CN113546047A - Mal官能团修饰的脂质体在靶向肝脏递送中的应用 - Google Patents

Mal官能团修饰的脂质体在靶向肝脏递送中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种MAL官能团修饰的脂质体在制备靶向肝脏递送的药物或药物载体中的应用。将MAL官能团修饰的脂质体应用于靶向肝脏尤其是肝实质细胞递送中时，能够有效地将核酸等活性物质成功递送至肝脏尤其是肝实质细胞等组织细胞中；并且所述MAL官能团修饰的脂质体粒径小、包载率较高、成分简单、制备方法简单易行，具备良好的生物安全性和临床应用的可行性，便于工业化生产。

Description

MAL官能团修饰的脂质体在靶向肝脏递送中的应用
技术领域
本发明涉及一种MAL官能团修饰的脂质体在靶向肝脏尤其是靶向肝实质细胞递送中的应用。
背景技术
MAL(马来酰亚胺，maleimide)官能团通常被用于纳米颗粒表面靶向分子的连接，所起的作用是与靶向分子的巯基(-SH)形成化学键。通常带有MAL官能团的化合物如DSPE-PEG-MAL仅仅作为反应的中间物，多数用于抗体等蛋白和脂质体的偶联。多余的MAL也会被封闭处理来保证抗体的靶向功能。MAL可以和抗体上的巯基(-SH)相结合。至今未见报道将MAL官能团直接用于其他脂质体的表面性质改进方面，也未见报道直接研究MAL官能团在体内的作用。此外，MAL作为化学合成的基团，在体内是不存在的，其在体内可以和哪类细胞或者哪些活性物质反应都是未知的。
由于肝脏的生理结构，肝脏血管周围分布了大量的吞噬细胞(Kupffer cell)，所有流经肝脏的纳米颗粒通常被这些吞噬细胞捕获，而不能将携载的药物(例如核酸)递送到肝实质细胞中。因此针对肝脏尤其是肝实质细胞进行药物(例如核酸)递送难度很大。现有的药物如核酸递送至肝实质细胞技术主要有：使用病毒载体、高压注射给药的方式、纳米颗粒的递送。其中使用病毒载体由于生物安全性还无法应用到临床研究，高压注射是将外源性核酸递送至小鼠肝脏细胞表达的常见方式，而不具备临床应用的可行性。有文章报道通过N-乙酰半乳糖胺修饰的纳米颗粒可以和肝实质细胞表面的ASGPR受体结合，从而介导肝细胞的内吞作用，但是其所制备的纳米颗粒成分非常复杂，操作不便。
因此，急需寻求一种能够将核酸等活性物质成功递送至肝脏尤其是肝实质细胞等组织细胞中、且成分简单、制备方法简单易行、具备临床应用可行性的载体。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对现有技术中没有合适的将核酸等活性物质有效递送至肝脏尤其是肝实质细胞等的载体，提供一种MAL官能团修饰的脂质体在靶向肝脏尤其是肝实质细胞递送中的应用，特别是MAL官能团修饰的脂质体在制备靶向肝脏递送的药物或药物载体中的应用。将本发明所述的MAL官能团修饰的脂质体应用于靶向肝脏尤其是肝实质细胞递送中时，能够有效地将核酸等活性物质成功递送至肝脏尤其是肝实质细胞等组织细胞中；并且所述MAL官能团修饰的脂质体粒径小、包载率较高、成分简单、制备方法简单易行，具备良好的生物安全性和临床应用的可行性，便于工业化生产。
目前，将核酸等活性物质递送至肝脏尤其是肝实质细胞等组织细胞中存在诸多难题，本发明人通过大量的实验和摸索，意外发现当使用MAL官能团来修饰脂质体纳米颗粒时，能够成功改变纳米颗粒的体内命运，从而实现将核酸等活性物质有效递送至肝脏尤其是肝实质细胞中。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种MAL官能团修饰的脂质体在制备靶向肝脏递送的药物或药物载体中的应用。
较佳地，所述靶向肝脏递送为靶向肝实质细胞递送。本发明中，所述肝实质细胞(又可称为肝脏实质细胞，hepatocytes)，是肝脏内承担肝脏器官功能的细胞。肝实质细胞具有肝功能的单位，是肝脏的基本组成单位之一。
较佳地，所述脂质体为长循环阳离子脂质体，优选为经PEG(Polyethyleneglycol，聚乙二醇)或其衍生物(所述的衍生物通常为经过功能修饰的PEG，例如经烯烃、甲基、巯基、羧基等基团进行修饰后的PEG)修饰的长循环阳离子脂质体；所述PEG的相对分子质量优选为2000-5000，例如为2000、3000、4000或5000。在本发明某一较佳实施例中，所述长循环阳离子脂质体为经PEG2000(PEG2k)、PEG3000(PEG3k)、PEG4000(PEG4k)、PEG5000(PEG5k)或其衍生物修饰的长循环阳离子脂质体。
在本发明某一较佳实施例中，所述脂质体包括阳离子脂质和第一辅助脂质，所述第一辅助脂质连接有MAL官能团。
本发明中，所述长循环阳离子脂质体可为本领域常规，通常可以延长脂质体在血液循环中的滞留半衰期(传统脂质体的半衰期仅有十几分钟至几十分钟，而长循环阳离子脂质体的半衰期通常达几小时至十几小时甚至更长时间)。现阶段的长循环脂质体一般有两类：含神经节苷脂的仿红细胞的阳离子脂质体，以及聚乙二醇或其衍生物修饰的阳离子脂质体。
本发明中，所述阳离子脂质可为本领域常规，通常由一种阳离子脂质和一种中性辅助脂质在适当的条件下复合而成。术语“阳离子脂质”通常包括具有一个、两个、三个或更多个脂肪酸或脂肪烷基链和pH可滴定氨基头部基团(例如，烷基氨基或二烷基氨基头部基团)的那些脂质及其盐。阳离子脂质通常在低于阳离子脂质的pKa的pH下被质子化(即，带正电荷)并且在高于pKa的pH下基本上呈中性。本发明的阳离子脂质也可被称为可滴定的阳离子脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质包括：可被质子化的叔胺(例如，pH可滴定的)头部基团；烷基链，其中每个烷基链独立地具有0至3个(例如，0、1、2或3个)双键；以及头部基团和烷基链之间的醚、酯或缩酮键。较佳地，所述阳离子脂质选自DOTAP(DOTAP为N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵硫酸甲酯盐或N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)、DOTMA(氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵)、DODMA(1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷)、DOSPA(三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰胺基)乙基铵)、DTAB(溴化三甲基双十二烷氧基铵)、TTAB(溴化三甲基双十四烷氧基铵)、CTAB(溴化三甲基双十六烷氧基铵)、DDAB(溴化二甲基双十八烷氧基铵)、DORI(溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵)、DORIE(溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵)、DORIE-HP(溴化二甲基-3-羟丙基-2,3-二油烯氧基丙基铵)、DORIE-HB(溴化二甲基-4-羟丁基-2,3-二油烯氧基丙基铵)、DORIE-HPc(溴化二甲基-5-羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵)、DPRIE(溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十六烷氧基丙基铵)、DSRIE(溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十八烷氧基丙基铵)、DMRIE(溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵)、DOGS(N-(2-精胺甲酰基)-N’,N-双十八烷基甘氨酰胺)、DOSC(1,2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯)、CD-Chol(3β-[N-(N’,N’-二甲基胺乙基)]胆固醇)、LPLL(脂质多聚-L-赖氨酸)和SA(硬脂胺)中的一种或多种，优选DOTAP。
较佳地，所述第一辅助脂质选自连接了MAL官能团的磷脂酰乙醇胺(PE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和磷脂酰胆碱(PC)中的一种或多种，优选为连接了MAL官能团的DSPE，更优选为DSPE-PEG-MAL。
在本发明某一较佳实施例中，所述第一辅助脂质为DSPE-PEG2000-MAL。本发明中，所述DSPE-PEG-MAL为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺，1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)]。
较佳地，所述第一辅助脂质与所述阳离子脂质的摩尔比为1:14～1:55。在本发明某一较佳实施例中，所述第一辅助脂质的含量为134μg、100.5μg、67μg或33.5μg，所述阳离子脂质的含量为443μg。
较佳地，所述脂质体还包括第二辅助脂质，其未连接MAL官能团，所述第二辅助脂质优选自胆固醇(Chol)、DSPE(例如以DSPE-PEG、DSPE-PEG-NH2或DSPE-PEG-COOH的形式)、磷脂酰乙醇胺(PE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和磷脂酰胆碱(PC)中的一种或多种，优选胆固醇和/或DSPE；所述第二辅助脂质与所述阳离子脂质的摩尔比优选为1:2～2:1，更优选为1:1。通常第二辅助脂质的脂质成分与所述第一脂质可以不同，也可以相同，只要能够成功靶向肝脏的递送即可。
