CN113549647B

CN113549647B - 一种高效西瓜遗传转化体系及应用

Info

Publication number: CN113549647B
Application number: CN202110668987.4A
Authority: CN
Inventors: 张华伟; 章旺根; 潘文波; 程振涛
Original assignee: Institute Of Modern Agriculture Peking University
Current assignee: Institute Of Modern Agriculture Peking University
Priority date: 2021-06-16
Filing date: 2021-06-16
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2041-06-16
Also published as: CN113549647A

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域。具体而言，本发明涉及一种高效西瓜遗传转化体系及应用，包括在西瓜遗传转化中包含AtGRF5、TaGRF4、OsGIF1、ZmWUS和ZmBBM等生长调节基因。本发明首次发现在西瓜转化和/或再生过程中表达AtGRF5、TaGRF4、OsGIF1、ZmWUS或ZmBBM基因能够促进西瓜作物的遗传转化效率，其中AtGRF5能显著提高西瓜遗传转化效率约80倍，为遗传育种提供宝贵的基因资源。本发明还提供了一种使用荧光蛋白DsRed2作为遗传转化筛选标记的方法，简化遗传转化筛选操作。该体系在西瓜中的表达使用，能够有效提高西瓜遗传转化育种效率，降低育种成本。

Description

一种高效西瓜遗传转化体系及应用

技术领域

本发明提供了一种提高西瓜遗传转化效率的体系和应用，具体地包括基因、重组载体、转化方法、应用和转基因植株的鉴定方法，属于植物基因工程领域。

背景技术

西瓜是全球范围内都很重要的经济作物，栽培地域广、栽培面积大。目前西瓜已经完成全基因组和泛基因组测序，发现了众多可能调控西瓜产量、营养品质、果实形状、抗病性和耐逆性的潜在调控基因。但是很多性状无法通过常规育种方法进行改良，需要通过基因工程技术完成基因功能验证和品种改良。随着生物技术的不断发展，利用转基因技术及基因编辑技术对遗传物质进行人为操作开始广泛应用于各种植物中，为创制新种质提供了新方法。

目前已经在西瓜中建立了遗传转化体系，但是整体转化效率比较低，需要耗费大量人力物力。目前已经有多个研究报道生长调节基因可以提高多种植物遗传转化效率。比如ZmBBM和ZmWUS可以使外植体细胞直接进入体细胞分化阶段，促进外植体脱分化并缩短转化时间，提高玉米、水稻、高粱和甘蔗的转化效率(Lowe et al.,2016)。此外，生长调节相关因子AtGRF5和TaGRF4与其辅因子OsGIF1的融合基因，可以提高小麦、柑橘等物种的转化效率，并缩短组培时间(Debernardi et al.,2020；Kong et al.,2020)。这些结果证明应用生长调节基因可以提高转化效率。但是这些基因在西瓜中是否能提高转化效率仍未知，因此，提供一种利用转基因技术提高西瓜材料转化效率的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。

本发明需要解决的问题是如何提高西瓜转化效率。

本发明提供了一种利用生长调节基因提高西瓜材料转化效率的方法。

为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种西瓜遗传转化的系统，其包括：

i)在西瓜遗传转化中表达生长调节基因；

ii)使用荧光蛋白作为遗传转化筛选标记。

其中生长调节基因指的是AtGRF5、TaGRF4、OsGIF1、ZmWUS或ZmBBM。所述AtGRF5具有与SEQ ID NO.4具有85％以上同一性的核酸序列并且具有提高植物转化效率的功能的核酸或其互补核酸序列，或者是可编码与SEQ ID NO.15具有85％以上同一性的氨基酸序列并且具有提高植物转化效率的功能的蛋白的核酸序列；所述TaGRF4具有与SEQ ID NO.5具有85％以上同一性的核酸序列并且具有提高植物转化效率的功能的核酸或其互补核酸序列，或者是可编码与SEQ ID NO.16具有85％以上同一性的氨基酸序列并且具有提高植物转化效率的功能的蛋白的核酸序列；所述OsGIF1具有与SEQ ID NO.6具有85％以上同一性的核酸序列并且具有提高植物转化效率的功能的核酸或其互补核酸序列，或者是可编码与SEQID NO.17具有85％以上同一性的氨基酸序列并且具有提高植物转化效率的功能的蛋白的核酸序列；所述ZmWUS具有与SEQ ID NO.8具有85％以上同一性的核酸序列并且具有提高植物转化效率的功能的核酸或其互补核酸序列，或者是可编码与SEQ ID NO.19具有85％以上同一性的氨基酸序列并且具有提高植物转化效率的功能的蛋白的核酸序列；所述ZmBBM具有与SEQ ID NO.12具有85％以上同一性的核酸序列并且具有提高植物转化效率的功能的核酸或其互补核酸序列，或者是可编码与SEQ ID NO.20具有85％以上同一性的氨基酸序列并且具有提高植物转化效率的功能的蛋白的核酸序列。

所述荧光蛋白作为转基因事件筛选标记，以判断是否发生目的基因的整合，包括但不限于DsRed2、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙p1等基因，优选为DsRed2。其中所述DsRed2荧光蛋白具有与SEQ ID NO.1具有85％以上同一性的核酸序列并且能编码荧光蛋白的核酸或其互补核酸序列，或者是与SEQID NO.16具有85％以上同一性的氨基酸序列并且具有荧光蛋白功能的蛋白。

第二方面，本发明还提供了所述生长调节基因的组合，包括但不限于：

i)TaGRF4-OsGIF1组合，所述TaGRF4-OsGIF1具有与SEQ ID NO.7具有85％以上同一性的核酸序列并且具有提高植物转化效率的功能的核酸或其互补核酸序列，或者是可编码与SEQ ID NO.18具有85％以上同一性的氨基酸序列并且具有提高植物转化效率的功能的蛋白的核酸序列；

ii)ZmWUS+ZmBBM组合，所述ZmWUS+ZmBBM组合具有与SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.12具有85％以上同一性的核酸序列并且具有提高植物转化效率的功能的核酸或其互补核酸序列，或者是可编码与SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20具有85％以上同一性的氨基酸序列并且具有提高植物转化效率的功能的蛋白的核酸序列。

第三方面，本发明还提供了一种荧光蛋白的应用，其作为转基因事件筛选标记以判断是否发生目的基因的整合，包括但不限于DsRed2、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、荧光素酶、绿色荧光蛋白、花青甙p1等。在本发明的一些实施方案中，所述荧光蛋白为DsRed2，其具有与SEQ ID NO.1具有85％以上同一性的核酸序列并且能编码荧光蛋白的核酸或其互补核酸序列，或者是与SEQ ID NO.16具有85％以上同一性的氨基酸序列并且具有荧光蛋白功能的蛋白。并且，所述转基因事件筛选包括使用荧光显微镜、手持式荧光检测仪判断是否发生目的基因的整合。

第四方面，本发明还提供了一种表达盒、表达载体或工程菌在西瓜遗传转化中的应用，其特征在于所述表达盒、表达载体或工程菌含有本文上文所述系统的蛋白、mRNA核酸、重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌。

第五方面，本发明提及的植物的转化效率包括以下一项或多项：

i)所述植物的愈伤组织形成的效率的改善；

ii)所述植物的再分化效率或速率的改善；

iii)基因转移效率的改善。

发明详述

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。例如，本发明中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold SpringHarbor，1989(下文称为“Sambrook”)。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文所使用的，术语“植物”包括整个植物和任何后代、植物的细胞、组织、或部分。术语“植物部分”包括植物的任何部分，包括，例如但不限于：种子(包括成熟种子、没有种皮的未成熟胚、和不成熟的种子)；植物插条(plant cutting)；植物细胞；植物细胞培养物；植物器官(例如，花粉、胚、花、果实、芽、叶、根、茎，和相关外植体)。植物组织或植物器官可以是种子、愈伤组织、或者任何其他被组织成结构或功能单元的植物细胞群体。植物细胞或组织培养物能够再生出具有该细胞或组织所来源的植物的生理学和形态学特征的植物，并能够再生出与该植物具有基本上相同基因型的植物。与此相反，一些植物细胞不能够再生产生植物。植物细胞或组织培养物中的可再生细胞可以是胚、原生质体、分生细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、丝、花、果仁、穗、穗轴、壳、或茎。

植物部分包括可收获的部分和可用于繁殖后代植物的部分。可用于繁殖的植物部分包括，例如但不限于：种子；果实；插条；苗；块茎；和砧木。植物的可收获部分可以是植物的任何有用部分，包括，例如但不限于：花；花粉；苗；块茎；叶；茎；果实；种子；和根。

植物细胞是植物的结构和生理单元。如本文所使用的，植物细胞包括原生质体和具有部分细胞壁的原生质体。植物细胞可以处于分离的单个细胞或细胞聚集体的形式(例如，松散愈伤组织和培养的细胞)，并且可以是更高级组织单元(例如，植物组织、植物器官、和植物)的一部分。因此，植物细胞可以是原生质体、产生配子的细胞，或者能够再生成完整植物的细胞或细胞的集合。因此，在本文的实施方案中，包含多个植物细胞并能够再生成为整株植物的种子被认为是一种“植物部分”。

如本文所使用的，术语“原生质体”是指细胞壁被完全或部分地除去、其脂双层膜裸露的植物细胞。典型地，原生质体是没有细胞壁的分离植物细胞，其具有再生成细胞培养物或整株植物的潜力。

植物“后代”包括植物的任何后续世代。

“经遗传修饰的植物”包括在其基因组内包含外源多核苷酸或修饰的基因或表达调控序列的植物。例如外源多核苷酸能够稳定地整合进基因组中，并遗传连续的世代。外源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。修饰的基因或表达调控序列为在植物基因组中所述序列包含单个或多个脱氧核苷酸取代、缺失和添加。例如，通过本发明获得的经遗传修饰的植物可以相对于野生型植物(相应的未经所述遗传修饰的植物)包含一个或多个C至T的取代。

针对序列而言的“外源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。

“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是单链或双链RNA或DNA聚合物，任选地可含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸通过如下它们的单个字母名称来指代：“A”为腺苷或脱氧腺苷(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷或脱氧胞苷，“G”表示鸟苷或脱氧鸟苷，“U”表示尿苷，“T”表示脱氧胸苷，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。

“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。

如本发明所用，“表达构建体”是指适于感兴趣的核苷酸序列在植物中表达的载体如重组载体。“表达”指功能产物的产生。例如，核苷酸序列的表达可指核苷酸序列的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。

本发明的“表达构建体”可以是线性的核酸片段、环状质粒、病毒载体，或者，在一些实施方式中，可以是能够翻译的RNA(如mRNA)。

本发明的“表达构建体”可包含不同来源的调控序列和感兴趣的核苷酸序列，或相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和感兴趣的核苷酸序列。

本发明提供了一种西瓜遗传转化的系统，其包括：

i)在西瓜遗传转化中表达生长调节基因；

ii)使用荧光蛋白作为遗传转化筛选标记。

本发明还提供了所述生长调节基因的组合，包括但不限于：

本文中所述表达包括：

i)组成型表达：将生长调节基因核酸序列与表达调控元件可操作的连接，形成核酸构建体，其所述表达调控元件包括启动子和终止子，所述启动子包括但不限于拟南芥UBQ10启动子(SEQ ID NO.1)、Nos启动子(SEQ ID NO.9)、烟草花叶病毒35S启动子，所述终止子包括但不限于烟草花叶病毒终止子CamT(SEQ ID NO.10)、拟南芥HspT终止子(SEQ IDNO.3)等；

ii)瞬时表达：直接在西瓜细胞中表达权利要求1-4所述氨基酸序列，或者是能翻译成所述氨基酸序列的mRNA核酸序列或DNA核酸序列。

本文中所述遗传转化，其特征在于在目的植物细胞中表达外源核酸序列、mRNA序列和氨基酸序列，其中所述外源核酸序列可以包含蛋白质基因功能的启动子、基因、终止子、抑制子和增强子，其中所述外源核酸序列可以改变植物的性状或农艺性状，或者改变植物细胞的基因组序列或转录组序列。

具体地，本文中所述西瓜遗传转化方法包括土壤农杆菌介导的转化、基因枪法、PEG介导的原生质体转化、植物病毒介导的转化、花粉管通道法、电击转化法和子房注射法。所述西瓜遗传转化材料包括但不限于西瓜子叶、子叶节、幼胚、成熟胚或原生质体。

“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。植物表达调控元件指的是能够在植物中控制感兴趣的核苷酸序列转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。

调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。

“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。在本发明的一些实施方案中，启动子是能够控制植物细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。启动子可以是组成型启动子或组织特异性启动子或发育调控启动子或诱导型启动子。

“组成型启动子”指一般将引起基因在多数细胞类型中在多数情况下表达的启动子。“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而且也可在一种特定细胞或细胞型中表达的启动子。“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。

