CN113387798A - 用作逆转神经肌肉阻滞剂的水溶性柱[n]芳烃及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用作逆转神经肌肉阻滞剂的水溶性柱[n]芳烃及其应用，利用水溶性柱[n]芳烃特异性识别十烃季铵在小鼠体内实现肌松逆转效果。本发明中提供的柱芳烃具有良好的溶解性和生物相容性，能够和十烃季铵形成稳定的主客体复合物，其在PBS缓冲溶液中有很高的结合力。在本发明中水溶性柱[n]芳烃能在动物模型上有效地逆转十烃季铵诱导的肌松状态，通过考察C10的药物代谢情况，阐明水溶性柱[n]芳烃能通过主客体包结的方式加速血液中C10清除，有效地解决了骨骼肌松后不能快速恢复正常状态的问题。水溶性柱[n]芳烃作为一种潜在的十烃季铵麻醉逆转剂，改善了十烃季铵的临床使用效果，也为超分子在生物医学领域的应用提供了一个新的思路。

Description

用作逆转神经肌肉阻滞剂的水溶性柱[n]芳烃及其应用

技术领域

本发明涉及临床麻醉领域，具体涉及一种水溶性柱芳烃逆转骨骼肌松药(十烃季铵)诱导的神经肌肉阻滞应用的技术领域。

背景技术

肌松药用于临床麻醉，通过肌肉松弛满足手术的要求。因此，肌松药已成为临床手术前全身麻醉时重要的辅助用药。N_M胆碱受体阻断药称为骨骼肌松驰药，能选择性地作用于运动神经终极板膜上的N_M受体，阻断神经冲动向骨骼肌传递，导致肌肉松弛。通常肌松药按其作用机制不同，可分为去极化型和非极化型两大类。在1948年，Paton和Zaimis找到了一种与筒箭毒碱效果相似的类似物—聚甲基化的双季铵盐，化学通式为(CH₃)₃N(CH₂)_nN(CH₃)₃，当n＝10时，具有最好的神经肌肉阻滞效果。该化合物的名称为十烃季铵(syncurine)，是第一个被发现的去极化药物。

由于十烃季铵合成简单，价格低廉且麻醉效果是D型筒箭毒碱的2～3倍。研究表明静脉注射十烃季铵后，不会降低动脉血压，体内为发生代谢转化；注射后24小时内，大部分药物都随着尿液排泄出来，途径单一且稳定。临床手术常需要麻醉持续时间较短的药物，而D型筒箭毒碱的药效长，恢复慢，在手术过程中常会重复给药或增加剂量，为了病患的安全在术后需要及时恢复肌松。目前尚未开发出特异高效的拮抗剂，严重限制了其在临床上的应用。

超分子通常指由两种或两种以上分子依靠分子间相互作用结合在一起，组成复杂的、有组织的聚集体，并保持一定的完整性使其具有明确的微观结构和宏观特性。其中已报道应用大环化合物，其环糊精，葫芦脲类大环化合物已经应用于麻醉剂催醒。舒更葡糖钠是一种γ-环糊精衍生物，经FDA批准已广泛应用于临床手术中。近几年大环超分子包封对现代纳米医学产生了更强大的影响，从而对广泛的范围产生了高度的疗效。特别是水溶性柱芳烃，它是由对苯二酚或对苯二酚醚通过亚甲基桥在苯环的对位连接而成的一类新型的大环主体分子，拥有富电子的空腔结构，能够特异性识别尺寸匹配的缺电子客体，进一步通过简单的功能化修饰即可得到水溶性良好的衍生物。到目前为止，柱芳烃已经用于生物治疗，且能够从动物模型和人体模型中去除有害物质。但目前尚未出现有关将柱芳烃应用于快速恢复肌肉松弛的相关报道。