本发明中，所述药物可以包含活性物质，所述活性物质按照实际应用时的需求可以为基因或者药物，也可以诊断试剂类的物质，还可以为小分子多肽等等。较佳地，所述活性物质可以为水溶性或者脂溶性的活性物质；所述活性物质还可以优选为生物类活性物质，优选核酸、多肽或蛋白质；更佳地，所述核酸为DNA和/或RNA；所述RNA优选为siRNA和/或mRNA。本发明中的核酸DNA、mRNA、siRNA等，其长度范围从20bp到几千bp不等，结构上包括双链和单链的核酸。在本发明某一较佳实施例中，所述活性物质为序列如SEQ ID NO.1所示的GFP质粒。在本发明某一较佳实施例中，所述活性物质为序列如SEQ ID NO.2所示的RFP质粒。在本发明某一较佳实施例中，所述活性物质为序列如SEQ ID NO.3所示的包含luciferase报告基因的质粒。
较佳地，所述阳离子脂质与所述活性物质的质量比通常为443：48～443：24。在本发明某一较佳实施例中，所述阳离子脂质与所述活性物质的质量比为443μg：48μg。
较佳地，所述脂质体一般为纳米颗粒，其粒径优选为160nm～250nm，更优选200nm。
较佳地，所述脂质体的Zeta电位通常为10mV～-25mV，优选15mV。
较佳地，所述脂质体的包载率通常为55～65％，优选60％。
较佳地，所述脂质体的浓度通常为1.5-0.5mg/ml，优选0.97mg/ml。本发明中，所述脂质体的浓度一般是为透析后的浓度，其一般与投料量以及水化的体积相关。在本发明某一较佳实施例中所述脂质体的浓度接近1mg/ml，优选为0.97mg/ml。
较佳地，所述脂质体还包括染料，优选脂溶性荧光染料，更优选DiD；所述染料的质量占所述阳离子脂质和所述辅助脂质的质量之和的比例优选0.5％～2.5％，更优选1.25％。所述染料只是用于示踪所述颗粒，在递送功能性核酸等活性物质时一般不需要添加。
在本发明某一较佳实施例中，所述脂质体的制备方法为薄膜分散法。
较佳地，所述薄膜分散法包括如下步骤：
(1)将混合后的所述阳离子脂质和有机溶剂，蒸干形成薄膜脂层(或称为磷脂层)；
(2)将上述薄膜脂层溶解并超声水浴，滴加所述第一辅助脂质，旋转混匀即可。
较佳地，当所述脂质体还包括第二辅助脂质时，步骤(1)为将混合后的阳离子脂质、第二辅助脂质和有机溶剂蒸干形成薄膜脂层。
较佳地，步骤(1)中，所述有机溶剂为CHCl3。
较佳地，步骤(1)中，所述蒸干为通过氮气吹干；所述蒸干的目的为吹干即可。
较佳地，步骤(1)中，所述蒸干的时间为40～60分钟，例如为60分钟。
较佳地，当所述药物包含活性物质时，步骤(2)为将所述薄膜脂层溶解并超声水浴，滴加所述活性物质和第一辅助脂质的混合物，旋转混匀即可。
较佳地，步骤(2)中，所述溶解为使用醋酸钠和乙醇的混合溶液溶解。
较佳地，步骤(2)中，所述超声水浴的时间为1-2分钟，例如为1分钟。
较佳地，步骤(2)中，所述旋转混匀的时间为15-30分钟，例如为30分钟。
较佳地，所述步骤(2)后还包括透析的步骤；所述透析的透析液优选为PBS；所述透析的透析袋优选3.5KD透析袋；所述透析的温度为室温。
在本发明某一较佳实施例中，所述脂质体由DOTAP、DSPE-PEG2000-MAL、胆固醇和核酸(例如DNA、mRNA和/或siRNA)组成。较佳地，其中所述的DSPE-PEG2000-MAL可用DSPE-PEG2000进行部分替换，例如所述DSPE-PEG2000-MAL中的75％、50％或25％(w/w)替换为DSPE-PEG2000。
在本发明某一较佳实施例中，所述脂质体由以下原料组成：DOTAP 443μg、DSPE-PEG2000-MAL 134μg、胆固醇239μg和核酸(例如DNA、mRNA和/或siRNA)48μg。较佳地，最终所得脂质体的浓度约为0.97mg/ml。较佳地，其中所述的DSPE-PEG2000-MAL可用DSPE-PEG2000进行部分替换，例如所述DSPE-PEG2000-MAL中的75％、50％或25％(w/w)替换为DSPE-PEG2000。
本发明某一方面还提供了一种MAL官能团修饰的脂质体在靶向肝脏递送中的应用。较佳地，所述脂质体如前所述。
本发明某一方面还提供了一种将活性物质递送至肝脏优选肝实质细胞的方法，其包括将活性物质以脂质体的形式进行递送，所述脂质体为MAL官能团修饰的脂质体。较佳地，所述脂质体如前所述。
本发明某一方面还提供了一种靶向肝脏优选肝实质细胞递送的脂质体颗粒，所述脂质体为MAL官能团修饰的脂质体。较佳地，所述脂质体如前所述。
本发明某一方面还提供了一种治疗肝脏相关疾病的方法，其包括使用MAL官能团修饰的脂质体将治疗肝脏相关的药物递送至肝脏优选肝实质细胞中。较佳地，所述脂质体如前所述。
本领域技术人员应当理解的是，通常对本发明所列出的物质(例如所述阳离子脂质、第一辅助脂质、第二辅助脂质等)进行本领域常规的修饰，这些都应当落入到本发明的保护范围内。
本发明中，所述“包括或包含”可以是指除了包括后面所列举的成分，还存在其他成分；也可以是指“由……组成”，即只包括后面所列举的成分而不存在其他成分。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：将本发明所述的MAL官能团修饰的脂质体应用于靶向肝脏尤其是肝实质细胞递送中时，能够有效地将核酸等活性物质成功递送至肝脏尤其是肝实质细胞等组织细胞中；并且所述MAL官能团修饰的脂质体粒径小、包载率较高(可达60％)、成分简单、制备方法简单易行，具备良好的生物安全性和临床应用的可行性，便于工业化生产。
附图说明
图1A为不同官能团修饰的纳米颗粒表征，其包载核酸为GFP质粒。
图1B为不同官能团修饰的纳米颗粒表征，其包载核酸为siRNA。
图1C为包载了GFP质粒DNA的脂质体和游离GFP质粒DNA的电泳图，由此可计算出DNA包载率为60％。
图2为小鼠尾静脉注射DiD标记的不同官能团修饰PEG脂质体后BABL/c小鼠脏器的DiD荧光强度统计结果(N＝3)。
图3为小鼠尾静脉注射DiD标记的不同官能团修饰PEG脂质体后BABL/c小鼠肝脏切片激光共聚焦观察结果。
图4为小鼠尾静脉注射不同官能团修饰PEG脂质体包载GFP质粒后BABL/c小鼠肝脏切片激光共聚焦观察结果。
图5为小鼠尾静脉注射不同官能团修饰PEG脂质体包载RFP mRNA后BABL/c小鼠肝脏切片激光共聚焦观察结果。
图6为使用不同浓度的MAL修饰PEG脂质体时BABL/c小鼠肝脏切片激光共聚焦观察结果。
图7为PLGA-MAL颗粒在肝脏中的分布情况，同样是DSPE-PEG-MAL修饰的纳米颗粒，没有像脂质体一样进入肝实质细胞。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
以下实施例中，所用GFP质粒的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO.1所示，所用RFPmRNA的序列如序列表中的SEQ ID NO.2所示。所述质粒DNA通过QIANGEN EndoFree PlasmidMaxi Kit质粒提取试剂盒提取，mRNA采用体外转录的方式合成，体外转录试剂购于ambion。
实施例1和对比例1-3
(一)脂质体的制备
(1)材料：
DOTAP(2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵，SIGMA)10mg/ml的浓度，溶解于CHCl3
Cholesterol(胆固醇，SIGMA)5mg/ml的浓度，溶解于CHCl3
DiD(Molecular Probes)5mg/ml的浓度，溶解于DMSO
DSPE-PEG2000-MAL(实施例1)/DSPE-PEG2000(对比例1)/DSPE-PEG2000-NH2(对比例2)/DSPE-PEG2000-COOH(对比例3)
(均购于西安瑞禧生物技术有限公司) 均10mg/mL的浓度，溶解于H2O
DNA/siRNA/mRNA stock solution 8μg/μL的浓度，溶解于H2O(以siRNA浓度为例)
(2)溶液：
Buffer A：200mM醋酸钠溶液；pH＝5.2
Buffer B：EtOH(乙醇):Buffer A＝9:1(v/v)
(3)实验步骤：
1)将按上述浓度溶于CHCl3的脂质DOTAP和Cholesterol、CHCl3(其用于整个脂质分子浓度的调节)、溶于DMSO的DiD这4种按照以下的比例一起加入至10ml的玻璃样品瓶内，通过氮气吹干1小时形成薄膜脂层。其中，
DOTAP 44.3μl(443μg)
Cholesterol 47.8μl(239μg)
CHCl3 67.9μl
DiD 1.7μl(8.5μg)，占DOTAP和Cholesterol总质量的1.25％(w/w)
DOTAP：Cholesterol＝1：1(molar ratio)(DOTAP分子量为698.542g/mol：Cholesterol分子量为386.6535g/mol)
2)以168μl Buffer B溶液溶解上述脂质薄层，同时超声水浴1分钟。
3)按照以下比例向步骤2中所得脂质薄层中滴加核酸(DNA/siRNA/mRNA)和DSPE-PEG-MAL2000的混合物(用DEPC水补足)，旋转混匀30分钟。
核酸(DNA/siRNA/mRNA)48μg
DSPE-PEG2000-MAL(实施例1)/DSPE-PEG2000(对比例1)/DSPE-PEG2000-NH2(对比例2)/DSPE-PEG2000-COOH(对比例3)均为134μg(13.4μl)
