为22.5g/L，分别称取一系列浓度梯度的磷酸氢二钾：0、0.5、0.75、1、1.25、1.5和2g/L。分别溶于1L超纯水中，用5M NaOH调pH＝7，随后121℃高温灭菌15min，冷却至常温，4℃储存备用。
照实施例1的方法将过夜培养的卷曲乳杆菌菌液用MRS培养基稀释至OD600＝1.5，按2％的接种量，接种至改良乳清培养基中，摇床120rpm，37℃培养24h。培养结束后，分离菌体，收集上清液，得到CFS，测抑菌活性，结果如图3，磷酸氢二钾浓度为0.5～0.75g/L具有更优的效果。
Figure BDA0003203228940000071
实施例5抑菌活性测试方法
为衡量CFS中类细菌素的产量，常常将产量高低转化成对指示菌株白色念珠菌抑制率的高低。采用微孔板法(①Wang Shuai,et al.,Frontiers in Microbiology,2017,8:564.②Parolin Carola,et al.,PLoS ONE,2015,10(6):e0131220)测试类细菌素的抑菌活性。选取白色念珠菌标准菌株(ATCC10231，广东省微生物保藏中心)作为念珠菌性阴道炎致病菌进行抑菌试验。白色念珠菌用YPD液体培养基过夜培养，将菌液稀释至OD600＝0.1，再将其稀释10倍得到菌浓为106CFU/mL的指示菌菌液备用。CFS初始平均pH为4左右，需用5MNaOH溶液调pH＝6.5。将白色念珠菌和CFS以每孔100μL的量分别接种到96孔板中进行培养，所有试验平行六个独立重复试验，37℃培养24h后用酶标仪于600nm记录每个孔的吸光度，按下式计算细菌生长抑制率：
Figure BDA0003203228940000072
其中ODCFS和ODcontrol分别为CFS样品组(100μL白色念珠菌菌液和100μL CFS)、对照组(100μL白色念珠菌菌液和100μL乳清培养基)的吸光度。
实施例6类细菌素性质实验
排除有机酸干扰实验：CFS用5M NaOH溶液调至pH＝6.5之后再按照实施例5测定抑菌活性。
排除过氧化氢影响实验：称取0.05g过氧化氢酶溶解于1mLpH＝7的0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液，加至上述调至中性的CFS中，使CFS中过氧化氢酶的终浓度为2mg/ml，37℃水浴2h，随后100℃高温加热10min使酶失活，最后测定抑菌活性。
酶解稳定性实验：分别称取0.05g木瓜蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶溶解于1mL pH＝7的0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液，分别称取0.05g蛋白酶K、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶溶解于1mLpH＝7.8的0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液，称取0.05g胃蛋白酶溶解于1mLpH＝2的0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液。在8个15ml离心管中各加入5ml CFS，并将pH调至每种酶的最适pH，再分别加入上述的7种酶液，使酶的终浓度为1mg/ml，37℃水浴2h，随后100℃高温加热10min使酶失活，最后测定抑菌活性，留下1支不加酶处理作为对照(control)。
温度稳定性实验：在7个15ml离心管中各加入5ml CFS，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、100℃、121℃下加热处理30min，留下一支作为空白对照不做任何处理。随后将CFS用5M NaOH溶液调至pH＝6.5，测定抑菌活性。
pH稳定性实验：在15个15ml离心管标中各加入5ml CFS，用5M NaOH溶液和盐酸溶液分别调节pH为1～14，室温下放置4h，留下一支作为空白对照不做任何处理。随后用5MNaOH溶液和盐酸溶液将CFS调至pH＝6.5，测定抑菌活性。
图4是有机酸和过氧化氢排除实验结果，用5M NaOH溶液调至pH＝6.5后，抑菌活性有所降低，说明CFS中的乳酸也有抑菌能力；用过氧化氢酶处理后，抑菌活性没有显著性差异，说明CFS中H2O2含量较少。通过排除掉有机酸和H2O2的影响，仍然有一定的抑制率，说明CFS中确实存在一种具有抑菌活性的物质，根据文献和现有研究推测是类细菌素物质。
图5是CFS用不同酶处理后抑菌活性变化情况，用淀粉酶和各种蛋白酶处理后，CFS的抑菌活性有不同程度的降低，说明类细菌素是一种糖蛋白或多肽类物质。
图6和图7是CFS的热稳定性和pH稳定性实验结果，经过40℃～100℃处理30min抑菌活性均无明显降低，121℃处理30min抑菌活性有显著性的降低，但仍有较高抑菌活性，说明类细菌素耐热性较好；pH＝1～14的范围内处理4h抑菌活性没有显著变化，说明类细菌素具有较好的酸碱稳定性。
对比例1MRS培养基
将过夜培养的卷曲乳杆菌菌液用MRS培养基稀释至OD600＝1.5，按2％的接种量，接种至MRS液体培养基中，摇床120rpm，37℃培养24h。培养结束后，分离菌体，得到CFS，用5MNaOH溶液调至pH＝6.5，按照实施例5的方法测得抑菌活性为21％。
