CN113563352B

CN113563352B - 水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113563352B
Application number: CN202110846340.6A
Authority: CN
Inventors: 黎占亭; 张丹维; 刘鸿琨; 王辉; 周伟; 马达
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2021-07-27
Filing date: 2021-07-27
Publication date: 2022-08-19
Anticipated expiration: 2041-07-27
Also published as: CN113563352A

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体为一种作为神经肌肉阻滞剂拮抗剂的水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物及其制备方法和应用。本发明的水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物，是以葫芦[8]脲为原料，通过化学反应引入水溶性侧链基团而得到的，其疏水空腔可以通过疏溶剂相互作用在水相中与神经肌肉阻滞剂‑包括顺苯磺阿曲库铵、罗库溴铵、维库溴铵、泮库溴铵‑结合，达到拮抗目的。实验表明，水溶性葫芦[8]脲衍生物在生物体内可以高效地拮抗多种神经肌肉阻滞剂，普适性强，生物毒性低，是一种理想的神经肌肉阻滞剂拮抗剂。

Description

水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种能够对多种神经肌肉阻滞剂进行体内拮抗的新型拮抗剂水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物及其制备方法。

背景技术

神经肌肉阻滞剂：每年有超过4亿病人在手术室、重症监护室麻醉期间接受神经肌肉阻滞剂（neuromuscular blocking agents,NMBAs）或称肌松药（musclerelaxants）治疗。神经肌肉阻滞剂分为去极化型与非去极化型两类。去极化型神经肌肉阻滞剂与运动神经终板膜上的N2胆碱受体结合，使肌细胞对乙酰胆碱的反应减弱或消失；非去极化型神经肌肉阻滞剂能与乙酰胆碱竞争骨骼肌运动终板膜上的N2胆碱受体，导致骨骼肌松弛。临床使用的非去极化型神经肌肉阻滞剂又分为氨基甾类衍生物（罗库溴铵、维库溴铵、泮库溴铵等）和苄基异喹啉类衍生物（顺苯磺阿曲库铵、阿曲库铵、米库氯铵等）。

神经肌肉阻滞剂是全麻手术的辅助用药，随着全球手术量持续增加，神经肌肉阻滞剂的市场也不断扩大。其中，属于中时效神经肌肉阻滞剂的顺苯磺阿曲库铵由于其起效快、作用强、恢复速度快、不释放组胺、心血管副作用小、在体内无累积、代谢产物无毒无肌松效应等优势，在全球神经肌肉阻滞剂市场占比逾40%，在国内市场占比逾80%。此外，与顺苯磺阿曲库铵同属中时效神经肌肉阻滞剂的罗库溴铵、维库溴铵等，在全球神经肌肉阻滞剂市场占比30%左右，在国内市场占比为18%左右。

神经肌肉阻滞剂拮抗剂：为了加速患者在全麻手术后的肌肉功能恢复和避免残余神经肌肉阻滞及其副作用，在全麻手术后经常必要地逆转神经肌肉阻滞剂的生物活性，使患者尽快恢复。

传统的拮抗剂通过竞争性地抑制乙酰胆碱酶的作用，以提高神经肌肉接口处的乙酰胆碱浓度，从而使之恢复作用、逆转神经肌肉阻滞。然而，新斯的明等传统拮抗剂具有可能引发心血管副作用、逆转时间较长等缺点。

近年来，新型环糊精类拮抗剂舒更葡糖钠具有不良反应少、安全性高、拮抗效果好的临床优势。舒更葡糖钠可以通过超分子化学领域的去溶剂效应，在水相特异性地结合罗库溴铵和维库溴铵，有效地逆转与之对应的神经肌肉阻滞作用，因此其在全球销售市场占比迅速上升，但其临床上无法逆转顺苯磺阿曲库铵、泮库溴铵等诱导的神经肌肉阻滞。

遗憾的是，目前针对全球神经肌肉阻滞剂市场占比最高的顺苯磺阿曲库铵和长时效神经肌肉阻滞剂泮库溴铵导致的神经肌肉阻滞作用，仍在使用新斯的明等传统拮抗剂进行逆转，缺乏与之对应的特效拮抗药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物及其制备方法，以及作为神经肌肉阻滞拮抗剂的应用，将填补目前全球市场中针对顺苯磺阿曲库铵和泮库溴铵的特效拮抗剂的空缺，弥补广谱性特效神经肌肉阻滞剂拮抗剂的空缺。