发明内容

为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种用作逆转神经肌肉阻滞剂的水溶性柱[n]芳烃及其应用，将水溶性柱[n]芳烃作为一种十烃季铵的逆转剂，利用超分子主客体作用，包裹体内十烃季铵，加速代谢，降低十烃季铵在血液里面的浓度，实现快速恢复肌肉松弛的目的。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用作逆转神经肌肉阻滞剂的水溶性柱[n]芳烃，用于逆转骨骼肌松药溴化十烃季铵，n为5或6；所述水溶性柱[n]芳烃的结构通式为如下式I，所述骨骼肌松药溴化十烃季铵为式II:

优选地，本发明用作逆转神经肌肉阻滞剂的水溶性柱[n]芳烃，n为6，水溶性柱[6]芳烃的结构通式为：

优选地，本发明用作逆转神经肌肉阻滞剂的水溶性柱[n]芳烃在PBS缓冲溶液中以不低于10⁷M^-1的结合常数结合溴化十烃季铵。

一种本发明用作逆转神经肌肉阻滞剂的水溶性柱[n]芳烃的应用，利用水溶性柱[n]芳烃逆转十烃季铵神经肌肉阻滞，采用静脉注射、口服、皮下注射方式中的至少一种给药方式进行实施。进一步优选地，最佳采用静脉注射给药方式进行实施。

优选地，本发明用作逆转神经肌肉阻滞剂的水溶性柱[n]芳烃的应用，最佳的给药量为：选择主客体部分研究的1:1的质量浓度比进行给药。其中水溶性柱[n]芳烃和十烃季铵分别为主客体物质。十烃季铵穿插进入了水溶性柱[n]芳烃空腔内，形成了主客体复合物。

优选地，将水溶性柱[n]芳烃溶于水溶液、PBS溶液、无菌注射液中的至少一种溶剂中，作为神经肌肉阻滞剂进行使用。进一步优选地，最好将水溶性柱[n]芳烃溶于PBS溶液中，作为神经肌肉阻滞剂进行使用。

本发明术语“超分子主客体作用”指的是分子间的相互作用，包括静电作用、氢键、范德华力和疏水作用等，是研究超分子化学的基础。本发明术语“水溶性柱[n]芳烃”英文缩写为CPnA。本发明术语“水溶性单体”英文缩写为CM,结构式如下式：

本发明研究发现CP6A在PBS缓冲溶液中能以不低于10⁷M^-1的结合常数结合十烃季铵，并且在本发明的小鼠模型研究中表现出优异的生物相容性。因此，本发明假设CP6A能作为一种十烃季铵拮抗剂逆转小鼠麻醉。

本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：

1.本发明提出了用CP6A包裹过量的C10来逆转麻醉效果的策略，本发明研究发现CP6A与C10在PBS溶液有很高的结合力，并且在在小鼠模型研究中表现出优异的生物相容性；研究中CP6A逆转了小鼠模型的麻醉，证明CP6A能通过血液浓度降低血液中的C10，有效地解决了麻醉后不能快速恢复正常状态的问题；

2.本发明利用超分子主客体作用，包裹体内十烃季铵，加速代谢，降低十烃季铵在血液里面的浓度，实现快速恢复肌肉松弛的目的；

3.本发明水溶性柱[n]芳烃能作为潜在的麻醉逆转剂，这为十烃季铵的利用提供了巨大的可能性，也为超分子治疗提供了一个新方向。

附图说明

图1：CP6A和十烃季铵(C10)作用的¹HNMR图谱。其中(A)C10；(B)CP6A+C10；(C)CP6A；D₂O，2mM。

图2：CP6A和单体(CM)作用的¹H-NMR图谱。其中(A)C10；(B)CM+C10；(C)M；D₂O，12mM。

图3：CP6A和十烃季铵(C10)作用的Job’s曲线图。

图4：CP6A和十烃季铵(C10)在25℃下，PBS中的1:1拟合ITC图谱。

图5：化合物:CP6A对小鼠成纤维细胞的毒性评价图。

图6：注射CP6A后，小鼠主要器官切片图。

图7：注射十烃季铵后，静脉注射PBS，CM和CP6A小鼠的恢复时间对比图。

图8：建立十烃季铵在老鼠血浆中的标准曲线图。

图9：静脉注射PBS和CP6A，120s和480s时的C10血药浓度对比图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体条技术或条件的，按照本领域内文献所描述的常规技术或条件和制造商建议的技术或条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：