对比例2
称取脱盐乳清粉D9022.5 g，蔗糖4g，磷酸氢二钾0.75g溶于1L超纯水中，用5MNaOH调pH＝7，121℃高温灭菌15min后冷却至常温，4℃储存备用。将过夜培养的卷曲乳杆菌菌液用MRS培养基稀释至OD600＝1.5，按2％的接种量，接种至上述培养基中，摇床120rpm，37℃培养24h。培养结束后，分离菌体，收集上清液，得到CFS，用5M NaOH溶液调至pH＝6.5，按照实施例5的方法测得抑菌活性为29％。
对比例3
称取细菌蛋白胨22.5g，葡萄糖4g，磷酸氢二钾0.75g溶于1L超纯水中，用5M NaOH调pH＝7，121℃高温灭菌15min后冷却至常温，4℃储存备用。将过夜培养的卷曲乳杆菌菌液用MRS培养基稀释至OD600＝1.5，按2％的接种量，接种至上述培养基中，摇床120rpm，37℃培养24h。培养结束后，分离菌体，收集上清液，得到CFS，用5M NaOH溶液调至pH＝6.5，按照实施例5的方法测得抑菌活性为12％。
对比例4
称取脱盐乳清粉D9022.5 g，葡萄糖4g，柠檬酸-柠檬酸钠(摩尔比为1：1)0.75g溶于1L超纯水中，用5M NaOH调pH＝7，121℃高温灭菌15min后冷却至常温，4℃储存备用。将过夜培养的卷曲乳杆菌菌液用MRS培养基稀释至OD600＝1.5，按2％的接种量，接种至上述培养基中，摇床120rpm，37℃培养24h。培养结束后，分离菌体，收集上清液，得到CFS，用5MNaOH溶液调至pH＝6.5，按照实施例5的方法测得抑菌活性为14％。
对比例5
称取脱盐乳清粉D9022.5 g，葡萄糖4g，磷酸氢二钾0.75g，吐温0.75g，蛋白胨5g溶于1L超纯水中，用5M NaOH调pH＝7，121℃高温灭菌15min后冷却至常温，4℃储存备用。将过夜培养的卷曲乳杆菌菌液用MRS培养基稀释至OD600＝1.5，按2％的接种量，接种至上述培养基中，摇床120rpm，37℃培养24h。培养结束后，分离菌体，收集上清液，得到CFS，用5MNaOH溶液调至pH＝6.5，按照实施例5的方法测得抑菌活性为32％。
对比例6
称取脱盐乳清粉D9022.5 g，葡萄糖4g，磷酸氢二钾0.75g溶于1L超纯水中，用5MHCl调pH＝5，121℃高温灭菌15min后冷却至常温，4℃储存备用。将过夜培养的卷曲乳杆菌菌液用MRS培养基稀释至OD600＝1.5，按2％的接种量，接种至上述培养基中，摇床120rpm，37℃培养24h。培养结束后，分离菌体，收集上清液，得到CFS，用5M NaOH溶液调至pH＝6.5，按照实施例5的方法测得抑菌活性为7％。

Claims (10)

1.一种提高卷曲乳杆菌类细菌素产量的发酵培养基，其特征在于，由乳清粉、葡萄糖和缓冲成分和水组成。
2.如权利要求1所述的提高卷曲乳杆菌类细菌素产量的发酵培养基，其特征在于，所述的乳清粉为脱盐乳清粉、乳清粉、甜乳清粉中的至少一种。
3.如权利要求2所述的提高卷曲乳杆菌类细菌素产量的发酵培养基，其特征在于，所述的乳清粉为脱盐乳清粉，其主要成分及重量含量分别为：
乳糖75～85％、蛋白质10～12％、脂肪1～2％、灰分4～6％；余量为水。
4.如权利要求1所述的提高卷曲乳杆菌类细菌素产量的发酵培养基，其特征在于，葡萄糖源为葡萄糖单糖或者能够在发酵过程转化成葡萄糖单糖的前体物质。
5.如权利要求1所述的提高卷曲乳杆菌类细菌素产量的发酵培养基，其特征在于，缓冲成分为弱酸、弱碱中的至少一种；
优选地，所述的弱酸为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠中的至少一种；
优选地，所述的弱碱为磷酸氢二钾、磷酸氢二钠中的至少一种。
6.如权利要求1～5任一项所述的提高卷曲乳杆菌类细菌素产量的发酵培养基，其特征在于，所述的发酵培养基中，所述的乳清粉的浓度为10～25g/L；优选为20～25g/L，进一步优选为20～22.5g/L；
葡萄糖源的浓度为大于0小于或等于8g/L；优选为2～6g/L，进一步优选为4～6g/L；
缓冲成分的浓度为0.5～0.75g/L，进一步优选为0.7～0.75g/L；
发酵培养基的初始pH为6.9～7.1。
7.如权利要求1所述的提高卷曲乳杆菌类细菌素产量的发酵培养基，其特征在于，所述的发酵培养基由脱盐乳清粉、葡萄糖、磷酸氢二钾和水组成，其中，脱盐乳清粉的浓度为20～22.5g/L；葡萄糖的浓度为4～6g/L；磷酸氢二钾的浓度为0.7～0.75g/L；发酵培养基的初始pH为6.9～7.1。
8.一种提高卷曲乳杆菌类细菌素产量的发酵方法，其特征在于，将卷曲乳杆菌接种在权利要求1～7任一项所述的发酵培养基中进行发酵培养，发酵后从其发酵液中分离卷曲乳杆菌类细菌素。
9.如权利要求8所述的提高卷曲乳杆菌类细菌素产量的发酵方法，其特征在于，卷曲乳杆菌的接种量为2％～4％。
10.如权利要求8所述的提高卷曲乳杆菌类细菌素产量的发酵方法，其特征在于，培养方式为摇床培养，其中摇床转速为110～130rpm；
优选地，培养温度为36～38℃；
优选地，发酵培养时间为24～36h。
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