如本文中所用，术语“可操作地连接”指调控元件(例如但不限于，启动子序列、转录终止序列等)与核酸序列(例如，编码序列或开放读码框)连接，使得核苷酸序列的转录被所述转录调控元件控制和调节。用于将调控元件区域可操作地连接于核酸分子的技术为本领域已知的。

将核酸分子(例如质粒、线性核酸片段、RNA等)或蛋白质“导入”植物是指用所述核酸或蛋白质转化植物细胞，使得所述核酸或蛋白质在植物细胞中能够发挥功能。本发明所用的“转化”包括稳定转化和瞬时转化。

“稳定转化”指将外源核苷酸序列导入植物基因组中，导致外源基因稳定遗传。一旦稳定转化，外源核酸序列稳定地整合进所述植物和其任何连续世代的基因组中。

“瞬时转化”指将核酸分子或蛋白质导入植物细胞中，执行功能而没有外源基因稳定遗传。瞬时转化中，外源核酸序列不整合进植物基因组中。

“性状”指植物或特定植物材料或细胞的生理的、形态的、生化的或物理的特征。在一些实施方式中，这些特征可以是肉眼可见的，比如种子、植株的大小等；可用生物化学技术测定的指标，如种子或叶片中蛋白、淀粉或油份的含量等；可观察的代谢或生理过程，如测定对水分胁迫、特定盐、糖或氮浓度的抗性；可检测的基因表达水平；或可观察渗透胁迫的抗性或产量等农艺性状。在一些实施方式中，性状还包括植物的倍性(ploidy)，例如对植物育种重要的单倍性(haploidy)。在一些实施方式中，性状还包括植物对除草剂的抗性。

本发明可使用的启动子的实例包括但不限于：拟南芥UBQ10启动子(SEQ IDNO.1)、Nos启动子(SEQ ID NO.9)、烟草花叶病毒35S启动子、花椰菜花叶病毒35S启动子(Odellet al.(1985)Nature 313:810-812)、玉米Ubi-1启动子、小麦U6启动子、水稻U3启动子、玉米U3启动子、水稻肌动蛋白启动子、TrpPro5启动子(美国专利申请No.10/377,318；2005年3月16日提请)、pEMU启动子(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)、MAS启动子(Velten et al.(1984)EMBO J.3:2723-2730)、玉米H3组蛋白启动子(Lepetitet al.(1992)Mol.Gen.Genet.231:276-285和Atanassova et al.(1992)Plant J.2(3):291-300)和欧洲油菜(Brassica napus)ALS3(PCT申请WO 97/41228)启动子。可用于本发明的启动子还包含Moore et al.(2006)Plant J.45(4):651-683中综述的常用组织特异性启动子。

本发明的表达调控元件还可以包括终止子，包括但不限于烟草花叶病毒终止子CamT(SEQ ID NO.10)、拟南芥HspT终止子(SEQ ID NO.3)等。

“农艺性状”是可测量的指标参数，包括但不限于：叶片绿色、籽粒产量、生长速率、总生物量或积累速率、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、植物总氮含量、果实氮含量、种子氮含量、植物营养组织氮含量、植物总游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、植物营养组织游离氨基酸含量、植物总蛋白含量、果实蛋白含量、种子蛋白含量、植物营养组织蛋白质含量、抗旱性、氮的吸收、根的倒伏、收获指数、茎的倒伏、株高、穗高、穗长、抗病性、抗寒性、抗盐性和分蘖数等。

本领域技术人员应该知晓，本发明所述的核酸包括与所述AtGRF5、TaGRF4、OsGIF1、ZmWUS或ZmBBM基因高度同源，并且具有同样的提高植物转化效率的功能的高度同源的功能等价体序列。所述高度同源的功能等价体序列包括在严谨条件下能够与本发明所公开基因的核苷酸序列杂交的DNA序列。

功能等价体序列还包括与本发明所公开的AtGRF5、TaGRF4、OsGIF1、ZmWUS或ZmBBM基因所示的序列有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列相似性，且具有提高植物转化效率的功能的DNA序列。其中，序列相似性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括Myers和Miller算法(Bioinformatics，4(1)：11-17，1988)、Needleman-Wunsch全局比对法(J.Mol.Biol.，48(3)：443-53，1970)、Smith-Waterman局部比对法(J.Mol.Biol.，147：195-197，1981)、Pearson和Lipman相似性搜索法(PNAS，85(8)：2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(Altschul等，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；PNAS，90：5873-5877，1993)。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。

本发明的转基因植物使用植物生物技术领域技术人员已知的转化方法制备。任何方法可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导的转化、使用基因枪导入、电穿孔、以及显微注射，等。在本发明的具体实施方式中，本发明使用了基于土壤杆菌的转化技术(可参见Horsch RB等(1985)Science 225：1229；WhiteFF，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，Academic Press，1993，pp.15-38；Jenes B等.Techniquesfor Gene Transfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineering andUtilization，Academic Press，1993，pp.128-143，等)。土壤杆菌菌株(例如根瘤土壤杆菌或毛根土壤杆菌)包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，所述质粒和元件在用土壤杆菌转染后被转移至植物，而T-DNA被整合进植物细胞的基因组中。T-DNA可位于Ri-质粒或Ti-质粒上，或独立地包含在所谓的双元载体中。土壤杆菌介导的转化方法描述于例如中。土壤杆菌介导的转化最适合双子叶植物，但是也适合单子叶植物。土壤杆菌对植物的转化描述于例如中。转化可导致瞬时或稳定的转化和表达。尽管本发明的核苷酸序列可被插入落入这些广泛种类中的任何植物和植物细胞中，但是其尤其适用于作物植物细胞。

在制备表达盒的过程中，可对多种DNA片段加以操作，以提供处于合适方向，或是处于正确读码框中的DNA序列。为达到此目的，可使用衔接子或接头，将DNA片段连起来，或者进一步包括其它操作，以提供方便的限制性酶切位点等。

进一步地，本发明所提供的构建体中还可包括选择标记基因，用于选择经转化的细胞或组织。所述选择标记基因包括包括但不限于红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙p1等基因。优选的，本发明的一些实施方案中使用了红色荧光蛋白DsRed2，其中所述DsRed2具有与SEQ ID NO.1具有85％以上同一性的核酸序列并且能编码荧光蛋白的核酸或其互补核酸序列，或者是与SEQ IDNO.16具有85％以上同一性的氨基酸序列并且具有荧光蛋白功能的蛋白。

本发明所提供的表达盒或载体可被插入质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌。当宿主细胞是植物细胞时，表达盒或载体可被插入被转化的植物细胞的基因组中。插入可以是定位的或随机的插入。优选地，插入通过诸如同源重组来实现。另外，表达盒或载体可保持在染色体外。本发明的表达盒或载体可存在于植物细胞的核、叶绿体、线粒体和/或质体中。优选地，本发明的表达盒或载体被插入植物细胞核的染色体DNA中。

本发明还提供了一种表达盒、表达载体或工程菌在西瓜遗传转化中的应用，其特征在于所述表达盒、表达载体或工程菌含有本文上文所述系统的蛋白、mRNA核酸、重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌。

本发明提及的植物的转化效率包括以下一项或多项：

i)所述植物的愈伤组织形成的效率的改善；

ii)所述植物的再分化效率或速率的改善；

iii)基因转移效率的改善。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1.显著提高植物遗传转化效率，实现对西瓜高转化频率、高重复性的农杆菌介导转化，节省大量的人力物力；

2.使用卡那霉素筛选，遗传转化时间较短，极少出现发育畸形植物；

3.通过本发明，只需要通过手持式荧光检测器就可以判断阳性转化事件，方便快捷而且准确，为大规模遗传转化筛选奠定了基础。

参考文献

Debernardi,J.M.,Tricoli,D.M.,Ercoli,M.F.,Hayta,S.,Ronald,P.,Palatnik,J.F.,and Dubcovsky,J.(2020).A GRF-GIF chimeric protein improves theregeneration efficiency oftransgenic plants.Nat Biotechnol 38,1274-1279.

Kong,J.,Martin-Ortigosa,S.,Finer,J.,Orchard,N.,Gunadi,A.,Batts,L.A.,Thakare,D.,Rush,B.,Schmitz,O.,Stuiver,M.,et al.(2020).Overexpression of theTranscription Factor GROWTH-REGULATING FACTOR5 Improves TransformationofDicot and Monocot Species.Frontiers in plant science 11,572319.

Lowe,K.,Wu,E.,Wang,N.,Hoerster,G.,Hastings,C.,Cho,M.J.,Scelonge,C.,Lenderts,B.,Chamberlin,M.,Cushatt,J.,et al.(2016).Morphogenic Regulators Babyboom and Wuschel Improve Monocot Transformation.The Plant cell 28,1998-2015.

附图说明

图1为表达DsRed2的Kan抗性双元载体W500示意图。

图2为含有不同生长调节基因的载体示意图。

图3为使用手持式荧光检测器鉴定阳性转基因植物。其中A为明场下含有W502载体的阳性转基因的再生芽；B为使用LUYOR-3410紫外线灯可以检测到阳性植物的荧光信号。

图4为含有W505载体的阳性转基因西瓜分化苗出现异常的发育表型。其中A为明场下含有W505载体的阳性转基因的再生芽；B为紫外线灯下检测到阳性植物的荧光信号。

具体实验方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、载体构建

首先，以pKSE401质粒(中国农业大学陈其军教授处获得)用HindIII酶切，回收14kb片段后用T4连接酶连接。得到的质粒用XbaI和SacI酶切，去掉4kb的Cas9序列，将其替换为DsRed2序列(SEQ ID NO：1)，得到表达DsRed2的Kan抗性双元载体W500(见图1，序列如SEQ ID NO：40所示)。

然后，以拟南芥基因组为模板扩增UBQ10启动子序列(SEQ ID NO：2)和HspT终止子序列(SEQ ID NO：3)，与HindIII酶切后的上述表达DsRed2的Kan抗性双元载体进行GibsonAssembly，得到W501载体。该载体上有KpnI酶切位点用于加入生长调节基因。GibsonAssembly使用碧云天Seamless Cloning Kit，反应体系见表1。

表1

具体地，

对于W501载体，为对照载体，不含有生长调节基因；

对于W502载体，发明人直接合成拟南芥GRF5的CDS序列(SEQ ID NO：4)，GibsonAssembly至W501载体；

对于W503载体，发明人直接合成小麦GRF4序列(SEQ ID NO：5)和水稻GIF1序列(SEQ ID NO：6)(融合蛋白GRF4-GIF1的编码序列为SEQ ID NO：7)，GibsonAssembly至W501载体；

对于W504载体，发明人直接合成WUS表达序列(SEQ ID NO：11)，后与SpeI酶切的W501载体进行GibsonAssembly；

对于W505载体，发明人直接合成玉米BBM的CDS序列(SEQ ID NO：12)，后与KpnI酶切的W504载体进行GibsonAssembly；

对于W506载体，发明人直接合成ipt基因(SEQ ID NO：13)，后与KpnI酶切的W504载体进行GibsonAssembly。

上述克隆过程中使用到的相关引物序列详见表2，各个载体示意图详见图2。

表2

实施例2、西瓜外植体的转化

以农杆菌介导的西瓜品种西农8号母本WWl50遗传转化为例。

(1)外植体的制备

选取栽培西瓜品种西农8号母本WWl50的饱满、外观正常的种子，小心的去除种壳，不要伤到子叶及生长点、灭菌后，在MS固体培养基中28℃黑暗下种植生长3天左右。选择处于胚根伸长、但两片子叶尚未分开的时期的植株，切取子叶中部的部分，并将其切为1.5mm×1.5mm的小块作为外植体。

(2)农杆菌重组菌的制备

将实施例1中的载体分别转化农杆菌GV3101感受态细胞中，得到重组菌。

(3)侵染液的制备

将步骤2中的重组菌活化并进行培养，在菌株浓度为在OD600＝0.6-0.8之间时，离心，收集菌体，将菌体利用MS液体无菌培养基重悬，侵染液的OD600均为0.05。

(4)侵染

将步骤1得到的外植体置于步骤2得到的含有重组菌的侵染液中，并使外植体浸没在液体中，室温侵染10分钟，侵染过程中伴有间或摇动，然后取出外植体，将液体吸干，得到侵染后的外植体。

(5)共培养

步骤4完成后，将侵染后的外植体于共培养培养基中，暗培养3天，得到共培养后的外植体。所用共培养培养基为由MS固体培养基和6-BA组成的无菌培养基，6-BA在共培养培养基中的浓度为1.5mg/L，pH为5.8。