实施例一：

在本实施例中，CP6A与C10和CM的核磁1:1表征：

1.实验样品：

本实施例选用水溶性柱[6]芳烃(CP6A)和水溶性单体(CM)与十烃季铵(C10)作为研究对象。

溴化十烃季铵由TCI公司提供：

2.实验方法：

准确称取1.96mg水溶性柱[6]芳烃(CP6A)和1.96mg单体(CM)，分别和0.5mg十烃季铵(C10)溶于0.6mL重水中，混合均匀形成复合物。将所得复合物、水溶性柱[6]芳烃(CP6A)，单体(CM)以及十烃季铵溶于重水中，进行核磁测试。

3.实验结果：

如下面的图1、图2所示。

结果表明，核磁结果表明单体对C10没有络合作用，而CP6A却对C10却明显的形成了主客体复合物。图1显示，客体中质子H_a,H_b,H_c,H_d,H_e,H_f的化学位移均移向高场，峰型加宽甚至消失。同时CP6A的主体分子的质子H₁,H₂,H₃均向低场移动，移动距离分别为H₁Δδ＝0.13,H₂Δδ＝0.01,H₃Δδ＝0.14。这些现象表明C10穿插进入了CP6A空腔内，形成了主客体复合物。C10由于包结在CP6A空腔中受到屏蔽效应导致了质子峰向高场移动以及峰加宽效应。同时由于去屏蔽效应，CP6A的质子峰移向低场。值得注意的是H_c,H_d,H_e,H_f的化学位移变化最为明显，由于可以推断CP6A是包结在C10中间的位置。

实施例二：

在本实施例中，CP6A与C10的ITC滴定表征：

1、实验样品：

本发明选用水溶性柱[6]芳烃(CP6A)与十烃季铵(C10)作为研究对象。

溴化十烃季铵由TCI公司提供

2、实验方法：

恒温ITC用于所有微量热量实验。所有滴定涉及研究CP6A和十烃季铵的滴定都在磷酸盐缓冲水溶液中298.15K和大气压下进行。在滴定实验之前，使用制造商提供的ThermoVac附件将每个样品脱气并恒温。每个ITC实验进行25次连续注射。第一次注射是2ul；然后，将恒定体积(10uL/注射)的客体溶液(1mM)注射到填充有CP6A溶液(0.10mM)的池子中。每次滴定C10都会产生反应热曲线，正如预期的那样，会形成CP6A–C10络合物。通过将客体溶液注入纯缓冲溶液中进行对照实验以测量稀释热。从滴定实验中确定的热量中减去稀释热，得到净反应热。这提供了缔合常数(K_a)，标准摩尔反应焓(ΔH^o)和熵变(ΔS^o)。然后通过Job’_S曲线，判断CP6A和C10的主客体包结配位的化学计量比。

3、实验结果：

如下面的图3、图4所示。

CP6A和C10通过Job’_S分析验证1:1结合化学计量后，通过等温滴定量热法(ITC，图2)评估热力学参数，ITC研究在磷酸盐缓冲水溶液(PBS)中进行。pH＝7.4。使用摩尔比图支持的1:1结合模型，缔合常数为K_a＝(1.19±0.05)×10⁷M^-1。ΔH:-47.72kJ/mol,ΔG:-40.44kJ/mol,-TΔS:7.49kJ/mol)

实施例三：

在本实施例中，CP6A的细胞毒性测试：

1、实验样品：

小鼠成纤维细胞L929由北京协和细胞库提供

2、实验方法：

细胞培养：L929细胞用DMEM培养基(含有10％FBS,1％青霉素/链霉素)，在5％CO₂，37℃恒温下培养。CP6A溶于PBS制备成溶液。收集对数期生长的细胞，调整细胞悬液浓度，将细胞悬浮液接种于96孔板，铺板使待测细胞密度至约10000/孔，每孔100μL细胞悬液，在5％CO₂，37℃恒温下孵育24h，待用。