DEPC(Diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)H2O add to 378μl
4)将上述样品转移至3.5KD透析袋内，以PBS室温透析2小时。透析之后所得脂质体的浓度约为0.97mg/ml。
5)经小鼠(小鼠均购置于北京维通利华，8周龄左右给药，给药时体重均在20g左右)尾静脉给药500μl每只。
以下所用脂质体均按上述制备方法制得，其中图4和5中不包括添加DiD的步骤。此外，本发明中所用的脂质体也可根据现有技术的方法来进行制备，例如CN110548007A中所公开的制备方法。
(二)MAL脂质体向小鼠肝脏特别是肝实质细胞核酸递送体系
在三个时间段检测(一)中所得纳米颗粒的表征，分别是：室温透析2小时后、4℃过夜保存以及4℃保存一周，结果均无差异。具体结果如图1所示，其是通过Zeta sizerNanoS90测得的不同官能团修饰的纳米颗粒表征。其中，PEG组代表滴加了DSPE-PEG2000的组(对比例1)，NH2组代表滴加了DSPE-PEG2000-NH2的组(对比例2)，COOH组代表滴加了DSPE-PEG2000-COOH的组(对比例3)，MAL组代表滴加了DSPE-PEG-MAL2000的组(实施例1)。图1A中的脂质体纳米粒测定尺寸和zeta电位时，所包载核酸为GFP质粒，为4℃过夜时的样品，包载其他核酸(如siRNA)所得脂质体性质与包载GFP质粒的脂质体性质基本一致，具体如图1B所示(同样为4℃过夜时的样品)。由图1A和图1B可知，实施例1的MAL组所得脂质体的粒径约在200nm左右；MAL组所得脂质体的Zeta电位约为15mV左右。根据图1C可计算出脂质体中GFP质粒DNA的包载效率为60％。
将通过第(一)部分所述方法得到的荧光染料DiD标记的4种不同官能团(DSPE-PEG-MAL2000(实施例1)/DSPE-PEG2000(对比例1)/DSPE-PEG2000-NH2(对比例2)/DSPE-PEG2000-COOH(对比例3))修饰PEG脂质体通过尾静脉注射(500μl每只)打入BABL/c小鼠体内。24小时后，脱颈处死小鼠，分离小鼠主要组织器官，通过本领域常规的小动物活体成像技术(使用小动物活体成像仪检测)检测不同组织器官中的DiD荧光强度或者所转染核酸表达的荧光蛋白的强度。
图2给出了小鼠尾静脉注射DiD标记的不同官能团修饰PEG脂质体(包含luciferase报告基因的质粒，其序列如SEQ ID NO.3所示)后BABL/c小鼠脏器的DiD荧光强度。图中P/sec/cm2/sr/μW/cm2荧光效率单位的意义是：单位曝光时间、单位面积、单位荧光激发功率下的光子数。目的是为了保证不同批次小动物成像的光强参数一致。由图中可以看出，注射了DiD标记的MAL脂质体后(实施例1)，小鼠肝脏中DiD荧光强度高于其他组(对比例1-3)。
图3给出了DiD标记的不同官能团修饰PEG脂质体(包含luciferase报告基因的质粒)后BABL/c小鼠肝脏切片的激光共聚焦(按照本领域常规实验操作进行)结果。图中的鬼笔环肽(phalloidin)染色和DAPI染色均按本领域常规步骤进行，其中AlexaFluorTM488Phalloidin、Alexa FluorTM555Phalloidin均购于molecular probes；DAPI-Fluoromount-G荧光封片剂购于SouthernBiotech，phalloidin按1:40(体积比，PBS溶液稀释)稀释到工作浓度，4℃避光染色半小时即可。含DAPI的封片剂直接封片过夜晾干即可。其中，DiD为标记脂质体的染料。Phalloidin染色主要用于与肝脏组织中的细胞中聚合的微丝结合，从而显示微丝骨架在细胞中的分布，主要用于细胞的骨架染色。DAPI即DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚，主要是一种能够与DNA、RNA强力结合的荧光染料，用于追踪核酸。由图3可以看出，包载着DiD染料的MAL官能团修饰的脂质体(实施例1)可以进入到肝脏特别是肝实质细胞内，而其它官能团修饰的颗粒(对比例1-3)无法大量进入肝脏特别是肝实质细胞。
图4(注射的核酸为GFP质粒)、图5(注射的核酸为RFP mRNA)分别展示了MAL脂质体递送DNA/mRNA在肝脏特别是肝实质细胞表达情况。结果显示，注射了包载不同核酸的MAL脂质体后(实施例1)，小鼠肝实质细胞中均可表达。MAL脂质体递送DNA/mRNA在肝脏后，在肝实质细胞中有着明显的基因表达。而其它官能团修饰的颗粒(对比例1-3)在肝实质细胞中的基因表达不明显。图4和图5中因其转染的核酸表达的蛋白自身为荧光蛋白，故所用脂质体未携带DiD染料。
由上述实验可以得出：通过DSPE-PEG-MAL2000修饰的脂质体(实施例1)，可以特异性的分布在肝脏特别是肝实质细胞内。同时可以递送多种核酸到肝脏特别是肝实质细胞内表达。而其它官能团修饰的脂质体颗粒(如DSPE-PEG2000(对比例1)/DSPE-PEG2000-NH2(对比例2)/DSPE-PEG2000-COOH(对比例3))进入肝脏例如肝实质细胞的效率明显低于DSPE-PEG2000-MAL修饰的脂质体。
图6为使用不同浓度的MAL修饰PEG脂质体时BABL/c小鼠肝脏切片激光共聚焦观察结果。具体为：在合成MAL脂质体时，将部分DSPE-PEG-MAL2K(简称MAL2K)替换成DSPE-PEG2K(简称PEG2K)。75％(w/w)MAL即MAL2K：PEG2K＝3：1；50％MAL即MAL2K：PEG2K＝1：1；25％MAL即MAL2K：PEG2K＝1：3，其余步骤均按照第(一)部分进行。通过包载DiD染料(与图3分布实验条件一致)经激光共聚焦显微镜拍摄仍可发现进入肝脏特别是肝实质细胞的脂质体纳米颗粒。说明不同比例的MAL(25％～100％，优选100％)修饰的脂质体颗粒均可进入肝脏特别是肝实质细胞。
对比例4
1、MAL官能团修饰的PLGA聚合物纳米颗粒的制备
(1)材料：
PLGA(Sigma-Aldrich，由50％乳酸和50％羟基乙酸组成)100mg/ml的浓度，溶解于CHCl3
DiD(Molecular Probes)5mg/ml的浓度，溶解于DMSO
DSPE-PEG2000-MAL(购于西安瑞禧生物技术有限公司)10mg/mL的浓度，溶解于H2O
DNA/siRNA/mRNA stock solution溶解于H2O
(2)步骤
1)吸取2μL DiD溶液、100μL PLGA溶液与398μL CHCl3加入50mL离心管中，再加入DSPE-PEG2000-MAL溶液625μL与2.375mL ddH2O。有机相(CHCl3)：水相(ddH2O)＝1:6(v/v)。(核酸DNA/siRNA/mRNA通常在此步骤中添加即可，核酸的用量为本领域常规(通常PLGA/核酸质量比为125:1-250:1)，本发明人经过实验可知，PLGA纳米颗粒可以不添加核酸，合成时PLGA与辅助脂质含量不受其他影响，同时不影响该纳米颗粒进入肝脏递送的效果)。
2)混匀超声，每10s停1s，共60s，功率90w。将超声后的溶液转入50mL圆底烧瓶中，旋转蒸发去除CHCl3。
3)将旋蒸后的溶液转入离心管中，1100g离心5min。吸取上清。
4)上一步上清溶液，30000g离心30min。
5)去除上清，1mL ddH2O重悬沉淀。30000g离心30min。
6)弃上清，ddH2O重悬纳米颗粒，4℃保存。
2、PLGA聚合物纳米颗粒PLGA-MAL向小鼠肝脏特别是肝实质细胞核酸递送体系
DiD标记的DSPE-PEG2000-MAL修饰后的PLGA纳米颗粒通过尾静脉注射到BABL/c小鼠体内后在小鼠肝脏内的分布。具体操作步骤如上述第(二)部分所示。激光共聚焦结果显示，图7为PLGA-MAL颗粒在肝脏内的分布情况，由图中可以看出，同样是DSPE-PEG2000-MAL修饰的纳米颗粒，但其没有进入肝脏特别是肝实质细胞。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林大学第一医院
<120> MAL官能团修饰的脂质体在靶向肝脏递送中的应用
<130> P19011662C
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7572
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GFP质粒的DNA序列
<400> 1
actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 60
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 120
agtgccacct aaattgtaag cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa 180
atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa 240
tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac 300
gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa 360
ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct 420
aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa 480
gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc 540
gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccca ttcgccattc 600
aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg 660
gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca 720
cgacgttgta aaacgacggc cagtgagcgc gcctcgttca ttcacgtttt tgaacccgtg 780
gaggacgggc agactcgcgg tgcaaatgtg ttttacagcg tgatggagca gatgaagatg 840
ctcgacacgc tgcagaacac gcagctagat taaccctaga aagataatca tattgtgacg 900
tacgttaaag ataatcatgt gtaaaattga cgcatgtgtt ttatcggtct gtatatcgag 960
gtttatttat taatttgaat agatattaag ttttattata tttacactta catactaata 1020
ataaattcaa caaacaattt atttatgttt atttatttat taaaaaaaac aaaaactcaa 1080
aatttcttct ataaagtaac aaaactttta tgagggacag ccccccccca aagcccccag 1140
ggatgtaatt acgtccctcc cccgctaggg ggcagcagcg agccgcccgg ggctccgctc 1200
cggtccggcg ctccccccgc atccccgagc cggcagcgtg cggggacagc ccgggcacgg 1260
ggaaggtggc acgggatcgc tttcctctga acgcttctcg ctgctctttg agcctgcaga 1320
cacctggggg gatacgggga aaaggcctcc aacgccaagg atctgcgatc gctccggtgc 1380
ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg 1440
caattgaacg ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta 1500
ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt 1560
gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag ctgaagcttc gaggggctcg 1620
catctctcct tcacgcgccc gccgccctac ctgaggccgc catccacgcc ggttgagtcg 1680
cgttctgccg cctcccgcct gtggtgcctc ctgaactgcg tccgccgtct aggtaagttt 1740
aaagctcagg tcgagaccgg gcctttgtcc ggcgctccct tggagcctac ctagactcag 1800
ccggctctcc acgctttgcc tgaccctgct tgctcaactc tacgtctttg tttcgttttc 1860
tgttctgcgc cgttacagat ccaagctgtg accggcgcct actctagagc tagcatggtg 1920
agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac 1980
gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag 2040
ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg 2100
accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac 2160
gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag 2220
gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac 2280
cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg 2340
gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc 2400
aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac 2460
taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg 2520
agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg 2580
gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaaggatcc 2640
gcggccgcgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc gcttggaata 2700
aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt ttggcaatgt 2760
gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc tttcccctct 2820
cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc 2880
ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga 2940
caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc 3000
ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt 3060
attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg 3120
gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc taggcccccc 3180
gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgataa tacctccgga atgattgaac 3240
aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact 3300
gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc 3360
gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg 3420
cagcgcggct atcgtggctg gccgcgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg 3480
tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt 3540
catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc 3600
atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag 3660
cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg 3720
ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc 3780
tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt 3840
ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg 3900
ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt 3960
acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct 4020
tctgagtcga caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta 4080
actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcgt 4140
taacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac 4200
aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc 4260
ttatcatgtc tggaattgac tcaaatgatg tcaattagtc tatcagaagc tcatctggtc 4320