(6)筛选

步骤5完成后，将共培养后的外植体于筛选培养基上培养，每个平板上放25个左右的外植体。每周更换一次培养基，约4周后，可观察到阳性幼芽从子叶块边缘长出，即得到含有芽的植物组织。所用筛选培养基为由MS固体培养基与6-BA、特美汀和卡那霉素组成的无菌培养基，6-BA、特美汀、卡那霉素在筛选培养基中的浓度分别为1.5mg/L、100mg/L、50mg/L，pH为5.8。

BA和ZT作为诱导西瓜外植体不定芽常用激素，通过对比观察发现，光照培养下A2(2mg/L 6-BA，0.2mg/L IAA)的切口处愈伤形成的不明显，A4(1mg/L6-BA，0.1mg/L IAA)形成的愈伤玻璃化严重，A5(1mg/L 6-BA，0.2mg/L IAA)介于两者中间。光照培养下B2(2mg/LZT，0.1mg/L IAA)形成的愈伤玻璃化严重，B4(1mg/L ZT，0.1mg/L IAA)形成的愈伤较少。综合比较，最优的分化培养基中生长激素配方为2mg/L 6-BA和0.2mg/L IAA。

发明人比较了4个农杆菌菌株在侵染后7d，通过荧光显微镜下观察外植体荧光情况，发现EHA105与GV3101侵染过后的外植体，带有荧光数量的外植体最多，但是EHA105侵染的外植体其荧光范围更大亮度也更强，而AGL1与LB4404侵染后的外植体，远远不如EHA105与GV3101。因此，我们选用EHA105作为最适合西瓜遗传转化的农杆菌菌株。

(7)芽的培养

步骤6完成后，将含有芽的植物组织或芽在芽伸长培养基中进行培养，每两周更换一次培养基，至幼芽长大。所用芽伸长培养基为由MS固体培养基与6-BA、ZT、特美汀和卡那霉素组成的无菌培养基，6-BA、NAA、特美汀和卡那霉素在芽伸长培养基中的浓度分别为0.1mg/L、0.01mg/L、100mg/L和50mg/L，pH为5.8。

(8)生根

步骤7完成后，将得到的具有完整地上部分的植株(包含茎、叶及定端生长点)置于生根培养基中进行培养，至幼芽生根长成完整幼苗植株，即得到西瓜植株。生根培养基为由MS固体培养基与IBA和特美汀组成的无菌培养基，IBA和特美汀在生根培养基中的浓度分别为1mg/L和100mg/L，pH为5.8。

步骤6-8均在16h日/8h夜的光周期下进行，光强度为约6000lx。

实施例3、西瓜阳性组培苗的鉴定

发明人通过DsRed2荧光蛋白鉴定阳性转基因植物。阳性植株采用手持式LUYOR-3415RG双波长荧光蛋白激发光源紫外线灯进行检测。

按照LUYOR-3410紫外线灯的使用说明，打开红色光源激发荧光，使用相应红色滤光镜检测是否表达红色荧光。如图3所示，以转化W502载体的植株为例，A为明场下含有W502载体的阳性转基因的再生芽；B为使用LUYOR-3410紫外线灯可以检测到阳性植物的荧光信号。

使用同样的方法，发明人做了转化实施例1中不同载体的植株的荧光检测，得到不同载体转基因效率如下表3。

表3

实验结果说明，含有AtGRF5的W502能显著提高西瓜遗传转化效率，与对照相比其转化效率提高了约80倍，且不产生畸形苗。含有TaGRF4-OsGIF1的W503载体也可以把西瓜遗传转化效率提高约44倍，且不产生畸形苗。含有ZmWUS和ZmBBM的W505载体可以将西瓜遗传转化效率提高约71倍，但是如图4所示，发明人发现这个载体产生的阳性转基因植物大多出现异常的发育表型，如无明显生长中心的缀化苗、叶片形状不规则完整。

序列表

<110> 北京大学现代农业研究院

<120> 一种高效西瓜遗传转化体系及应用

<160> 40

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcctcct ccgagaacgt catcaccgag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 60

accgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 120

cacaacaccg tgaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180

ctgtcccccc agttccagta cggctccaag gtgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240

gactacaaga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300

gacggcggcg tggcgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggctg cttcatctac 360

aaggtgaagt tcatcggcgt gaacttcccc tccgacggcc ccgtgatgca gaagaagacc 420

atgggctggg aggcctccac cgagcgcctg tacccccgcg acggcgtgct gaagggcgag 480

acccacaagg ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt caagtccatc 540

tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggctactact acgtggacgc caagctggac 600

atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggagcagt acgagcgcac cgagggccgc 660

caccacctgt tcctgtag 678

<210> 2

<211> 1307

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 2

gatcaggata ttcttgttta agatgttgaa ctctatggag gtttgtatga actgatgatc 60

taggaccgga taagttccct tcttcatagc gaacttattc aaagaatgtt ttgtgtatca 120

ttcttgttac attgttatta atgaaaaaat attattggtc attggactga acacgagtgt 180

taaatatgga ccaggcccca aataagatcc attgatatat gaattaaata acaagaataa 240

atcgagtcac caaaccactt gcctttttta acgagacttg ttcaccaact tgatacaaaa 300

gtcattatcc tatgcaaatc aataatcata caaaaatatc caataacact aaaaaattaa 360

aagaaatgga taatttcaca atatgttata cgataaagaa gttacttttc caagaaattc 420

actgatttta taagcccact tgcattagat aaatggcaaa aaaaaacaaa aaggaaaaga 480

aataaagcac gaagaattct agaaaatacg aaatacgctt caatgcagtg ggacccacgg 540

ttcaattatt gccaattttc agctccaccg tatatttaaa aaataaaacg ataatgctaa 600

aaaaatataa atcgtaacga tcgttaaatc tcaacggctg gatcttatga cgaccgttag 660

aaattgtggt tgtcgacgag tcagtaataa acggcgtcaa agtggttgca gccggcacac 720

acgagtcgtg tttatcaact caaagcacaa atacttttcc tcaacctaaa aataaggcaa 780

ttagccaaaa acaactttgc gtgtaaacaa cgctcaatac acgtgtcatt ttattattag 840

ctattgcttc accgccttag ctttctcgtg acctagtcgt cctcgtcttt tcttcttctt 900

cttctataaa acaataccca aagagctctt cttcttcaca attcagattt caatttctca 960

aaatcttaaa aactttctct caattctctc taccgtgatc aaggtaaatt tctgtgttcc 1020

ttattctctc aaaatcttcg attttgtttt cgttcgatcc caatttcgta tatgttcttt 1080

ggtttagatt ctgttaatct tagatcgaag acgattttct gggtttgatc gttagatatc 1140

atcttaattc tcgattaggg tttcatagat atcatccgat ttgttcaaat aatttgagtt 1200

ttgtcgaata attactcttc gatttgtgat ttctatctag atctggtgtt agtttctagt 1260

ttgtgcgatc gaatttgtcg attaatctga gtttttctga ttaacag 1307

<210> 3

<211> 250

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 3

atatgaagat gaagatgaaa tatttggtgt gtcaaataaa aagcttgtgt gcttaagttt 60

gtgttttttt cttggcttgt tgtgttatga atttgtggct ttttctaata ttaaatgaat 120

gtaagatctc attataatga ataaacaaat gtttctataa tccattgtga atgttttgtt 180

ggatctcttc tgcagcatat aactactgta tgtgctatgg tatggactat ggaatatgat 240

taaagataag 250

<210> 4

<211> 1194

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgatgagtc taagtggaag tagcgggaga acaataggaa ggcctccatt tacaccaaca 60

caatgggaag aactggaaca tcaagcccta atctacaagt acatggtctc tggtgttcct 120

gtcccacctg agctcatctt ctccattaga agaagcttgg acacttcctt ggtctctaga 180

ctccttcctc accaatccct tggatggggg tgttaccaga tgggatttgg gagaaaacca 240

gatccagagc caggaagatg cagaagaaca gatggtaaga aatggagatg ctcaagagaa 300

gcttacccag attcgaagta ctgtgaaaaa cacatgcaca gaggaagaaa ccgtgccaga 360

aaatctcttg atcagaatca gacaacaaca actcctttaa catcaccatc tctctcattc 420

accaacaaca acaacccaag tcccaccttg tcttcttctt cttcctctaa ttcctcttct 480

actacttatt ctgcttcttc ttcttcaatg gatgcctaca gtaacagtaa taggtttggg 540

cttggtggaa gtagtagtaa cactagaggt tatttcaaca gccattctct tgattatcct 600

tatccttcta cttcacccaa acaacaacaa caaactcttc atcatgcttc cgctttgtca 660

cttcatcaaa atactaattc tacttctcag ttcaatgtct tagcctctgc tactgaccac 720

aaagacttca ggtactttca agggattggg gagagagttg gaggagttgg ggagagaacg 780

ttctttccag aagcatctag aagctttcaa gattctccat accatcatca ccaacaaccg 840

ttagcaacag tgatgaatga tccgtaccac cactgtagta ctgatcataa taagattgat 900

catcatcaca catactcatc ctcatcatca tctcaacatc ttcatcatga tcatgatcat 960

agacagcaac agtgttttgt tttgggcgcc gacatgttca acaaacctac aagaagtgtc 1020

cttgcaaact catcaagaca agatcaaaat caagaagaag atgagaaaga ttcatcagag 1080

tcgtccaaga agtctctaca tcacttcttt ggtgaggact gggcacagaa caagaacagt 1140

tcagattctt ggcttgacct ttcttcccac tcaagactcg acactggtag ctaa 1194

<210> 5

<211> 1227

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggcgatgc cgtatgcctc tctttccccg gcaggcgacc gccgctcctc cccggccgcc 60

accgcctccc tcctcccctt ctgccgctcc tcccccttct ccgccggcgg cggcaatggc 120

ggcatggggg aggaggcgcg gatggacggg aggtggatgg cgaggccggt gcccttcacg 180

gcggcgcagt acgaggagct ggagcaccag gcgctgatat acaagtacct ggtggccggc 240

gtgcccgtcc cgccggatct cgtgctcccc atccgccgcg gcatcgaatc cctcgccgcc 300

cgcttctacc acaaccccct cgccatcggg tacggatcgt acctaggcaa gaaggtggat 360

ccggagccgg gccggtgccg gcgcacggac ggcaagaagt ggcggtgcgc caaggaggcc 420

gcctccgatt ccaagtattg cgagcgccac atgcaccgcg gccgcaaccg ttcaagaaag 480

cctgtggaaa cgcagctcgt cccgcacacc cagccgccgg ccgcctccgc cgtgccgccc 540

ctcgccaccg gcttccacag ccactccctc taccccgcca tcggcggcag caccaacggt 600

ggtggaggcg gggggaacaa cggcatgtcc atgcccagca cgttctcctc cgcgctgggg 660

ccgcctcagc agcacatggg cagcaatgcc gcctctccct acgcggctct cggtggcgcc 720

ggaacatgca aagatttcag gtataccgca tatggaataa gatctttggc agacgagcac 780

agtcagctca tgacagaagc catgaatacc tccgtggaga acccatggcg cctgccgccg 840

tcgtctcaaa cgacctcatt cccgctttca agctacgctc ctcagcttgg agcaacgagt 900

gacctgggtc agaacaacaa ccacaacaac agcagcagca acagtgccgt caagtccgag 960

cggcagcagc cgctctcctt cccggggtgc ggcgactttg gcggcggcgg catggactcc 1020

gcgaagcagg agaaccagac gctgcggccg ttcttcgacg agtggccgaa gacgagggac 1080

tcgtggtcgg acctgacgga cgacaactcc agcctcgcct ccttctcggc cacccagctg 1140

tcgatctcga tacccatgac gtcctccgag ttctccgccg ccagctccca gtcgcccaac 1200

ggcatgctgt tcgccggcga gatgtac 1227

<210> 6

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgcagcagc aacacctgat gcagatgaac cagggcatga tggggggata tgcttcccct 60

accactgtca ccactgatct cattcagcag tatctggatg agaacaagca gctgatcctg 120

gccatccttg acaaccagaa caatgggaag gtggaagagt gcgctcggaa ccaagctaag 180

ctccagcaca atctcatgta cctcgccgcc atcgccgaca gccagccgcc gcagacggcc 240

gccatgtccc agtatccgtc gaacctgatg atgcagtccg gggcgaggta catgccgcag 300

cagtcggcgc agatgatggc gccgcagtcg ctgatggcgg cgaggtcgtc gatgatgtac 360

gcgcagccgg cgctgtcgcc gctccagcag cagcagcagc aggcggcggc ggcgcacggg 420

cagctgggca tgggctcggg gggcaccacc agcgggttca gcatcctcca cggcgaggcc 480

agcatgggcg gcggcggtgg cgccggtaac agcatgatga acgccggcgt gttctccgac 540

ttcggacgcg gcggcggcgg tggcagcagc ggcggcaagg aggggtccac ctcgctgtcc 600

gtcgacgtcc ggggcgccaa ctccggcgcc cagagcggcg acggggagta cctcaagggc 660

accgaggagg aaggcagcta g 681

<210> 7

<211> 1920

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggcgatgc cgtatgcctc tctttccccg gcaggcgacc gccgctcctc cccggccgcc 60