细胞毒性测试：将96孔板里的培养基吸出，然后加入90μL的培养基和10μL的CP6A样品溶液，使得样品混合后浓度分别为320μM、160μM、80μM、40μM、20μM、10μM、5μM，每个样品浓度5个平行孔，在最后的5个孔内分加PBS作为空白对照。将培养板放置于5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养。24小时后，取出培养板，无菌条件下吸出板中的培养基，每孔加入90μL的PBS和10μL的CCK-8溶液，继续孵育0.5h。在酶标仪450nm处检测各孔的吸收值。

3、实验结果：

如图5所示，结果表明，所有的样品在CP6A 320μM浓度下对于L929细胞而言，其细胞存活率在90-92％

实施例四：

在本实施例中，CP6A的生物相容性测试：

1、实验样品：

18-22g的雌性昆明鼠由北京斯贝福提供

2、实验方法：

18-22g雌性昆明小鼠被随机分成两组(每组n＝6)。一组小鼠静脉注射CP6A,一组小鼠静脉注射PBS给药做为对照组。每组老鼠每天都要称重，并每天观察他们的行为是否有任何迹象可能患病。14天后，收集主要器官包括心脏，肝脏，肾脏，肺和脾脏。然后制备主要器官切片并染色用苏木精-伊红(H&E)进行组织病理学检查分析。

3、实验结果：

如图6所示，结果表明主要器官的组织病理学分析显示没有明显的损伤，CP6A有很好的生物相容性。

实施例五：

在本实施例中，小鼠麻醉模型的建立：

1、实验样品：

18-22g的雌性昆明鼠由北京斯贝福提供

2、实验方法：

利用疲劳转棒仪(YLS-4C)构建小鼠骨骼肌松模型。首先将雌性昆明鼠提前在疲劳转棒仪上连续训练两天，每次训练时间15分钟，每天不同时间段训练五次。选定训练合格的老鼠，打入肌松药，判断如果30秒内连续跌落3次，则表明出现肌松作用。在静脉注射0.691mg kg^-1C10剂量下，小鼠很快出现肌松作用。所以本实施例设置了三个组，每组十只老鼠，随机分配，在静脉注射肌松药C10一分钟后，分别静脉注射PBS，CM和CP6A。

3、实验结果：

如图7所示，本实施例发现，在PBS和CM组，小鼠大约在480s左右恢复肌松，而CP6A组的小鼠大约在120s左右恢复肌松。在行为学上表明CP6A很可能是作为一种解毒剂，使小鼠快速恢复肌松。

实施例六：

在本实施例中，C10体内代谢研究分析：

1、实验样品：

普萘洛尔购买于中国食品药品鉴定研究院。

2、实验方法：

本实施例进行了体内的C10药物代谢实验。首先，先进行LC-MS/MS的方法建立。分别取十烃季铵和内标普萘洛尔的储备溶液，用甲醇稀释至20ng mL^-1,进行方法学的建立。将LC-20AD液相串联API5000型液质联用系统液相与质谱分开，设定为MS only模式，采用正离子扫描模式，由于溴化的十烃季铵的对称结构，生成双电荷离子[M]²⁺,十烃季铵的相对分子质量为258，生成双电荷母离子为128.7Da和子离子198.5Da，由于母离子强度大，所以采用128.7Da作为定性定量分析。在经观察分离效果，色谱峰型等指标，最终选取峰形和分离度最佳的PHC₁₈柱进行色谱柱分离。为了提高分析通量，直接蛋白质沉淀法用于样品制备。取45μL血浆样品，加入150μL含内标普萘洛尔(20ng mL^-1)的乙腈，加入5μL不同浓度的C10工作溶液，使小鼠血浆样品中C10浓度分别为20，50，100，200，500，1000，2000ng mL^-1。同时制备双空白血浆样品(DB)和仅含内标(CB)的血浆样品，并确定20-2000ng mL^-1的小鼠标准曲线浓度范围。涡旋并混合1分钟，以13000×g离心10分钟，并定量100μL上清液。成功确定小鼠体内血浆动力学标准曲线范围是20-2000ng mL^-1。