tcccttccgg gggacaagac atccctgttt aatatttaaa cagcagtgtt cccaaactgg 4380
gttcttatat cccttgctct ggtcaaccag gttgcagggt ttcctgtcct cacaggaacg 4440
aagtccctaa agaaacagtg gcagccaggt ttagccccgg aattgactgg attccttttt 4500
tagggcccat tggtatggct ttttccccgt atccccccag gtgtctgcag gctcaaagag 4560
cagcgagaag cgttcagagg aaagcgatcc cgtgccacct tccccgtgcc cgggctgtcc 4620
ccgcacgctg ccggctcggg gatgcggggg gagcgccgga ccggagcgga gccccgggcg 4680
gctcgctgct gccccctagc gggggaggga cgtaattaca tccctggggg ctttgggggg 4740
gggctgtccc tgatatctat aacaagaaaa tatatatata ataagttatc acgtaagtag 4800
aacatgaaat aacaatataa ttatcgtatg agttaaatct taaaagtcac gtaaaagata 4860
atcatgcgtc attttgactc acgcggtcgt tatagttcaa aatcagtgac acttaccgca 4920
ttgacaagca cgcctcacgg gagctccaag cggcgactga gatgtcctaa atgcacagcg 4980
acggattcgc gctatttaga aagagagagc aatatttcaa gaatgcatgc gtcaatttta 5040
cgcagactat ctttctaggg ttaatctagc tgcatcagga tcatatcgtc gggtcttttt 5100
tccggctcag tcatcgccca agctggcgct atctgggcat cggggaggaa gaagcccgtg 5160
ccttttcccg cgaggttgaa gcggcatgga aagagtttgc cgaggatgac tgctgctgca 5220
ttgacgttga gcgaaaacgc acgtttacca tgatgattcg ggaaggtgtg gccatgcacg 5280
cctttaacgg tgaactgttc gttcaggcca cctgggatac cagttcgtcg cggcttttcc 5340
ggacacagtt ccggatggtc agcccgaagc gcatcagcaa cccgaacaat accggcgaca 5400
gccggaactg ccgtgccggt gtgcagatta atgacagcgg tgcggcgctg ggatattacg 5460
tcagcgagga cgggtatcct ggctggatgc cgcagaaatg gacatggata ccccgtgagt 5520
tacccggcgg gcgcgcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta 5580
tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc 5640
ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg 5700
aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg 5760
tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg 5820
gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa 5880
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gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 6000
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agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 6360
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gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 6480
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<210> 2
<211> 6085
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<220>
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atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
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aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
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ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
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accatgggct gggaggcctc caccgagcgg atgtaccccg aggacggcgc cctgaagggc 1440
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tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag 1860
gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctgaggcg 1920
gaaagaacca gctggggctc tagggggtat ccccacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc 1980
gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc 2040
gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct 2100
ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa 2160
aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc 2220
cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca 2280
ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat 2340
tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attaattctg tggaatgtgt 2400
gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc 2460
atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 2520
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cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta 2640
tttatgcaga ggccgaggcc gcctctgcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct 2700
tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc tcccgggagc ttgtatatcc attttcggat 2760
ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag 2820
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tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg 3060
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cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag 3240
ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac 3300
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gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg attccaccgc 3660
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gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta 3960
tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc 4020
ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg 4080
aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg 4140
tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg 4200
gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa 4260
cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc 4320
gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 4380
aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag 4440
ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 4500
cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 4560
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cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 4680
agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 4740
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gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 4860
tggtagcggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 4920
agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 4980
gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 5040
aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 5100
aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 5160
ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 5220
gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 5280
aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 5340
ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 5400
tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 5460
ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 5520
cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 5580
agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 5640
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acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 5880
agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 5940
aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 6000
gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 6060
tccccgaaaa gtgccacctg acgtc 6085
<210> 3
<211> 9286
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 包含luciferase报告基因的质粒
<400> 3
actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 60
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 120
agtgccacct aaattgtaag cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa 180
atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa 240
tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac 300
gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa 360
ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct 420
aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa 480
gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc 540
gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccca ttcgccattc 600
aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg 660
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cgacgttgta aaacgacggc cagtgagcgc gcctcgttca ttcacgtttt tgaacccgtg 780
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tacgttaaag ataatcatgt gtaaaattga cgcatgtgtt ttatcggtct gtatatcgag 960
gtttatttat taatttgaat agatattaag ttttattata tttacactta catactaata 1020
ataaattcaa caaacaattt atttatgttt atttatttat taaaaaaaac aaaaactcaa 1080
aatttcttct ataaagtaac aaaactttta tgagggacag ccccccccca aagcccccag 1140
ggatgtaatt acgtccctcc cccgctaggg ggcagcagcg agccgcccgg ggctccgctc 1200
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ggaaggtggc acgggatcgc tttcctctga acgcttctcg ctgctctttg agcctgcaga 1320
cacctggggg gatacgggga aaaggcctcc aacgccaagg atctgcgatc gctccggtgc 1380
ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg 1440
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gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag ctgaagcttc gaggggctcg 1620
catctctcct tcacgcgccc gccgccctac ctgaggccgc catccacgcc ggttgagtcg 1680
cgttctgccg cctcccgcct gtggtgcctc ctgaactgcg tccgccgtct aggtaagttt 1740