accgcctccc tcctcccctt ctgccgctcc tcccccttct ccgccggcgg cggcaatggc 120

ggcatggggg aggaggcgcg gatggacggg aggtggatgg cgaggccggt gcccttcacg 180

gcggcgcagt acgaggagct ggagcaccag gcgctgatat acaagtacct ggtggccggc 240

gtgcccgtcc cgccggatct cgtgctcccc atccgccgcg gcatcgaatc cctcgccgcc 300

cgcttctacc acaaccccct cgccatcggg tacggatcgt acctaggcaa gaaggtggat 360

ccggagccgg gccggtgccg gcgcacggac ggcaagaagt ggcggtgcgc caaggaggcc 420

gcctccgatt ccaagtattg cgagcgccac atgcaccgcg gccgcaaccg ttcaagaaag 480

cctgtggaaa cgcagctcgt cccgcacacc cagccgccgg ccgcctccgc cgtgccgccc 540

ctcgccaccg gcttccacag ccactccctc taccccgcca tcggcggcag caccaacggt 600

ggtggaggcg gggggaacaa cggcatgtcc atgcccagca cgttctcctc cgcgctgggg 660

ccgcctcagc agcacatggg cagcaatgcc gcctctccct acgcggctct cggtggcgcc 720

ggaacatgca aagatttcag gtataccgca tatggaataa gatctttggc agacgagcac 780

agtcagctca tgacagaagc catgaatacc tccgtggaga acccatggcg cctgccgccg 840

tcgtctcaaa cgacctcatt cccgctttca agctacgctc ctcagcttgg agcaacgagt 900

gacctgggtc agaacaacaa ccacaacaac agcagcagca acagtgccgt caagtccgag 960

cggcagcagc cgctctcctt cccggggtgc ggcgactttg gcggcggcgg catggactcc 1020

gcgaagcagg agaaccagac gctgcggccg ttcttcgacg agtggccgaa gacgagggac 1080

tcgtggtcgg acctgacgga cgacaactcc agcctcgcct ccttctcggc cacccagctg 1140

tcgatctcga tacccatgac gtcctccgag ttctccgccg ccagctccca gtcgcccaac 1200

ggcatgctgt tcgccggcga gatgtacgcg gccgctgcca tgcagcagca acacctgatg 1260

cagatgaacc agggcatgat ggggggatat gcttccccta ccactgtcac cactgatctc 1320

attcagcagt atctggatga gaacaagcag ctgatcctgg ccatccttga caaccagaac 1380

aatgggaagg tggaagagtg cgctcggaac caagctaagc tccagcacaa tctcatgtac 1440

ctcgccgcca tcgccgacag ccagccgccg cagacggccg ccatgtccca gtatccgtcg 1500

aacctgatga tgcagtccgg ggcgaggtac atgccgcagc agtcggcgca gatgatggcg 1560

ccgcagtcgc tgatggcggc gaggtcgtcg atgatgtacg cgcagccggc gctgtcgccg 1620

ctccagcagc agcagcagca ggcggcggcg gcgcacgggc agctgggcat gggctcgggg 1680

ggcaccacca gcgggttcag catcctccac ggcgaggcca gcatgggcgg cggcggtggc 1740

gccggtaaca gcatgatgaa cgccggcgtg ttctccgact tcggacgcgg cggcggcggt 1800

ggcagcagcg gcggcaagga ggggtccacc tcgctgtccg tcgacgtccg gggcgccaac 1860

tccggcgccc agagcggcga cggggagtac ctcaagggca ccgaggagga aggcagctag 1920

<210> 8

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggcggcca atgcgggcgg cggtggaacg ggaggaggca gcggcagcgg cagcgtggct 60

gcgccggcgg tgtgccgccc cagcggctcg cggtggacgc cgacgccgga gcagatcagg 120

atgctgaagg agctctacta cggctgcggc atccggtcgc ccagctcgga gcagatccag 180

cgcatcaccg ccatgctgcg gcagcacggc aagatcgagg gcaagaacgt cttctactgg 240

ttccagaacc acaaggcccg cgagcgccag aagcgccgcc tcaccagcct cgacgtcaac 300

gtgcccgccg ccggcgcggc cgacgccacc accagccaac tcggcgtcct ctcgctgtcg 360

tcgccgccgc cttcaggcgc ggcgcctccc tcgcccaccc tcggcttcta cgccgccggc 420

aatggcggcg gatcggctgt gctgctggac acgagttccg actggggcag cagcggcgct 480

gccatggcca ccgagacatg cttcctgcag gactacatgg gcgtgacgga cacgggcagc 540

tcgtcgcagt ggccacgctt ctcgtcgtcg gacacgataa tggcggcggc cgcggcgcgg 600

gcggcgacga cgcgggcgcc cgagacgctc cctctcttcc cgacctgcgg cgacgacggc 660

ggcagcggta gcagcagcta cttgccgttc tggggtgccg cgtccacaac tgccggcgcc 720

acttcttccg ttgcgatcca gcagcaacac cagctgcagg agcagtacag cttttacagc 780

aacagcaaca gcacccagct ggccggcacc ggcaaccaag acgtatcggc aacagcagca 840

gcagccgccg ccctggagct gagcctcagc tcatggtgct ccccttaccc tgctgcaggg 900

agtatgtga 909

<210> 9

<211> 195

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaaccgcaac gttgaaggag ccactcagcc gcgggtttct ggagtttaat gagctaagca 60

catacgtcag aaaccattat tgcgcgttca aaagtcgcct aaggtcacta tcagctagca 120

aatatttctt gtcaaaaatg ctccactgac gttccataaa ttcccctcgg tatccaatta 180

aagctagctt ccacc 195

<210> 10

<211> 706

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgctgaaatc accagtctct ctctacaaat ctatctctct ctattttctc cataaataat 60

gtgtgagtag tttcccgata agggaaatta gggttcttat agggtttcgc tcatgtgttg 120

agcatataag aaacccttag tatgtatttg tatttgtaaa atacttctat caataaaatt 180

tctaattcct aaaaccaaaa tccagtacta aaatccagat ctcctaaagt ccctatagat 240

ctttgtcgtg aatataaacc agacacgaga cgactaaacc tggagcccag acgccgttcg 300

aagctagaag taccgcttag gcaggaggcc gttagggaaa agatgctaag gcagggttgg 360

ttacgttgac tcccccgtag gtttggttta aatatgatga agtggacgga aggaaggagg 420

aagacaagga aggataaggt tgcaggccct gtgcaaggta agaagatgga aatttgatag 480

aggtacgcta ctatacttat actatacgct aagggaatgc ttgtatttat accctatacc 540

ccctaataac cccttatcaa tttaagaaat aatccgcata agcccccgct taaaaattgg 600

tatcagagcc atgaataggt ctatgaccaa aactcaagag gataaaacct caccaaaata 660

cgaaagagtt cttaactcta aagataaaag atctttcaag atcaaa 706

<210> 11

<211> 1849

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaaccgcaac gttgaaggag ccactcagcc gcgggtttct ggagtttaat gagctaagca 60

catacgtcag aaaccattat tgcgcgttca aaagtcgcct aaggtcacta tcagctagca 120

aatatttctt gtcaaaaatg ctccactgac gttccataaa ttcccctcgg tatccaatta 180

aagctagctt ccaccatgga gtgcaggtcg acggatccat ggcggccaat gcgggcggcg 240

gtggaacggg aggaggcagc ggcagcggca gcgtggctgc gccggcggtg tgccgcccca 300

gcggctcgcg gtggacgccg acgccggagc agatcaggat gctgaaggag ctctactacg 360

gctgcggcat ccggtcgccc agctcggagc agatccagcg catcaccgcc atgctgcggc 420

agcacggcaa gatcgagggc aagaacgtct tctactggtt ccagaaccac aaggcccgcg 480

agcgccagaa gcgccgcctc accagcctcg acgtcaacgt gcccgccgcc ggcgcggccg 540

acgccaccac cagccaactc ggcgtcctct cgctgtcgtc gccgccgcct tcaggcgcgg 600

cgcctccctc gcccaccctc ggcttctacg ccgccggcaa tggcggcgga tcggctgtgc 660

tgctggacac gagttccgac tggggcagca gcggcgctgc catggccacc gagacatgct 720

tcctgcagga ctacatgggc gtgacggaca cgggcagctc gtcgcagtgg ccacgcttct 780

cgtcgtcgga cacgataatg gcggcggccg cggcgcgggc ggcgacgacg cgggcgcccg 840

agacgctccc tctcttcccg acctgcggcg acgacggcgg cagcggtagc agcagctact 900

tgccgttctg gggtgccgcg tccacaactg ccggcgccac ttcttccgtt gcgatccagc 960

agcaacacca gctgcaggag cagtacagct tttacagcaa cagcaacagc acccagctgg 1020

ccggcaccgg caaccaagac gtatcggcaa cagcagcagc agccgccgcc ctggagctga 1080

gcctcagctc atggtgctcc ccttaccctg ctgcagggag tatgtgagaa ttcggtacgc 1140

tgaaatcacc agtctctctc tacaaatcta tctctctcta ttttctccat aaataatgtg 1200

tgagtagttt cccgataagg gaaattaggg ttcttatagg gtttcgctca tgtgttgagc 1260

atataagaaa cccttagtat gtatttgtat ttgtaaaata cttctatcaa taaaatttct 1320

aattcctaaa accaaaatcc agtactaaaa tccagatctc ctaaagtccc tatagatctt 1380

tgtcgtgaat ataaaccaga cacgagacga ctaaacctgg agcccagacg ccgttcgaag 1440

ctagaagtac cgcttaggca ggaggccgtt agggaaaaga tgctaaggca gggttggtta 1500

cgttgactcc cccgtaggtt tggtttaaat atgatgaagt ggacggaagg aaggaggaag 1560

acaaggaagg ataaggttgc aggccctgtg caaggtaaga agatggaaat ttgatagagg 1620

tacgctacta tacttatact atacgctaag ggaatgcttg tatttatacc ctataccccc 1680

taataacccc ttatcaattt aagaaataat ccgcataagc ccccgcttaa aaattggtat 1740

cagagccatg aataggtcta tgaccaaaac tcaagaggat aaaacctcac caaaatacga 1800

aagagttctt aactctaaag ataaaagatc tttcaagatc aaaactagt 1849

<210> 12

<211> 2133

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggccactg tgaacaactg gctcgctttc tccctctccc cgcaggagct gccgccctcc 60