本发明提供的水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物，以葫芦[8]脲大环结构单元为核心，大环上修饰有水溶性侧链取代基团，记为CB[8]-(Y_m)-n，n为侧链统计数目；其单元结构式为下式（Ⅰ）所示：

（Ⅰ）

其中，X=H或Y_m，Y_m=O(CH₂)_mSO₃Na，m=3或4；

CB [8]表示有8个这样的单元；式中，同一葫芦[8]脲骨架上的侧链位置互不影响，以统计学分布于葫芦[8]脲骨架腰间任一碳原子上。

本发明中，n在1-15范围，可控。这表示分子中X至少有一个是H，直至分子中X至少一个是侧链Ym。

本发明提供上述水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物的制备方法，由葫芦[8]脲氧化得到的羟基化葫芦[8]脲，再经过亲核取代反应获得，具体步骤为：

（1）葫芦[8]脲与过硫酸钾进行氧化还原反应，制备羟基化葫芦[8]脲，记为CB[8]-(OH)-n，通过调节过硫酸钾与葫芦[8]脲的化学计量比n，可以控制羟基化葫芦[8]脲混合物中羟基的统计数量；

（2）将羟基化葫芦[8]脲与叔丁醇钠进行质子交换反应，制备对应的氧负离子葫芦[8]脲；或通过羟基化葫芦[8]脲与强酸反应，制备对应的碳正离子葫芦[8]脲；然后通过加入不同的侧链修饰试剂，得到对应的水溶性葫芦[8]脲衍生物。

本发明提供的水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物，可用于制备神经肌肉阻滞剂的拮抗剂。

具体地，可以将水溶性葫芦[8]脲衍生物，以5%葡萄糖溶液为溶剂，配制成注射剂。溶液中，葫芦[8]脲衍生物的剂量为5 mg/mL-40 mg/mL。

这里，所述神经肌肉阻滞剂包括顺苯磺阿曲库铵、罗库溴铵、维库溴铵和泮库溴铵等。

本发明中，水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物为负离子大环材料，神经肌肉阻滞剂为含有疏水有机骨架的正离子型化合物，二者通过静电作用、疏水作用等多种相互作用结合，实现葫芦脲衍生物对神经肌肉阻滞剂的包结，使之丧失活性。

本发明通过化学修饰策略，构筑了具有高水溶性的含葫芦脲的大环主体分子CB[8]-(Y_m)-n。CB[8]-(Y_m)-n材料本身是对生物体低毒性的、高水溶性的分子，可以作为神经肌肉阻滞逆转剂，在水相和生物体内实现对多种神经肌肉阻滞剂的高效拮抗。

本发明对水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物进行了核磁滴定实验、紫外滴定实验、体内拮抗实验、细胞毒性实验、动物急性毒性实验。核磁滴定实验表明，本发明所述的水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物可以在水相中包结多种神经肌肉阻滞剂，具有明显的结合作用；紫外滴定实验表明，本发明所述的水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物与多种神经肌肉阻滞剂之间具有很强的结合作用能力，证明其具有拮抗的潜力；体内拮抗实验表明，本发明所述的水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物在生物体内可以以十分优异的效果逆转多种神经肌肉阻滞剂导致的肌肉松弛作用，是一类高效、普适性的神经肌肉阻滞逆转剂；细胞毒性实验表明，本发明所述的水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物在一定浓度对人体肝细胞（L-02）、大鼠心肌细胞（H9C2）具有低细胞毒性；生物毒性实验表明，本发明所述的水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物对以ICR小鼠为代表的动物模型，具有很低的动物急性毒性。

实验说明，这类新型高水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物作为一种低生物毒性的水溶性大环材料，通过在水相中的疏溶剂效应，实现对多种神经肌肉阻滞剂的高效体外结合以及快速的体内拮抗，属于一种普适性的拮抗剂，并且填补了目前针对市场占有率最高的顺苯磺阿曲库铵没有特效拮抗药的空白，其在神经肌肉阻滞逆转领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物合成路线。

图2为水溶性葫芦[8]脲衍生物分子CB[8]-(Y₃)-2核磁共振氢谱图。

图3为水溶性葫芦[8]脲衍生物分子CB[8]-(Y₃)-2与顺苯磺阿曲库铵（Cis）核磁滴定谱图（由上至下分别为顺苯磺阿曲库铵及逐渐滴入CB[8]-(Y₃)-2溶液后核磁共振氢谱图）。

图4为水溶性葫芦[8]脲衍生物CB[8]-(Y₃)-2（1 mM）、罗库溴铵（1 mM）以及CB[8]-(Y₃)-2（1 mM）和罗库溴铵（1 mM）1:1络合物核磁共振氢谱图。