标曲建立好了后，将雌性昆明小鼠随机分为两组，每组三只，静脉注射0.691mgkg^-1的C10，小鼠迅速出现肌松，在60s时静脉注射PBS/CP6A，分别在120s和480s时进行眼眶采血，用肝素管收集，然后使用高速冷冻离心机离心，取上层清液加入空白乙腈和内标，进样分析。

3、实验结果：

如图8、图9所示，在120s左右时，PBS组C10的浓度大约是1500ng mL^-1远远大于CP6A组的500ng mL^-1浓度。在120s的时候，CP6A组的小鼠的血浆浓度基本上就恢复到小鼠480s的浓度。在480s时PBS组和CP6A组无统计学差距。由于可以表明CP6A可以快速清除C10。

实施例七：

在本实施例中，一种用作神经肌肉阻滞剂的水溶性柱[5]芳烃，用于逆转骨骼肌松药溴化十烃季铵，其中水溶性柱[5]芳烃和十烃季铵分别为主客体物质。十烃季铵穿插进入了水溶性柱[5]芳烃空腔内，形成了主客体复合物。

综上所述，上述实施例利用水溶性柱[n]芳烃特异性识别十烃季铵在小鼠体内实现肌松逆转效果。本发明上述实施例中提供的柱芳烃CP6A具有良好的溶解性和生物相容性，能够和十烃季铵形成稳定的主客体复合物，其在PBS缓冲溶液中有很高的结合力。在本发明中CP6A可以在动物模型上有效地逆转十烃季铵诱导的肌松状态，通过考察C10的药物代谢情况，阐明CP6A可以通过主客体包结的方式加速血液中C10清除，有效地解决了骨骼肌松后不能快速恢复正常状态的问题。水溶性柱[n]芳烃，尤其是水溶性柱[6]芳烃作为一种潜在的十烃季铵麻醉逆转剂，改善了十烃季铵的临床使用效果，也为超分子在生物医学领域的应用提供了一个新的思路。

上面结合附图对本发明实施例进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种用作逆转神经肌肉阻滞剂的水溶性柱[n]芳烃，其特征在于：用于逆转骨骼肌松药溴化十烃季铵，n为5或6；所述水溶性柱[n]芳烃的结构通式为如下式I，所述骨骼肌松药溴化十烃季铵为式II:

2.根据权利要求1所述用作逆转神经肌肉阻滞剂的水溶性柱[n]芳烃，其特征在于：n为6，水溶性柱[6]芳烃的结构通式为：

3.根据权利要求1所述用作逆转神经肌肉阻滞剂的水溶性柱[n]芳烃，其特征在于：其在PBS缓冲溶液中以不低于10⁷M^-1的结合常数结合溴化十烃季铵。

4.一种权利要求1所述用作逆转神经肌肉阻滞剂的水溶性柱[n]芳烃的应用，其特征在于：利用水溶性柱[n]芳烃逆转十烃季铵神经肌肉阻滞，采用静脉注射、口服、皮下注射方式中的至少一种给药方式进行实施。

5.根据权利要求4所述用作逆转神经肌肉阻滞剂的水溶性柱[n]芳烃的应用，其特征在于：采用静脉注射给药方式进行实施。

6.根据权利要求4所述用作逆转神经肌肉阻滞剂的水溶性柱[n]芳烃的应用，其特征在于：最佳的给药量为：选择主客体部分研究的1:1的质量浓度比进行给药。

7.根据权利要求4所述用作逆转神经肌肉阻滞剂的水溶性柱[n]芳烃的应用，其特征在于：将水溶性柱[n]芳烃溶于水溶液、PBS溶液、无菌注射液中的至少一种溶剂中，作为神经肌肉阻滞剂进行使用。

8.根据权利要求7所述用作逆转神经肌肉阻滞剂的水溶性柱[n]芳烃的应用，其特征在于：将水溶性柱[n]芳烃溶于PBS溶液中，作为神经肌肉阻滞剂进行使用。

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