cagacgacgg actccacact catctcggcc gccaccgccg accatgtctc cggcgatgtc 120

tgcttcaaca tcccccaaga ttggagcatg aggggatcag agctttcggc gctcgtcgcg 180

gagccgaagc tggaggactt cctcggcggc atctccttct ccgagcagca tcacaaggcc 240

aactgcaaca tgatacccag cactagcagc acagtttgct acgcgagctc aggtgctagc 300

accggctacc atcaccagct gtaccaccag cccaccagct cagcgctcca cttcgcggac 360

tccgtaatgg tggcctcctc ggccggtgtc cacgacggcg gtgccatgct cagcgcggcc 420

gccgctaacg gtgtcgctgg cgctgccagt gccaacggcg gcggcatcgg gctgtccatg 480

attaagaact ggctgcggag ccaaccggcg cccatgcagc cgagggtggc ggcggctgag 540

ggcgcgcagg ggctctcttt gtccatgaac atggcgggga cgacccaagg cgctgctggc 600

atgccacttc tcgctggaga gcgcgcacgg gcgcccgaga gtgtatcgac gtcagcacag 660

ggtggagccg tcgtcgtcac ggcgccgaag gaggatagcg gtggcagcgg tgttgccggc 720

gctctagtag ccgtgagcac ggacacgggt ggcagcggcg gcgcgtcggc tgacaacacg 780

gcaaggaaga cggtggacac gttcgggcag cgcacgtcga tttaccgtgg cgtgacaagg 840

catagatgga ctgggagata tgaggcacat ctttgggata acagttgcag aagggaaggg 900

caaactcgta agggtcgtca agtctattta ggtggctatg ataaagagga gaaagctgct 960

agggcttatg atcttgctgc tctgaagtac tggggtgcca caacaacaac aaattttcca 1020

gtgagtaact acgaaaagga gctcgaggac atgaagcaca tgacaaggca ggagtttgta 1080

gcgtctctga gaaggaagag cagtggtttc tccagaggtg catccattta caggggagtg 1140

actaggcatc accaacatgg aagatggcaa gcacggattg gacgagttgc agggaacaag 1200

gatctttact tgggcacctt cagcacccag gaggaggcag cggaggcgta cgacatcgcg 1260

gcgatcaagt tccgcggcct caacgccgtc accaacttcg acatgagccg ctacgacgtg 1320

aagagcatcc tggacagcag cgccctcccc atcggcagcg ccgccaagcg cctcaaggag 1380

gccgaggccg cagcgtccgc gcagcaccac cacgccggcg tggtgagcta cgacgtcggc 1440

cgcatcgcct cgcagctcgg cgacggcgga gccctggcgg cggcgtacgg cgcgcactac 1500

cacggcgccg cctggccgac catcgcgttc cagccgggcg ccgccagcac aggcctgtac 1560

cacccgtacg cgcagcagcc aatgcgcggc ggcgggtggt gcaagcagga gcaggaccac 1620

gcggtgatcg cggccgcgca cagcctgcag gacctccacc acctgaacct gggcgcggcc 1680

ggcgcgcacg actttttctc ggcagggcag caggccgccg ccgctgcgat gcacggcctg 1740

ggtagcatcg acagtgcgtc gctcgagcac agcaccggct ccaactccgt cgtctacaac 1800

ggcggggtcg gcgacagcaa cggcgccagc gccgtcggcg gcagtggcgg tggctacatg 1860

atgccgatga gcgctgccgg agcaaccact acatcggcaa tggtgagcca cgagcaggtg 1920

catgcacggg cctacgacga agccaagcag gctgctcaga tggggtacga gagctacctg 1980

gtgaacgcgg agaacaatgg tggcggaagg atgtctgcat gggggactgt cgtgtctgca 2040

gccgcggcgg cagcagcaag cagcaacgac aacatggccg ccgacgtcgg ccatggcggc 2100

gcgcagctct tcagtgtctg gaacgacact taa 2133

<210> 13

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggatctta gacttatttt tggacctact tgtactggaa agacttctac tgctattaga 60

cttgctcaac aaactggact tcctgttctt tctcttgata gagttcaatg ttgtcctcaa 120

ctttctactg gatctggaag acctactgtt gaagaattga agggaactac tagactttat 180

cttgaagata gacctcttgt taagggaatt attgctgcta agcaagctca tgaaagactt 240

attggagaag tttataatta tgaagctcat ggaggactta ttcttgaagg aggatctatt 300

tctcttctta gatgtatggc tcaatcttct tattggtcaa ctgattttag atggcatatt 360

attagacata aacttgctga tgaagaaact tttatgaatg ctgctaaggc tagagttaga 420

caaatgctta gacctgctgt tggaccttct attattcaag aacttgttca tctttggaat 480

gaacctagac ttagacctat tcttaaagaa attgatggat atagatatgc tatgcttttt 540

gcttctcaaa atcaaattac tcctgatatg cttcttcaac ttgatcctga tatggaagga 600

gaacttattc atggaattgc tcaagaatat cttattcatg ctagaagaca agaacaagag 660

tttcctcctg tttctgttgt tgcttttgaa ggatttgaag gacctccttt tggaatgtgt 720

<210> 14

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Met Ala Ser Ser Glu Asn Val Ile Thr Glu Phe Met Arg Phe Lys Val

1 5 10 15

Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys Leu Lys Val

35 40 45

Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln

50 55 60

Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro

65 70 75 80

Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val

85 90 95

Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser

100 105 110

Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly Val Asn

115 120 125

Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu

130 135 140

Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu

145 150 155 160

Thr His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val Glu

165 170 175

Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Tyr

180 185 190

Tyr Tyr Val Asp Ala Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr

195 200 205

Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu Phe

210 215 220

Leu

225

<210> 15

<211> 397

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Met Met Ser Leu Ser Gly Ser Ser Gly Arg Thr Ile Gly Arg Pro Pro

1 5 10 15

Phe Thr Pro Thr Gln Trp Glu Glu Leu Glu His Gln Ala Leu Ile Tyr

20 25 30

Lys Tyr Met Val Ser Gly Val Pro Val Pro Pro Glu Leu Ile Phe Ser

35 40 45

Ile Arg Arg Ser Leu Asp Thr Ser Leu Val Ser Arg Leu Leu Pro His

50 55 60

Gln Ser Leu Gly Trp Gly Cys Tyr Gln Met Gly Phe Gly Arg Lys Pro

65 70 75 80

Asp Pro Glu Pro Gly Arg Cys Arg Arg Thr Asp Gly Lys Lys Trp Arg

85 90 95

Cys Ser Arg Glu Ala Tyr Pro Asp Ser Lys Tyr Cys Glu Lys His Met

100 105 110

His Arg Gly Arg Asn Arg Ala Arg Lys Ser Leu Asp Gln Asn Gln Thr

115 120 125

Thr Thr Thr Pro Leu Thr Ser Pro Ser Leu Ser Phe Thr Asn Asn Asn

130 135 140

Asn Pro Ser Pro Thr Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ser Ser Ser

145 150 155 160

Thr Thr Tyr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Met Asp Ala Tyr Ser Asn Ser

165 170 175

Asn Arg Phe Gly Leu Gly Gly Ser Ser Ser Asn Thr Arg Gly Tyr Phe

180 185 190

Asn Ser His Ser Leu Asp Tyr Pro Tyr Pro Ser Thr Ser Pro Lys Gln

195 200 205

Gln Gln Gln Thr Leu His His Ala Ser Ala Leu Ser Leu His Gln Asn

210 215 220

Thr Asn Ser Thr Ser Gln Phe Asn Val Leu Ala Ser Ala Thr Asp His

225 230 235 240

Lys Asp Phe Arg Tyr Phe Gln Gly Ile Gly Glu Arg Val Gly Gly Val

245 250 255

Gly Glu Arg Thr Phe Phe Pro Glu Ala Ser Arg Ser Phe Gln Asp Ser

260 265 270

Pro Tyr His His His Gln Gln Pro Leu Ala Thr Val Met Asn Asp Pro

275 280 285

Tyr His His Cys Ser Thr Asp His Asn Lys Ile Asp His His His Thr

290 295 300

Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gln His Leu His His Asp His Asp His

305 310 315 320

Arg Gln Gln Gln Cys Phe Val Leu Gly Ala Asp Met Phe Asn Lys Pro

325 330 335

Thr Arg Ser Val Leu Ala Asn Ser Ser Arg Gln Asp Gln Asn Gln Glu

340 345 350

Glu Asp Glu Lys Asp Ser Ser Glu Ser Ser Lys Lys Ser Leu His His

355 360 365

Phe Phe Gly Glu Asp Trp Ala Gln Asn Lys Asn Ser Ser Asp Ser Trp

370 375 380

Leu Asp Leu Ser Ser His Ser Arg Leu Asp Thr Gly Ser

385 390 395

<210> 16

<211> 409

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Met Ala Met Pro Tyr Ala Ser Leu Ser Pro Ala Gly Asp Arg Arg Ser

1 5 10 15

Ser Pro Ala Ala Thr Ala Ser Leu Leu Pro Phe Cys Arg Ser Ser Pro

20 25 30

Phe Ser Ala Gly Gly Gly Asn Gly Gly Met Gly Glu Glu Ala Arg Met

35 40 45

Asp Gly Arg Trp Met Ala Arg Pro Val Pro Phe Thr Ala Ala Gln Tyr

50 55 60

Glu Glu Leu Glu His Gln Ala Leu Ile Tyr Lys Tyr Leu Val Ala Gly

65 70 75 80

Val Pro Val Pro Pro Asp Leu Val Leu Pro Ile Arg Arg Gly Ile Glu

85 90 95

Ser Leu Ala Ala Arg Phe Tyr His Asn Pro Leu Ala Ile Gly Tyr Gly

100 105 110

Ser Tyr Leu Gly Lys Lys Val Asp Pro Glu Pro Gly Arg Cys Arg Arg

115 120 125

Thr Asp Gly Lys Lys Trp Arg Cys Ala Lys Glu Ala Ala Ser Asp Ser

130 135 140

Lys Tyr Cys Glu Arg His Met His Arg Gly Arg Asn Arg Ser Arg Lys

145 150 155 160

Pro Val Glu Thr Gln Leu Val Pro His Thr Gln Pro Pro Ala Ala Ser

165 170 175

Ala Val Pro Pro Leu Ala Thr Gly Phe His Ser His Ser Leu Tyr Pro

180 185 190

Ala Ile Gly Gly Ser Thr Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asn Asn Gly

195 200 205

Met Ser Met Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ala Leu Gly Pro Pro Gln Gln

210 215 220

His Met Gly Ser Asn Ala Ala Ser Pro Tyr Ala Ala Leu Gly Gly Ala

225 230 235 240

Gly Thr Cys Lys Asp Phe Arg Tyr Thr Ala Tyr Gly Ile Arg Ser Leu

245 250 255

Ala Asp Glu His Ser Gln Leu Met Thr Glu Ala Met Asn Thr Ser Val

260 265 270

Glu Asn Pro Trp Arg Leu Pro Pro Ser Ser Gln Thr Thr Ser Phe Pro

275 280 285

Leu Ser Ser Tyr Ala Pro Gln Leu Gly Ala Thr Ser Asp Leu Gly Gln

290 295 300

Asn Asn Asn His Asn Asn Ser Ser Ser Asn Ser Ala Val Lys Ser Glu

305 310 315 320

Arg Gln Gln Pro Leu Ser Phe Pro Gly Cys Gly Asp Phe Gly Gly Gly

325 330 335

Gly Met Asp Ser Ala Lys Gln Glu Asn Gln Thr Leu Arg Pro Phe Phe

340 345 350

Asp Glu Trp Pro Lys Thr Arg Asp Ser Trp Ser Asp Leu Thr Asp Asp

355 360 365

Asn Ser Ser Leu Ala Ser Phe Ser Ala Thr Gln Leu Ser Ile Ser Ile

370 375 380

Pro Met Thr Ser Ser Glu Phe Ser Ala Ala Ser Ser Gln Ser Pro Asn

385 390 395 400

Gly Met Leu Phe Ala Gly Glu Met Tyr

405

<210> 17

<211> 205

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Thr Val Thr Thr Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Leu Asp Glu Asn Lys Gln

1 5 10 15

Leu Ile Leu Ala Ile Leu Asp Asn Gln Asn Asn Gly Lys Val Glu Glu

20 25 30

Cys Ala Arg Asn Gln Ala Lys Leu Gln His Asn Leu Met Tyr Leu Ala

35 40 45

Ala Ile Ala Asp Ser Gln Pro Pro Gln Thr Ala Ala Met Ser Gln Tyr

50 55 60

Pro Ser Asn Leu Met Met Gln Ser Gly Ala Arg Tyr Met Pro Gln Gln

65 70 75 80

Ser Ala Gln Met Met Ala Pro Gln Ser Leu Met Ala Ala Arg Ser Ser

85 90 95

Met Met Tyr Ala Gln Pro Ala Leu Ser Pro Leu Gln Gln Gln Gln Gln

100 105 110

Gln Ala Ala Ala Ala His Gly Gln Leu Gly Met Gly Ser Gly Gly Thr

115 120 125

Thr Ser Gly Phe Ser Ile Leu His Gly Glu Ala Ser Met Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ala Gly Asn Ser Met Met Asn Ala Gly Val Phe Ser Asp Phe

145 150 155 160

Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Lys Glu Gly Ser Thr

165 170 175

Ser Leu Ser Val Asp Val Arg Gly Ala Asn Ser Gly Ala Gln Ser Gly

180 185 190

Asp Gly Glu Tyr Leu Lys Gly Thr Glu Glu Glu Gly Ser

195 200 205

<210> 18

<211> 639

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Met Ala Met Pro Tyr Ala Ser Leu Ser Pro Ala Gly Asp Arg Arg Ser

1 5 10 15

Ser Pro Ala Ala Thr Ala Ser Leu Leu Pro Phe Cys Arg Ser Ser Pro

20 25 30

Phe Ser Ala Gly Gly Gly Asn Gly Gly Met Gly Glu Glu Ala Arg Met

35 40 45

Asp Gly Arg Trp Met Ala Arg Pro Val Pro Phe Thr Ala Ala Gln Tyr

50 55 60

Glu Glu Leu Glu His Gln Ala Leu Ile Tyr Lys Tyr Leu Val Ala Gly

65 70 75 80

Val Pro Val Pro Pro Asp Leu Val Leu Pro Ile Arg Arg Gly Ile Glu

85 90 95

Ser Leu Ala Ala Arg Phe Tyr His Asn Pro Leu Ala Ile Gly Tyr Gly

100 105 110

Ser Tyr Leu Gly Lys Lys Val Asp Pro Glu Pro Gly Arg Cys Arg Arg

115 120 125

Thr Asp Gly Lys Lys Trp Arg Cys Ala Lys Glu Ala Ala Ser Asp Ser

130 135 140

Lys Tyr Cys Glu Arg His Met His Arg Gly Arg Asn Arg Ser Arg Lys

145 150 155 160

Pro Val Glu Thr Gln Leu Val Pro His Thr Gln Pro Pro Ala Ala Ser

165 170 175

Ala Val Pro Pro Leu Ala Thr Gly Phe His Ser His Ser Leu Tyr Pro

180 185 190

Ala Ile Gly Gly Ser Thr Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asn Asn Gly