图5为水溶性葫芦[8]脲衍生物CB[8]-(Y₃)-2（1 mM）、维库溴铵（1 mM）以及CB[8]-(Y₃)-2（1 mM）和维库溴铵（1 mM）1:1络合物核磁共振氢谱图。

图6为水溶性葫芦[8]脲衍生物CB[8]-(Y₃)-2（1 mM）、泮库溴铵（1 mM）以及CB[8]-(Y₃)-2（1 mM）和泮库溴铵（1 mM）1:1络合物核磁共振氢谱图。

图7a为水溶性葫芦[8]脲衍生物CB[8]-(Y₃)-2（1mM）与半硫酸原黄素（10 μM）在NaH₂PO₄缓冲溶液（10 mM, pH 7.4）中紫外-可见吸收光谱滴定图。

图7b为水溶性葫芦[8]脲衍生物CB[8]-(Y₃)-2（1mM）与半硫酸原黄素（10 μM）在NaH₂PO₄缓冲溶液（10 mM, pH 7.4）中紫外-可见吸收滴定拟合图。其中，图中所取点为每次滴定对应紫外-可见吸收光谱与初始光谱443.5 nm处吸光度差值绝对值；图中拟合线为1:1结合模型对应的非线性拟合曲线（K_a = (1.44 ± 0.35) × 10⁶）。

图8a为水溶性葫芦[8]脲衍生物CB[8]-(Y₃)-2（9 μM）、半硫酸原黄素（10 μM）在NaH₂PO₄缓冲溶液（10 mM, pH 7.4）中与顺苯磺阿曲库铵（500 μM）紫外-可见吸收光谱滴定图。

图8b为水溶性葫芦[8]脲衍生物CB[8]-(Y₃)-2（9 μM）、半硫酸原黄素（10 μM）在NaH₂PO₄缓冲溶液（10 mM, pH 7.4）中与顺苯磺阿曲库铵（500 μM）紫外-可见吸收滴定拟合图。其中，图中所取点为每次滴定对应紫外-可见吸收光谱与初始光谱443.5 nm处吸光度差值绝对值；图中拟合线为1:1结合模型对应的非线性拟合曲线（K_a = (1.08 ±0.36) ×10⁷）。

图9a为水溶性葫芦[8]脲衍生物CB[8]-(Y₃)-2（9 μM）、半硫酸原黄素（10 μM）在NaH₂PO₄缓冲溶液（10 mM, pH 7.4）中与罗库溴铵（500 μM）紫外-可见吸收光谱滴定图。

图9b为水溶性葫芦[8]脲衍生物CB[8]-(Y₃)-2（9 μM）、半硫酸原黄素（10 μM）在NaH₂PO₄缓冲溶液（10 mM, pH 7.4）中与罗库溴铵（500 μM）紫外-可见吸收滴定拟合图。其中，图中所取点为每次滴定对应紫外-可见吸收光谱与初始光谱443.5 nm处吸光度差值绝对值；图中拟合线为1:1结合模型对应的非线性拟合曲线（K_a = (1.97 ± 0.47) × 10⁷）。

图10a为水溶性葫芦[8]脲衍生物CB[8]-(Y₃)-2（9 μM）、半硫酸原黄素（10 μM）在NaH₂PO₄缓冲溶液（10 mM, pH 7.4）中与维库溴铵（500 μM）紫外-可见吸收光谱滴定图。

图10b为水溶性葫芦[8]脲衍生物CB[8]-(Y₃)-2（9 μM）、半硫酸原黄素（10 μM）在NaH₂PO₄缓冲溶液（10 mM, pH 7.4）中与维库溴铵（500 μM）紫外-可见吸收滴定拟合图。其中，图中所取点为每次滴定对应紫外-可见吸收光谱与初始光谱443.5 nm处吸光度差值绝对值；图中拟合线为1:1结合模型对应的非线性拟合曲线（K_a = (2.15 ± 0.43) × 10⁷）。

图11a为水溶性葫芦[8]脲衍生物CB[8]-(Y₃)-2（9 μM）、半硫酸原黄素（10 μM）在NaH₂PO₄缓冲溶液（10 mM, pH 7.4）中与泮库溴铵（500 μM）紫外-可见吸收光谱滴定图。