195 200 205

Met Ser Met Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ala Leu Gly Pro Pro Gln Gln

210 215 220

His Met Gly Ser Asn Ala Ala Ser Pro Tyr Ala Ala Leu Gly Gly Ala

225 230 235 240

Gly Thr Cys Lys Asp Phe Arg Tyr Thr Ala Tyr Gly Ile Arg Ser Leu

245 250 255

Ala Asp Glu His Ser Gln Leu Met Thr Glu Ala Met Asn Thr Ser Val

260 265 270

Glu Asn Pro Trp Arg Leu Pro Pro Ser Ser Gln Thr Thr Ser Phe Pro

275 280 285

Leu Ser Ser Tyr Ala Pro Gln Leu Gly Ala Thr Ser Asp Leu Gly Gln

290 295 300

Asn Asn Asn His Asn Asn Ser Ser Ser Asn Ser Ala Val Lys Ser Glu

305 310 315 320

Arg Gln Gln Pro Leu Ser Phe Pro Gly Cys Gly Asp Phe Gly Gly Gly

325 330 335

Gly Met Asp Ser Ala Lys Gln Glu Asn Gln Thr Leu Arg Pro Phe Phe

340 345 350

Asp Glu Trp Pro Lys Thr Arg Asp Ser Trp Ser Asp Leu Thr Asp Asp

355 360 365

Asn Ser Ser Leu Ala Ser Phe Ser Ala Thr Gln Leu Ser Ile Ser Ile

370 375 380

Pro Met Thr Ser Ser Glu Phe Ser Ala Ala Ser Ser Gln Ser Pro Asn

385 390 395 400

Gly Met Leu Phe Ala Gly Glu Met Tyr Ala Ala Ala Ala Met Gln Gln

405 410 415

Gln His Leu Met Gln Met Asn Gln Gly Met Met Gly Gly Tyr Ala Ser

420 425 430

Pro Thr Thr Val Thr Thr Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Leu Asp Glu Asn

435 440 445

Lys Gln Leu Ile Leu Ala Ile Leu Asp Asn Gln Asn Asn Gly Lys Val

450 455 460

Glu Glu Cys Ala Arg Asn Gln Ala Lys Leu Gln His Asn Leu Met Tyr

465 470 475 480

Leu Ala Ala Ile Ala Asp Ser Gln Pro Pro Gln Thr Ala Ala Met Ser

485 490 495

Gln Tyr Pro Ser Asn Leu Met Met Gln Ser Gly Ala Arg Tyr Met Pro

500 505 510

Gln Gln Ser Ala Gln Met Met Ala Pro Gln Ser Leu Met Ala Ala Arg

515 520 525

Ser Ser Met Met Tyr Ala Gln Pro Ala Leu Ser Pro Leu Gln Gln Gln

530 535 540

Gln Gln Gln Ala Ala Ala Ala His Gly Gln Leu Gly Met Gly Ser Gly

545 550 555 560

Gly Thr Thr Ser Gly Phe Ser Ile Leu His Gly Glu Ala Ser Met Gly

565 570 575

Gly Gly Gly Gly Ala Gly Asn Ser Met Met Asn Ala Gly Val Phe Ser

580 585 590

Asp Phe Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Lys Glu Gly

595 600 605

Ser Thr Ser Leu Ser Val Asp Val Arg Gly Ala Asn Ser Gly Ala Gln

610 615 620

Ser Gly Asp Gly Glu Tyr Leu Lys Gly Thr Glu Glu Glu Gly Ser

625 630 635

<210> 19

<211> 302

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Met Ala Ala Asn Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ser Val Ala Ala Pro Ala Val Cys Arg Pro Ser Gly Ser Arg Trp

20 25 30

Thr Pro Thr Pro Glu Gln Ile Arg Met Leu Lys Glu Leu Tyr Tyr Gly

35 40 45

Cys Gly Ile Arg Ser Pro Ser Ser Glu Gln Ile Gln Arg Ile Thr Ala

50 55 60

Met Leu Arg Gln His Gly Lys Ile Glu Gly Lys Asn Val Phe Tyr Trp

65 70 75 80

Phe Gln Asn His Lys Ala Arg Glu Arg Gln Lys Arg Arg Leu Thr Ser

85 90 95

Leu Asp Val Asn Val Pro Ala Ala Gly Ala Ala Asp Ala Thr Thr Ser

100 105 110

Gln Leu Gly Val Leu Ser Leu Ser Ser Pro Pro Pro Ser Gly Ala Ala

115 120 125

Pro Pro Ser Pro Thr Leu Gly Phe Tyr Ala Ala Gly Asn Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Ala Val Leu Leu Asp Thr Ser Ser Asp Trp Gly Ser Ser Gly Ala

145 150 155 160

Ala Met Ala Thr Glu Thr Cys Phe Leu Gln Asp Tyr Met Gly Val Thr

165 170 175

Asp Thr Gly Ser Ser Ser Gln Trp Pro Arg Phe Ser Ser Ser Asp Thr

180 185 190

Ile Met Ala Ala Ala Ala Ala Arg Ala Ala Thr Thr Arg Ala Pro Glu

195 200 205

Thr Leu Pro Leu Phe Pro Thr Cys Gly Asp Asp Gly Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Ser Ser Tyr Leu Pro Phe Trp Gly Ala Ala Ser Thr Thr Ala Gly Ala

225 230 235 240

Thr Ser Ser Val Ala Ile Gln Gln Gln His Gln Leu Gln Glu Gln Tyr

245 250 255

Ser Phe Tyr Ser Asn Ser Asn Ser Thr Gln Leu Ala Gly Thr Gly Asn

260 265 270

Gln Asp Val Ser Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Glu Leu Ser

275 280 285

Leu Ser Ser Trp Cys Ser Pro Tyr Pro Ala Ala Gly Ser Met

290 295 300

<210> 20

<211> 710

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Met Ala Thr Val Asn Asn Trp Leu Ala Phe Ser Leu Ser Pro Gln Glu

1 5 10 15

Leu Pro Pro Ser Gln Thr Thr Asp Ser Thr Leu Ile Ser Ala Ala Thr

20 25 30

Ala Asp His Val Ser Gly Asp Val Cys Phe Asn Ile Pro Gln Asp Trp

35 40 45

Ser Met Arg Gly Ser Glu Leu Ser Ala Leu Val Ala Glu Pro Lys Leu

50 55 60

Glu Asp Phe Leu Gly Gly Ile Ser Phe Ser Glu Gln His His Lys Ala

65 70 75 80

Asn Cys Asn Met Ile Pro Ser Thr Ser Ser Thr Val Cys Tyr Ala Ser

85 90 95

Ser Gly Ala Ser Thr Gly Tyr His His Gln Leu Tyr His Gln Pro Thr

100 105 110

Ser Ser Ala Leu His Phe Ala Asp Ser Val Met Val Ala Ser Ser Ala

115 120 125

Gly Val His Asp Gly Gly Ala Met Leu Ser Ala Ala Ala Ala Asn Gly

130 135 140

Val Ala Gly Ala Ala Ser Ala Asn Gly Gly Gly Ile Gly Leu Ser Met

145 150 155 160

Ile Lys Asn Trp Leu Arg Ser Gln Pro Ala Pro Met Gln Pro Arg Val

165 170 175

Ala Ala Ala Glu Gly Ala Gln Gly Leu Ser Leu Ser Met Asn Met Ala

180 185 190

Gly Thr Thr Gln Gly Ala Ala Gly Met Pro Leu Leu Ala Gly Glu Arg

195 200 205

Ala Arg Ala Pro Glu Ser Val Ser Thr Ser Ala Gln Gly Gly Ala Val

210 215 220

Val Val Thr Ala Pro Lys Glu Asp Ser Gly Gly Ser Gly Val Ala Gly

225 230 235 240

Ala Leu Val Ala Val Ser Thr Asp Thr Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser

245 250 255

Ala Asp Asn Thr Ala Arg Lys Thr Val Asp Thr Phe Gly Gln Arg Thr

260 265 270

Ser Ile Tyr Arg Gly Val Thr Arg His Arg Trp Thr Gly Arg Tyr Glu

275 280 285

Ala His Leu Trp Asp Asn Ser Cys Arg Arg Glu Gly Gln Thr Arg Lys

290 295 300

Gly Arg Gln Val Tyr Leu Gly Gly Tyr Asp Lys Glu Glu Lys Ala Ala

305 310 315 320

Arg Ala Tyr Asp Leu Ala Ala Leu Lys Tyr Trp Gly Ala Thr Thr Thr

325 330 335

Thr Asn Phe Pro Val Ser Asn Tyr Glu Lys Glu Leu Glu Asp Met Lys

340 345 350

His Met Thr Arg Gln Glu Phe Val Ala Ser Leu Arg Arg Lys Ser Ser

355 360 365

Gly Phe Ser Arg Gly Ala Ser Ile Tyr Arg Gly Val Thr Arg His His

370 375 380

Gln His Gly Arg Trp Gln Ala Arg Ile Gly Arg Val Ala Gly Asn Lys

385 390 395 400

Asp Leu Tyr Leu Gly Thr Phe Ser Thr Gln Glu Glu Ala Ala Glu Ala

405 410 415

Tyr Asp Ile Ala Ala Ile Lys Phe Arg Gly Leu Asn Ala Val Thr Asn

420 425 430

Phe Asp Met Ser Arg Tyr Asp Val Lys Ser Ile Leu Asp Ser Ser Ala

435 440 445

Leu Pro Ile Gly Ser Ala Ala Lys Arg Leu Lys Glu Ala Glu Ala Ala

450 455 460

Ala Ser Ala Gln His His His Ala Gly Val Val Ser Tyr Asp Val Gly

465 470 475 480

Arg Ile Ala Ser Gln Leu Gly Asp Gly Gly Ala Leu Ala Ala Ala Tyr

485 490 495

Gly Ala His Tyr His Gly Ala Ala Trp Pro Thr Ile Ala Phe Gln Pro

500 505 510

Gly Ala Ala Ser Thr Gly Leu Tyr His Pro Tyr Ala Gln Gln Pro Met

515 520 525

Arg Gly Gly Gly Trp Cys Lys Gln Glu Gln Asp His Ala Val Ile Ala

530 535 540

Ala Ala His Ser Leu Gln Asp Leu His His Leu Asn Leu Gly Ala Ala

545 550 555 560

Gly Ala His Asp Phe Phe Ser Ala Gly Gln Gln Ala Ala Ala Ala Ala

565 570 575

Met His Gly Leu Gly Ser Ile Asp Ser Ala Ser Leu Glu His Ser Thr

580 585 590

Gly Ser Asn Ser Val Val Tyr Asn Gly Gly Val Gly Asp Ser Asn Gly

595 600 605

Ala Ser Ala Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Tyr Met Met Pro Met Ser

610 615 620

Ala Ala Gly Ala Thr Thr Thr Ser Ala Met Val Ser His Glu Gln Val

625 630 635 640

His Ala Arg Ala Tyr Asp Glu Ala Lys Gln Ala Ala Gln Met Gly Tyr

645 650 655

Glu Ser Tyr Leu Val Asn Ala Glu Asn Asn Gly Gly Gly Arg Met Ser

660 665 670

Ala Trp Gly Thr Val Val Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ser

675 680 685

Asn Asp Asn Met Ala Ala Asp Val Gly His Gly Gly Ala Gln Leu Phe

690 695 700

Ser Val Trp Asn Asp Thr

705 710

<210> 21

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Met Asp Leu Arg Leu Ile Phe Gly Pro Thr Cys Thr Gly Lys Thr Ser

1 5 10 15

Thr Ala Ile Arg Leu Ala Gln Gln Thr Gly Leu Pro Val Leu Ser Leu

20 25 30

Asp Arg Val Gln Cys Cys Pro Gln Leu Ser Thr Gly Ser Gly Arg Pro

35 40 45

Thr Val Glu Glu Leu Lys Gly Thr Thr Arg Leu Tyr Leu Glu Asp Arg

50 55 60

Pro Leu Val Lys Gly Ile Ile Ala Ala Lys Gln Ala His Glu Arg Leu

65 70 75 80

Ile Gly Glu Val Tyr Asn Tyr Glu Ala His Gly Gly Leu Ile Leu Glu

85 90 95

Gly Gly Ser Ile Ser Leu Leu Arg Cys Met Ala Gln Ser Ser Tyr Trp

100 105 110

Ser Thr Asp Phe Arg Trp His Ile Ile Arg His Lys Leu Ala Asp Glu

115 120 125

Glu Thr Phe Met Asn Ala Ala Lys Ala Arg Val Arg Gln Met Leu Arg

130 135 140

Pro Ala Val Gly Pro Ser Ile Ile Gln Glu Leu Val His Leu Trp Asn

145 150 155 160

Glu Pro Arg Leu Arg Pro Ile Leu Lys Glu Ile Asp Gly Tyr Arg Tyr

165 170 175

Ala Met Leu Phe Ala Ser Gln Asn Gln Ile Thr Pro Asp Met Leu Leu

180 185 190

Gln Leu Asp Pro Asp Met Glu Gly Glu Leu Ile His Gly Ile Ala Gln

195 200 205

Glu Tyr Leu Ile His Ala Arg Arg Gln Glu Gln Glu Phe Pro Pro Val

210 215 220

Ser Val Val Ala Phe Glu Gly Phe Glu Gly Pro Pro Phe Gly Met Cys

225 230 235 240

<210> 22

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aacgatactc gagtaatcta gaatggcctc ctccgagaac gtc 43

<210> 23

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tacgaacgaa agctctgagc tcctacagga acaggtggtg gcg 43

<210> 24

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

aacgacggcc agtgccacta gtgatcagga tattcttgtt taag 44

<210> 25

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tcatatggta ccctgttaat cagaaaaact caga 34

<210> 26

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

acagggtacc atatgaagat gaagatgaaa tat 33

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tgttgacctg caggcatgcc ttatctttaa tcatattcca 40

<210> 28

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tgagtttttc tgattaacag atggccactg tgaacaactg gctc 44

<210> 29

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

atttcatctt catcttcata tttaagtgtc gttccagaca ctgaa 45

<210> 30

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gtttttctga ttaacagatg atgagtctaa gtggaagtag cggga 45

<210> 31

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

catcttcatc ttcatattta gctaccagtg tcgagtcttg agtg 44

<210> 32

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gtttttctga ttaacagatg gcgatgccgt atgcctctct t 41

<210> 33

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gcatggcagc ggccgcgtac atctcgccgg cgaacagcat 40

<210> 34

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cgcggccgct gccatgcagc agcaacacct gatgcaga 38

<210> 35

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

catcttcatc ttcatatcta gctgccttcc tcctcggtgc c 41

<210> 36

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

aaaacgacgg ccagtgcccc tagggaaccg caacgttgaa ggagcca 47

<210> 37

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

aacaagaata tcctgatcac tagttttgat cttgaaagat 40

<210> 38

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gtttttctga ttaacagatg gatcttagac ttatttt 37

<210> 39

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

atcttcatct tcatatttaa cacattccaa aaggaggtc 39

<210> 40

<211> 12498

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

ggtttacccg ccaatatatc ctgtcaaaca ctgatagttt aaactgaagg cgggaaacga 60

caatctgatc caagctcaag ctgctctagc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg 120

aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg 180

caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg 240

ccagtgccaa gcttactagt gatcaggata ttcttgttta agatgttgaa ctctatggag 300

gtttgtatga actgatgatc taggaccgga taagttccct tcttcatagc gaacttattc 360

aaagaatgtt ttgtgtatca ttcttgttac attgttatta atgaaaaaat attattggtc 420

attggactga acacgagtgt taaatatgga ccaggcccca aataagatcc attgatatat 480

gaattaaata acaagaataa atcgagtcac caaaccactt gcctttttta acgagacttg 540

ttcaccaact tgatacaaaa gtcattatcc tatgcaaatc aataatcata caaaaatatc 600

caataacact aaaaaattaa aagaaatgga taatttcaca atatgttata cgataaagaa 660

gttacttttc caagaaattc actgatttta taagcccact tgcattagat aaatggcaaa 720

aaaaaacaaa aaggaaaaga aataaagcac gaagaattct agaaaatacg aaatacgctt 780

caatgcagtg ggacccacgg ttcaattatt gccaattttc agctccaccg tatatttaaa 840

aaataaaacg ataatgctaa aaaaatataa atcgtaacga tcgttaaatc tcaacggctg 900

gatcttatga cgaccgttag aaattgtggt tgtcgacgag tcagtaataa acggcgtcaa 960

agtggttgca gccggcacac acgagtcgtg tttatcaact caaagcacaa atacttttcc 1020

tcaacctaaa aataaggcaa ttagccaaaa acaactttgc gtgtaaacaa cgctcaatac 1080

acgtgtcatt ttattattag ctattgcttc accgccttag ctttctcgtg acctagtcgt 1140

cctcgtcttt tcttcttctt cttctataaa acaataccca aagagctctt cttcttcaca 1200

attcagattt caatttctca aaatcttaaa aactttctct caattctctc taccgtgatc 1260

aaggtaaatt tctgtgttcc ttattctctc aaaatcttcg attttgtttt cgttcgatcc 1320

caatttcgta tatgttcttt ggtttagatt ctgttaatct tagatcgaag acgattttct 1380

gggtttgatc gttagatatc atcttaattc tcgattaggg tttcatagat atcatccgat 1440

ttgttcaaat aatttgagtt ttgtcgaata attactcttc gatttgtgat ttctatctag 1500

atctggtgtt agtttctagt ttgtgcgatc gaatttgtcg attaatctga gtttttctga 1560

ttaacagggt accatatgaa gatgaagatg aaatatttgg tgtgtcaaat aaaaagcttg 1620

tgtgcttaag tttgtgtttt tttcttggct tgttgtgtta tgaatttgtg gctttttcta 1680

atattaaatg aatgtaagat ctcattataa tgaataaaca aatgtttcta taatccattg 1740

tgaatgtttt gttggatctc ttctgcagca tataactact gtatgtgcta tggtatggac 1800

tatggaatat gattaaagat aaggcatgcc tgcaggtcaa catggtggag cacgacacac 1860

ttgtctactc caaaaatatc aaagatacag tctcagaaga ccaaagggca attgagactt 1920

ttcaacaaag ggtaatatcc ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact 1980

ttattgtgaa gatagtggaa aaggaaggtg gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag 2040

gaaaggccat cgttgaagat gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca 2100

cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat 2160

gtgataacat ggtggagcac gacacacttg tctactccaa aaatatcaaa gatacagtct 2220

cagaagacca aagggcaatt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg 2280

gattccattg cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct 2340

cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca 2400

gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa 2460

ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg gatgacgcac 2520

aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg aagttcattt catttggaga 2580

ggacctcgac ctcaacacaa catatacaaa acaaacgaat ctcaagcaat caagcattct 2640

acttctattg cagcaattta aatcatttct tttaaagcaa aagcaatttt ctgaaaattt 2700

tcaccattta cgaacgatac tcgagtaatc tagaatggcc tcctccgaga acgtcatcac 2760

cgagttcatg cgcttcaagg tgcgcatgga gggcaccgtg aacggccacg agttcgagat 2820

cgagggcgag ggcgagggcc gcccctacga gggccacaac accgtgaagc tgaaggtgac 2880

caagggcggc cccctgccct tcgcctggga catcctgtcc ccccagttcc agtacggctc 2940

caaggtgtac gtgaagcacc ccgccgacat ccccgactac aagaagctgt ccttccccga 3000

gggcttcaag tgggagcgcg tgatgaactt cgaggacggc ggcgtggcga ccgtgaccca 3060

ggactcctcc ctgcaggacg gctgcttcat ctacaaggtg aagttcatcg gcgtgaactt 3120

cccctccgac ggccccgtga tgcagaagaa gaccatgggc tgggaggcct ccaccgagcg 3180

cctgtacccc cgcgacggcg tgctgaaggg cgagacccac aaggccctga agctgaagga 3240

cggcggccac tacctggtgg agttcaagtc catctacatg gccaagaagc ccgtgcagct 3300

gcccggctac tactacgtgg acgccaagct ggacatcacc tcccacaacg aggactacac 3360

catcgtggag cagtacgagc gcaccgaggg ccgccaccac ctgttcctgt aggagctcag 3420

agctttcgtt cgtatcatcg gtttcgacaa cgttcgtcaa gttcaatgca tcagtttcat 3480

tgcgcacaca ccagaatcct actgagtttg agtattatgg cattgggaaa actgtttttc 3540

ttgtaccatt tgttgtgctt gtaatttact gtgtttttta ttcggttttc gctatcgaac 3600

tgtgaaatgg aaatggatgg agaagagtta atgaatgata tggtcctttt gttcattctc 3660

aaattaatat tatttgtttt ttctcttatt tgttgtgtgt tgaatttgaa attataagag 3720

atatgcaaac attttgtttt gagtaaaaat gtgtcaaatc gtggcctcta atgaccgaag 3780

ttaatatgag gagtaaaaca cttgtagttg taccattatg cttattcact aggcaacaaa 3840

tatattttca gacctagaaa agctgcaaat gttactgaat acaagtatgt cctcttgtgt 3900

tttagacatt tatgaacttt cctttatgta attttccaga atccttgtca gattctaatc 3960

attgctttat aattatagtt atactcatgg atttgtagtt gagtatgaaa atatttttta 4020

atgcatttta tgacttgcca attgattgac aacgaattcg taatcatggt catagctgtt 4080

tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa 4140

gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact 4200

gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 4260

ggggagaggc ggtttgcgta ttggctagag cagcttgcca acatggtgga gcacgacact 4320

ctcgtctact ccaagaatat caaagataca gtctcagaag accaaagggc tattgagact 4380

tttcaacaaa gggtaatatc gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac 4440

ttcatcaaaa ggacagtaga aaaggaaggt ggcacctaca aatgccatca ttgcgataaa 4500

ggaaaggcta tcgttcaaga tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc 4560

acgaggagca tcgtggaaaa agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga 4620

tgtgataaca tggtggagca cgacactctc gtctactcca agaatatcaa agatacagtc 4680

tcagaagacc aaagggctat tgagactttt caacaaaggg taatatcggg aaacctcctc 4740

ggattccatt gcccagctat ctgtcacttc atcaaaagga cagtagaaaa ggaaggtggc 4800

acctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggctatcg ttcaagatgc ctctgccgac 4860

agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca 4920

accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca 4980

caatcccact atccttcgca agaccttcct ctatataagg aagttcattt catttggaga 5040

ggacacgctg aaatcaccag tctctctcta caaatctatc tctctcgagc tttcgcagat 5100

ctgtcgatcg accatgggga ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg 5160

ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc 5220

cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg 5280

tgccctgaat gaactccagg acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt 5340

tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg 5400

cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat 5460

catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca 5520

ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca 5580

ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa 5640

ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacacat ggcgatgcct gcttgccgaa 5700

tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc 5760

ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga 5820

atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc 5880

cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg agcgggactc tggggttcgg atcgatcctc 5940

tagctagagt cgatcgacaa gctcgagttt ctccataata atgtgtgagt agttcccaga 6000

taagggaatt agggttccta tagggtttcg ctcatgtgtt gagcatataa gaaaccctta 6060

gtatgtattt gtatttgtaa aatacttcta tcaataaaat ttctaattcc taaaaccaaa 6120

atccagtact aaaatccaga tcccccgaat taattcggcg ttaattcagt acattaaaaa 6180

cgtccgcaat gtgttattaa gttgtctaag cgtcaatttg tttacaccac aatatatcct 6240

gccaccagcc agccaacagc tccccgaccg gcagctcggc acaaaatcac cactcgatac 6300

aggcagccca tcagtccggg acggcgtcag cgggagagcc gttgtaaggc ggcagacttt 6360

gctcatgtta ccgatgctat tcggaagaac ggcaactaag ctgccgggtt tgaaacacgg 6420

atgatctcgc ggagggtagc atgttgattg taacgatgac agagcgttgc tgcctgtgat 6480

caccgcggtt tcaaaatcgg ctccgtcgat actatgttat acgccaactt tgaaaacaac 6540

tttgaaaaag ctgttttctg gtatttaagg ttttagaatg caaggaacag tgaattggag 6600

ttcgtcttgt tataattagc ttcttggggt atctttaaat actgtagaaa agaggaagga 6660

aataataaat ggctaaaatg agaatatcac cggaattgaa aaaactgatc gaaaaatacc 6720

gctgcgtaaa agatacggaa ggaatgtctc ctgctaaggt atataagctg gtgggagaaa 6780

atgaaaacct atatttaaaa atgacggaca gccggtataa agggaccacc tatgatgtgg 6840

aacgggaaaa ggacatgatg ctatggctgg aaggaaagct gcctgttcca aaggtcctgc 6900

actttgaacg gcatgatggc tggagcaatc tgctcatgag tgaggccgat ggcgtccttt 6960

gctcggaaga gtatgaagat gaacaaagcc ctgaaaagat tatcgagctg tatgcggagt 7020

gcatcaggct ctttcactcc atcgacatat cggattgtcc ctatacgaat agcttagaca 7080

gccgcttagc cgaattggat tacttactga ataacgatct ggccgatgtg gattgcgaaa 7140

actgggaaga agacactcca tttaaagatc cgcgcgagct gtatgatttt ttaaagacgg 7200

aaaagcccga agaggaactt gtcttttccc acggcgacct gggagacagc aacatctttg 7260

tgaaagatgg caaagtaagt ggctttattg atcttgggag aagcggcagg gcggacaagt 7320

ggtatgacat tgccttctgc gtccggtcga tcagggagga tatcggggaa gaacagtatg 7380

tcgagctatt ttttgactta ctggggatca agcctgattg ggagaaaata aaatattata 7440

ttttactgga tgaattgttt tagtacctag aatgcatgac caaaatccct taacgtgagt 7500

tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 7560

tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 7620

gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 7680

agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 7740

tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 7800

ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 7860

cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 7920

tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 7980

acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 8040

gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 8100

ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 8160

tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 8220

attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 8280

cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc 8340

tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg cactctcagt acaatctgct 8400