图11b为水溶性葫芦[8]脲衍生物CB[8]-(Y₃)-2（9 μM）、半硫酸原黄素（10 μM）在NaH₂PO₄缓冲溶液（10 mM, pH 7.4）中与泮库溴铵（500 μM）紫外-可见吸收滴定拟合图。其中，图中所取点为每次滴定对应紫外-可见吸收光谱与初始光谱443.5 nm处吸光度差值绝对值；图中拟合线为1:1结合模型对应的非线性拟合曲线（K_a = (1.72 ± 0.42) × 10⁷）。

图12为水溶性葫芦[8]脲衍生物CB[8]-(Y₃)-2和CB[8]-(Y₄)-2体内逆转顺苯磺阿曲库铵诱导的神经肌肉阻滞效果图。

图13为水溶性葫芦[8]脲衍生物CB[8]-(Y₃)-2体内逆转罗库溴铵诱导的神经肌肉阻滞效果图。

图14为水溶性葫芦[8]脲衍生物CB[8]-(Y₃)-2体内逆转维库溴铵诱导的神经肌肉阻滞效果图。

图15为水溶性葫芦[8]脲衍生物CB[8]-(Y₃)-2体内逆转泮库溴铵诱导的神经肌肉阻滞效果图。

图16为水溶性葫芦[8]脲衍生物CB[8]-(Y₃)-2对L-02细胞毒性实验图。

图17为水溶性葫芦[8]脲衍生物CB[8]-(Y₃)-2对H9C2细胞毒性实验图。

图18为水溶性葫芦[8]脲衍生物CB[8]-(Y₃)-2对ICR小鼠急性毒性实验图。

具体实施方式

下面通过实施例进一步描述本发明，而不应理解为对本发明的限制。

实施例1：水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物的制备。其反应路线如图1所示。

水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物的结构示意图（见图1），其中，以CB[8]-(Y₃)-2分子为例说明水溶性葫芦[8]脲衍生物制备过程。参照文献报道（J. Am. Chem. Soc.2003,125,10186-10187），以2倍当量过硫酸钾氧化葫芦[8]脲，得到相应的羟基化葫芦[8]脲CB[8]-(OH)-2，其与强碱进行质子交换反应，得到对应氧负离子葫芦[8]脲，随后通过亲核取代反应得到侧链修饰的葫芦[8]脲。具体操作为：分别称取CB[8]-(OH)-2（1.362 g, 1mmol），叔丁醇钠（1.922 g, 20 mmol）并均匀分散在二甲基亚砜（140 mL）中，体系在氮气氛围下室温搅拌反应2小时，随后向体系内滴加丙烷磺内酯溶液（3.66 g, 30 mmol，溶于35mL二甲基亚砜），加热至80 ℃反应24小时。反应结束后，真空除去溶剂，加入20 mL去离子水并滴加饱和氢氧化钠溶液使溶液pH大于10。随后将所得溶液置于透析袋中（截留分子量1000，展开宽度38 mm）进行透析，至透析袋外液中无析出物后，旋转蒸发除去透析袋内溶液溶剂，干燥后得到淡黄色固体（199 mg, 15%），通过元素分析测定其侧链统计数量为2.36，其核磁共振氢谱见图2。¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ 6.16-5.25 (32 H), 4.64-3.89(16H), 3.81-3.24 (7H), 3.15-2.68 (7H), 2.40-1.60 (7H)。

CB[8]-(Y₄)-2分子的制备过程与CB[8]-(Y₃)-2分子相似。具体操作为：分别称取CB[8]-(OH)-2（1.362 g, 1 mmol），叔丁醇钠（1.922 g, 20 mmol）并均匀分散在二甲基亚砜（140 mL）中，体系在氮气氛围下室温搅拌反应2小时，随后向体系内滴加1,4-丁烷磺内酯溶液（4.08 g, 30 mmol，溶于35 mL二甲基亚砜），加热至80 ℃反应24小时。反应结束后，真空除去溶剂，加入20 mL去离子水并滴加饱和氢氧化钠溶液使溶液pH大于10。随后将所得溶液置于透析袋中（截留分子量1000，展开宽度38 mm）进行透析，至透析袋外液中无析出物后，旋转蒸发除去透析袋内溶液溶剂，干燥后得到淡黄色固体。