ctgatgccgc atagttaagc cagtatacac tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc 8460

tgcgccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc 8520

atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc 8580

gtcatcaccg aaacgcgcga ggcagggtgc cttgatgtgg gcgccggcgg tcgagtggcg 8640

acggcgcggc ttgtccgcgc cctggtagat tgcctggccg taggccagcc atttttgagc 8700

ggccagcggc cgcgataggc cgacgcgaag cggcggggcg tagggagcgc agcgaccgaa 8760

gggtaggcgc tttttgcagc tcttcggctg tgcgctggcc agacagttat gcacaggcca 8820

ggcgggtttt aagagtttta ataagtttta aagagtttta ggcggaaaaa tcgccttttt 8880

tctcttttat atcagtcact tacatgtgtg accggttccc aatgtacggc tttgggttcc 8940

caatgtacgg gttccggttc ccaatgtacg gctttgggtt cccaatgtac gtgctatcca 9000

caggaaacag accttttcga cctttttccc ctgctagggc aatttgccct agcatctgct 9060

ccgtacatta ggaaccggcg gatgcttcgc cctcgatcag gttgcggtag cgcatgacta 9120

ggatcgggcc agcctgcccc gcctcctcct tcaaatcgta ctccggcagg tcatttgacc 9180

cgatcagctt gcgcacggtg aaacagaact tcttgaactc tccggcgctg ccactgcgtt 9240

cgtagatcgt cttgaacaac catctggctt ctgccttgcc tgcggcgcgg cgtgccaggc 9300

ggtagagaaa acggccgatg ccgggatcga tcaaaaagta atcggggtga accgtcagca 9360

cgtccgggtt cttgccttct gtgatctcgc ggtacatcca atcagctagc tcgatctcga 9420

tgtactccgg ccgcccggtt tcgctcttta cgatcttgta gcggctaatc aaggcttcac 9480

cctcggatac cgtcaccagg cggccgttct tggccttctt cgtacgctgc atggcaacgt 9540

gcgtggtgtt taaccgaatg caggtttcta ccaggtcgtc tttctgcttt ccgccatcgg 9600

ctcgccggca gaacttgagt acgtccgcaa cgtgtggacg gaacacgcgg ccgggcttgt 9660

ctcccttccc ttcccggtat cggttcatgg attcggttag atgggaaacc gccatcagta 9720

ccaggtcgta atcccacaca ctggccatgc cggccggccc tgcggaaacc tctacgtgcc 9780

cgtctggaag ctcgtagcgg atcacctcgc cagctcgtcg gtcacgcttc gacagacgga 9840

aaacggccac gtccatgatg ctgcgactat cgcgggtgcc cacgtcatag agcatcggaa 9900

cgaaaaaatc tggttgctcg tcgcccttgg gcggcttcct aatcgacggc gcaccggctg 9960

ccggcggttg ccgggattct ttgcggattc gatcagcggc cgcttgccac gattcaccgg 10020

ggcgtgcttc tgcctcgatg cgttgccgct gggcggcctg cgcggccttc aacttctcca 10080

ccaggtcatc acccagcgcc gcgccgattt gtaccgggcc ggatggtttg cgaccgctca 10140

cgccgattcc tcgggcttgg gggttccagt gccattgcag ggccggcagg caacccagcc 10200

gcttacgcct ggccaaccgc ccgttcctcc acacatgggg cattccacgg cgtcggtgcc 10260

tggttgttct tgattttcca tgccgcctcc tttagccgct aaaattcatc tactcattta 10320

ttcatttgct catttactct ggtagctgcg cgatgtattc agatagcagc tcggtaatgg 10380

tcttgccttg gcgtaccgcg tacatcttca gcttggtgtg atcctccgcc ggcaactgaa 10440

agttgacccg cttcatggct ggcgtgtctg ccaggctggc caacgttgca gccttgctgc 10500

tgcgtgcgct cggacggccg gcacttagcg tgtttgtgct tttgctcatt ttctctttac 10560

ctcattaact caaatgagtt ttgatttaat ttcagcggcc agcgcctgga cctcgcgggc 10620

agcgtcgccc tcgggttctg attcaagaac ggttgtgccg gcggcggcag tgcctgggta 10680

gctcacgcgc tgcgtgatac gggactcaag aatgggcagc tcgtacccgg ccagcgcctc 10740

ggcaacctca ccgccgatgc gcgtgccttt gatcgcccgc gacacgacaa aggccgcttg 10800

tagccttcca tccgtgacct caatgcgctg cttaaccagc tccaccaggt cggcggtggc 10860

ccatatgtcg taagggcttg gctgcaccgg aatcagcacg aagtcggctg ccttgatcgc 10920

ggacacagcc aagtccgccg cctggggcgc tccgtcgatc actacgaagt cgcgccggcc 10980

gatggccttc acgtcgcggt caatcgtcgg gcggtcgatg ccgacaacgg ttagcggttg 11040

atcttcccgc acggccgccc aatcgcgggc actgccctgg ggatcggaat cgactaacag 11100

aacatcggcc ccggcgagtt gcagggcgcg ggctagatgg gttgcgatgg tcgtcttgcc 11160

tgacccgcct ttctggttaa gtacagcgat aaccttcatg cgttcccctt gcgtatttgt 11220

ttatttactc atcgcatcat atacgcagcg accgcatgac gcaagctgtt ttactcaaat 11280

acacatcacc tttttagacg gcggcgctcg gtttcttcag cggccaagct ggccggccag 11340

gccgccagct tggcatcaga caaaccggcc aggatttcat gcagccgcac ggttgagacg 11400

tgcgcgggcg gctcgaacac gtacccggcc gcgatcatct ccgcctcgat ctcttcggta 11460

atgaaaaacg gttcgtcctg gccgtcctgg tgcggtttca tgcttgttcc tcttggcgtt 11520

cattctcggc ggccgccagg gcgtcggcct cggtcaatgc gtcctcacgg aaggcaccgc 11580

gccgcctggc ctcggtgggc gtcacttcct cgctgcgctc aagtgcgcgg tacagggtcg 11640

agcgatgcac gccaagcagt gcagccgcct ctttcacggt gcggccttcc tggtcgatca 11700

gctcgcgggc gtgcgcgatc tgtgccgggg tgagggtagg gcgggggcca aacttcacgc 11760

ctcgggcctt ggcggcctcg cgcccgctcc gggtgcggtc gatgattagg gaacgctcga 11820

actcggcaat gccggcgaac acggtcaaca ccatgcggcc ggccggcgtg gtggtgtcgg 11880

cccacggctc tgccaggcta cgcaggcccg cgccggcctc ctggatgcgc tcggcaatgt 11940

ccagtaggtc gcgggtgctg cgggccaggc ggtctagcct ggtcactgtc acaacgtcgc 12000

cagggcgtag gtggtcaagc atcctggcca gctccgggcg gtcgcgcctg gtgccggtga 12060

tcttctcgga aaacagcttg gtgcagccgg ccgcgtgcag ttcggcccgt tggttggtca 12120

agtcctggtc gtcggtgctg acgcgggcat agcccagcag gccagcggcg gcgctcttgt 12180

tcatggcgta atgtctccgg ttctagtcgc aagtattcta ctttatgcga ctaaaacacg 12240

cgacaagaaa acgccaggaa aagggcaggg cggcagcctg tcgcgtaact taggacttgt 12300

gcgacatgtc gttttcagaa gacggctgca ctgaacgtca gaagccgact gcactatagc 12360

agcggagggg ttggatcaaa gtactttgat cccgagggga accctgtggt tggcatgcac 12420

atacaaatgg acgaacggat aaaccttttc acgccctttt aaatatccga ttattctaat 12480

aaacgctctt ttctctta 12498

Claims

1.一种西瓜遗传转化的方法，所述方法包括

在西瓜遗传转化中表达生长调节基因；

其中所述生长调节基因为AtGRF5、TaGRF4-OsGIF1或ZmWUS+ZmBBM基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其中

i）所述AtGRF5为SEQ ID NO.4所示的核酸序列并且具有提高植物转化效率的功能的核酸，或者是可编码SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列并且具有提高植物转化效率的功能的蛋白的核酸序列；

ii）所述TaGRF4-OsGIF1为SEQ ID NO.7所示的核酸序列并且具有提高植物转化效率的功能的核酸，或者是可编码SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列并且具有提高植物转化效率的功能的蛋白的核酸序列；

iii）所述ZmWUS+ZmBBM为SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.12所示的核酸序列并且具有提高植物转化效率的功能的核酸，或者是可编码SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列并且具有提高植物转化效率的功能的蛋白的核酸序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述表达包括：

i）组成型表达：将生长调节基因核酸序列与表达调控元件可操作的连接，形成核酸构建体，其所述表达调控元件包括启动子和终止子，所述启动子包括拟南芥UBQ10启动子、Nos启动子或烟草花叶病毒35S启动子中的一种或多种，所述终止子包括烟草花叶病毒终止子CamT或拟南芥HspT终止子中的一种或多种；

ii）瞬时表达：直接在西瓜细胞中导入权利要求2所述氨基酸序列，或者是能翻译成所述氨基酸序列的mRNA核酸序列或DNA核酸序列。

4.根据权利要求3所述的方法，所述拟南芥UBQ10启动子的序列为SEQ ID NO.1所示的序列；所述Nos启动子的序列为SEQ ID NO.9所示的序列；所述烟草花叶病毒终止子CamT的序列为SEQ ID NO.10所示的序列；所述拟南芥HspT终止子的序列为SEQ ID NO.3所示的序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述遗传转化，指在目的植物细胞中表达外源核酸序列、mRNA序列和氨基酸序列，其中所述外源核酸序列包含蛋白质基因功能的启动子、基因、终止子、抑制子和增强子，其中所述外源核酸序列为改变植物的性状，或者改变植物细胞的基因组序列或转录组序列。

6.根据权利要求5所述的方法，所述性状包括农艺性状。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述西瓜遗传转化的方法包括土壤农杆菌介导的转化、基因枪法、PEG介导的原生质体转化、植物病毒介导的转化、花粉管通道法、电击转化法或子房注射法。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述西瓜遗传转化的材料包括西瓜子叶、子叶节、幼胚、成熟胚或原生质体。

9.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括进一步使用荧光蛋白作为遗传转化筛选标记。

10.根据权利要求9的方法，所述荧光蛋白作为转基因事件筛选标记以判断是否发生目的基因的整合，编码所述荧光蛋白的基因包括DsRed2荧光蛋白基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因及花青甙p1中的一种或多种基因。

11.根据权利要求10所述的方法，所述荧光蛋白为DsRed2荧光蛋白。

12.根据权利要求10所述的方法，其中编码所述DsRed2荧光蛋白的基因为SEQ ID NO.1所示的核酸序列并且能编码荧光蛋白的核酸，或者所述DsRed2荧光蛋白为SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列并且具有荧光蛋白功能的蛋白。

13.根据权利要求10所述的方法，所述转基因事件筛选包括使用荧光显微镜、手持式荧光检测仪判断是否发生目的基因的整合。

14.一种表达盒、表达载体或工程菌在西瓜遗传转化中的应用，其特征在于，所述表达盒、表达载体或工程菌含有如权利要求2-4中任一项所述方法中的蛋白或权利要求3或4中所述方法中的mRNA核酸。

15.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中植物的转化效率包括以下一项或多项：

i）所述植物的愈伤组织形成的效率的改善；

ii）所述植物的再分化效率或速率的改善；

iii）基因转移效率的改善。