实施例2：水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物与神经肌肉阻滞剂核磁滴定实验。

以CB[8]-(Y₃)-2分子与顺苯磺阿曲库铵在重水中核磁滴定实验为例说明本发明所述的水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物与神经肌肉阻滞剂在水相中核磁滴定实验过程。具体操作为：分别配制顺苯磺阿曲库铵（1 mM）和CB[8]-(Y₃)-2（5 mM）的重水溶液，向顺苯磺阿曲库铵溶液中按比例逐渐滴入CB[8]-(Y₃)-2溶液，并测定每一次滴加后溶液体系的核磁共振氢谱（见图3）。该研究表明，本发明所述的水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物与神经肌肉阻滞剂结合后，后者特征核磁峰发生化学位移改变、分辨率降低（见图3~图6），这说明在水相中水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物与神经肌肉阻滞剂能够发生相互作用，有效地形成对应络合物。

实施例3：水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物与神经肌肉阻滞剂结合常数的测定实验。

以CB[8]-(Y₃)-2分子与顺苯磺阿曲库铵的结合常数测定为例，说明水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物与神经肌肉阻滞剂结合常数测定实验过程。我们使用竞争法通过紫外-可见吸收光谱滴定对其进行测试，该滴定中所有溶液均以NaH₂PO₄缓冲液（10 mM, pH=7.4）作为溶剂进行，经过两步滴定完成。具体操作为：第一步，我们选择半硫酸原黄素作为竞争客体，分别配制10 μM半硫酸原黄素溶液A、500 μMCB[8]-(Y₃)-2和10 μM半硫酸原黄素混合溶液B，在石英比色皿中加入2 mL上述溶液A并逐渐滴入上述混合溶液B，测定每一次滴加后溶液体系的紫外-可见吸收光谱（见图7a），滴定完成后将所得数据进行非线性拟合（见图7b），得到CB[8]-(Y₃)-2与半硫酸原黄素的结合常数为(1.44±0.35) × 10⁶。第二步，我们分别配制10 μM 半硫酸原黄素和9 μM CB[8]-(Y₃)-2的混合溶液C以及10 μM 半硫酸原黄素、9 μM CB[8]-(Y₃)-2和500 μM顺苯磺阿曲库铵的混合溶液D，在石英比色皿中加入2 mL上述混合溶液C并逐渐滴入上述混合溶液D，测定每一次滴加后溶液体系的紫外-可见吸收光谱（见图8a），滴定完成后将所得数据进行非线性拟合（见图8b），得到CB[8]-(Y₃)-2与顺苯磺阿曲库铵的结合常数为(1.08±0.36) × 10⁷。CB[8]-(Y₃)-2与罗库溴铵（K_a=(1.97±0.47) × 10⁷）、维库溴铵（K_a = (2.15 ± 0.43) × 10⁷）、泮库溴铵（K_a = (1.72 ±0.42) × 10⁷）在缓冲体系中的结合常数也为10⁷数量级（见图9~图11）。这一研究表明水溶性葫芦[8]脲衍生物与多种神经肌肉阻滞剂在缓冲体系内具有很强的结合作用，说明其具有可应用于逆转神经肌肉阻滞的潜力。

实施例4：水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物体内逆转神经肌肉阻滞实验。

以CB[8]-(Y₃)-2分子在SD大鼠体内逆转顺苯磺阿曲库铵引发的神经肌肉阻滞为例，说明水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物在生物体内逆转神经肌肉阻滞实验的过程。具体操作过程为：选择体重为170至240克的SD大鼠作为生物模型对CB[8]-(Y₃)-2逆转效果进行测试（每组实验分别选用三只雄鼠和三只雌鼠，测试过程中神经肌肉阻滞剂注射液使用生理盐水作为溶剂配制，所有注射操作均在5秒内完成）；使用异氟烷对大鼠进行麻醉，诱导麻醉剂量为4%、维持麻醉剂量为1%；使用10% Na₂S溶液脱去小鼠右后腿及附近毛发；将导气管插入大鼠气管内并联通小动物呼吸机，潮气量设置为8、频率设置为80；使用肌松监测仪测试大鼠股四头肌神经肌肉阻滞情况，其中将传感器固定于大鼠胫骨部、电极通过贴片固定于大鼠右后腿部，随后使用Cal模式进行校准，至数据稳定后切换至TOF模式，若TOF数据稳定≥90，则进行下一步实验；通过尾静脉向大鼠注射顺苯磺阿曲库铵溶液并开始计时，剂量为0.6 mg/kg，随后记录TOF值变化；TOF值降低至0后，向大鼠注射CB[8]-(Y₃)-2注射液，并记录注射时间，随后记录TOF值变化，记录其恢复至≥ 90的时间作为神经肌肉阻滞逆转时间。实验结果表明，CB[8]-(Y₃)-2对顺苯磺阿曲库铵有很好的体内拮抗效果，当CB[8]-(Y₃)-2注射剂量分别为40、60、80、100 mg/kg时，平均逆转时间分别为168.4秒、60秒、31.5秒、29秒；而当CB[8]-(Y₄)-2注射剂量为80 mg/kg时，平均逆转时间为22.8秒（见图12）。这一研究表明水溶性葫芦[8]脲衍生物可以在体内以优异的效果逆转由顺苯磺阿曲库铵（见图12）、罗库溴铵（见图13）、维库溴铵（见图14）、泮库溴铵（见图15）、苯磺酸阿曲库铵、哌库溴铵诱导的神经肌肉阻滞；与市售试剂新斯的明相比，其逆转顺苯磺阿曲库铵、罗库溴铵、维库溴铵、泮库溴铵诱导的神经肌肉阻滞效率分别提高了6倍、20倍、21倍、115倍；与市售试剂舒更葡糖钠相比，其可以快速逆转舒更葡糖钠临床无法逆转的顺苯磺阿曲库铵、泮库溴铵诱导的神经肌肉阻滞，其逆转罗库溴铵、维库溴铵诱导的神经肌肉阻滞效率与舒更葡糖钠相当。

实施例5：水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物的细胞毒性实验。

以CB[8]-(Y₃)-2为例说明水溶性葫芦[8]脲衍生物的细胞毒性实验过程。通过细胞计数试剂盒Cell Counting Kit-8(CCK-8)，我们利用正常肝细胞（L-02）和大鼠心肌细胞（H9C2）作为模型研究CB[8]-(Y₃)-2的体外细胞毒性。结果显示在CB[8]-(Y₃)-2样品含量分别为100 μg/mL和200μg/mL时，L-02细胞的存活率可以维持在近100%和90.1%（见图16），H9C2细胞的存活率可以维持在90.3%和75.3%（见图17）。这一研究表明水溶性葫芦[8]脲衍生物具有较低的体外细胞毒性。

实施例6：水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物的动物急性毒性实验。

以CB[8]-(Y₃)-2药物对ICR小鼠的急性毒性实验为例，说明水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物的动物急性毒性实验过程。具体操作过程为：我们选择体重为18至24克的ICR小鼠作为生物模型对CB[8]-(Y₃)-2的生物毒性进行测试（每组实验分别选用三只雄鼠和三只雌鼠）；称量并记录小鼠初始体重；通过尾静脉向小鼠一次性注射CB[8]-(Y₃)-2注射液，剂量分别为0mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg、320 mg/kg、480 mg/kg、960 mg/kg，注射体积控制在0.2-0.5 mL，注射时间为60秒；随后每24小时称量并记录小鼠体重，持续记录14天（见图18）。这一研究表明水溶性葫芦[8]脲衍生物结构对动物有较低的急性毒性，在高达960 mg/kg剂量下（12倍于有效剂量）未出现动物死亡，证明其是一种生物安全性的体内神经肌肉阻滞逆转剂。

Claims

1.一种作为神经肌肉阻滞剂拮抗剂的水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物，其特征在于，以葫芦[8]脲大环结构单元为核心，大环上修饰有水溶性侧链取代基团，记为CB[8]-(Y_m)-n，n为侧链Y_m统计数目；其单元结构式为下式（Ⅰ）所示：

（Ⅰ）

其中，X=H或Y_m，Y_m=O(CH₂)_mSO₃Na，m=3或4，n在1-15范围；

式中，同一葫芦[8]脲骨架上的侧链位置互不影响，以统计学分布于葫芦[8]脲骨架腰间任一碳原子上。

2.如权利要求1所述的水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物的制备方法，其特征在于，由葫芦[8]脲氧化得到的羟基化葫芦[8]脲，再经过亲核取代反应获得，具体步骤为：

（2）将羟基化葫芦[8]脲与叔丁醇钠进行质子交换反应，制备对应的氧负离子葫芦[8]脲；然后通过加入不同的侧链修饰试剂，得到对应的水溶性葫芦[8]脲衍生物。

3.如权利要求1所述的水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物在制备神经肌肉阻滞剂的拮抗剂中的应用；所述神经肌肉阻滞剂包括顺苯磺阿曲库铵、罗库溴铵、维库溴铵和泮库溴铵。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将水溶性葫芦[8]脲磺酸盐衍生物与5%葡萄糖溶液，配制成注射剂；葫芦[8]脲磺酸盐衍生物的含量为5 mg/mL-40 mg/mL。