aaagctcagg tcgagaccgg gcctttgtcc ggcgctccct tggagcctac ctagactcag 1800
ccggctctcc acgctttgcc tgaccctgct tgctcaactc tacgtctttg tttcgttttc 1860
tgttctgcgc cgttacagat ccaagctgtg accggcgcct actctagagc tagcatggtg 1920
agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac 1980
gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag 2040
ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg 2100
accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac 2160
gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag 2220
gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac 2280
cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg 2340
gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc 2400
aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac 2460
taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg 2520
agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg 2580
gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaaggatcc 2640
gggaccagga ttctcttcta cgtcgccgca tgtcagcaga ctaccccgtc cttcatggaa 2700
gacgccaaaa acataaagaa aggcccggcg ccattctatc cgctggaaga tggaaccgct 2760
ggagagcaac tgcataaggc tatgaagaga tacgccctgg ttcctggaac aattgctttt 2820
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ttggcagaag ctatgaaacg atatgggctg aatacaaatc acagaatcgt cgtatgcagt 2940
gaaaactctc ttcaattctt tatgccggtg ttgggcgcgt tatttatcgg agttgcagtt 3000
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cctaccgtgg tgttcgtttc caaaaagggg ttgcaaaaaa ttttgaacgt gcaaaaaaag 3120
ctcccaatca tccaaaaaat tattatcatg gattctaaaa cggattacca gggatttcag 3180
tcgatgtaca cgttcgtcac atctcatcta cctcccggtt ttaatgaata cgattttgtg 3240
ccagagtcct tcgataggga caagacaatt gcactgatca tgaactcctc tggatctact 3300
ggtctgccta aaggtgtcgc tctgcctcat agaactgcct gcgtgagatt ctcgcatgcc 3360
agagatccta tttttggcaa tcaaatcatt ccggatactg cgattttaag tgttgttcca 3420
ttccatcacg gttttggaat gtttactaca ctcggatatt tgatatgtgg atttcgagtc 3480
gtcttaatgt atagatttga agaagagctg tttctgagga gccttcagga ttacaagatt 3540
caaagtgcgc tgctggtgcc aaccctattc tccttcttcg ccaaaagcac tctgattgac 3600
aaatacgatt tatctaattt acacgaaatt gcttctggtg gcgctcccct ctctaaggaa 3660
gtcggggaag cggttgccaa gaggttccat ctgccaggta tcaggcaagg atatgggctc 3720
actgagacta catcagctat tctgattaca cccgaggggg atgataaacc gggcgcggtc 3780
ggtaaagttg ttccattttt tgaagcgaag gttgtggatc tggataccgg gaaaacgctg 3840
ggcgttaatc aaagaggcga actgtgtgtg agaggtccta tgattatgtc cggttatgta 3900
aacaatccgg aagcgaccaa cgccttgatt gacaaggatg gatggctaca ttctggagac 3960
atagcttact gggacgaaga cgaacacttc ttcatcgttg accgcctgaa gtctctgatt 4020
aagtacaaag gctatcaggt ggctcccgct gaattggaat ccatcttgct ccaacacccc 4080
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gccgttgttg ttttggagca cggaaagacg atgacggaaa aagagatcgt ggattacgtc 4200
gccagtcaag taacaaccgc gaaaaagttg cgcggaggag ttgtgtttgt ggacgaagta 4260
ccgaaaggtc ttaccggaaa actcgacgca agaaaaatca gagagatcct cataaaggcc 4320
aagaagggcg gaaagatcgc cgtgtaattc tagagcggcc gcgcccctct ccctcccccc 4380
cccctaacgt tactggccga agccgcttgg aataaggccg gtgtgcgttt gtctatatgt 4440
tattttccac catattgccg tcttttggca atgtgagggc ccggaaacct ggccctgtct 4500
tcttgacgag cattcctagg ggtctttccc ctctcgccaa aggaatgcaa ggtctgttga 4560
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ccctttgcag gcagcggaac cccccacctg gcgacaggtg cctctgcggc caaaagccac 4680
gtgtataaga tacacctgca aaggcggcac aaccccagtg ccacgttgtg agttggatag 4740
ttgtggaaag agtcaaatgg ctctcctcaa gcgtattcaa caaggggctg aaggatgccc 4800
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acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg 5220
ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa 5280
gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca 5340
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gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc 5460
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ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt 5640
ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag 5700
cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag tcgacaatca acctctggat 5760
tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt 5820
ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat gcgttaactt gtttattgca gcttataatg 5880
gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt 5940
ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctggaat tgactcaaat 6000
gatgtcaatt agtctatcag aagctcatct ggtctccctt ccgggggaca agacatccct 6060
gtttaatatt taaacagcag tgttcccaaa ctgggttctt atatcccttg ctctggtcaa 6120
ccaggttgca gggtttcctg tcctcacagg aacgaagtcc ctaaagaaac agtggcagcc 6180
aggtttagcc ccggaattga ctggattcct tttttagggc ccattggtat ggctttttcc 6240
ccgtatcccc ccaggtgtct gcaggctcaa agagcagcga gaagcgttca gaggaaagcg 6300
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gggggagcgc cggaccggag cggagccccg ggcggctcgc tgctgccccc tagcggggga 6420
gggacgtaat tacatccctg ggggctttgg gggggggctg tccctgatat ctataacaag 6480
aaaatatata tataataagt tatcacgtaa gtagaacatg aaataacaat ataattatcg 6540
tatgagttaa atcttaaaag tcacgtaaaa gataatcatg cgtcattttg actcacgcgg 6600
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caagcggcga ctgagatgtc ctaaatgcac agcgacggat tcgcgctatt tagaaagaga 6720
gagcaatatt tcaagaatgc atgcgtcaat tttacgcaga ctatctttct agggttaatc 6780
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ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat 7440
gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc 7500
tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 7560
cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 7620
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ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 7860
atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 7920
tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 7980
ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 8040
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cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc 8640
ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta 8700
gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac 8760
gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat 8820
gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa 8880
gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg 8940
tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag 9000
aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc 9060
cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct 9120
caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat 9180
cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg 9240
ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcat 9286

Claims (10)

1.一种MAL官能团修饰的脂质体在制备靶向肝脏递送的药物或药物载体中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述靶向肝脏递送为靶向肝实质细胞递送；
和/或，所述脂质体为长循环阳离子脂质体，优选为经PEG或其衍生物修饰的长循环阳离子脂质体；所述PEG的相对分子质量优选为2000-5000，例如为2000、3000、4000或5000。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述脂质体包括阳离子脂质和第一辅助脂质，所述第一辅助脂质连接有MAL官能团。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述阳离子脂质选自DOTAP、DOTMA、DODMA、DOSPA、DTAB、TTAB、CTAB、DDAB、DORI、DORIE、DPRIE、DSRIE、DMRIE、DOGS、DOSC、CD-Chol、LPLL和SA中的一种或多种，优选DOTAP；
和/或，所述第一辅助脂质选自连接了MAL官能团的PE、DOPE、DSPE、DPPE、DPPC、DSPC和PC中的一种或多种，优选为连接了MAL官能团的DSPE，更优选为DSPE-PEG-MAL；
和/或，所述第一辅助脂质与所述阳离子脂质的摩尔比为1:14～1:55；
和/或，所述脂质体还包括第二辅助脂质，其未连接MAL官能团，所述第二辅助脂质优选自胆固醇、DSPE、PE、DOPE、DPPE、DPPC、DSPC和PC中的一种或多种，优选胆固醇和/或DSPE；所述第二辅助脂质与所述阳离子脂质的摩尔比优选为1:2～2:1，更优选为1:1。
5.如权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物包含活性物质，所述活性物质优选为生物类活性物质，更优选为核酸、多肽和/或蛋白质；所述核酸优选为DNA和/或RNA，所述RNA优选为siRNA和/或mRNA。
6.如权利要求1～5任一项所述的应用，其特征在于，所述脂质体的粒径为160nm～250nm，优选200nm。
7.如权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，所述脂质体还包括染料，优选脂溶性荧光染料，更优选DiD。
8.如权利要求1～7任一项所述的应用，其特征在于，所述脂质体的制备方法为薄膜分散法。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述薄膜分散法包括如下步骤：
(1)将混合后的阳离子脂质和有机溶剂蒸干形成薄膜脂层；
(2)将所述薄膜脂层溶解并超声水浴，滴加第一辅助脂质，旋转混匀即可。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，当所述脂质体还包括第二辅助脂质时，步骤(1)为将混合后的阳离子脂质、第二辅助脂质和有机溶剂蒸干形成薄膜脂层；
和/或，步骤(1)中，所述有机溶剂为CHCl3；
和/或，步骤(1)中，所述蒸干为通过氮气吹干；
和/或，步骤(1)中，所述蒸干的时间为40～60分钟；
和/或，当所述药物包含活性物质时，步骤(2)为将所述薄膜脂层溶解并超声水浴，滴加所述活性物质和第一辅助脂质的混合物，旋转混匀即可；
和/或，步骤(2)中，所述溶解为使用醋酸钠和乙醇的混合溶液溶解；
和/或，步骤(2)中，所述超声水浴的时间为1-2分钟；
和/或，步骤(2)中，所述旋转混匀的时间为15-30分钟；
和/或，所述步骤(2)后还包括透析的步骤；所述透析的透析液优选为PBS；所述透析的透析袋优选3.5KD透析袋；所述透析的温度为室温。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102188713A (zh) * 2011-05-09 2011-09-21 中山大学 一种肝靶向药物组合物及其制备方法
CN103143033A (zh) * 2013-03-24 2013-06-12 山西医科大学 一种靶向肝脏细胞的运载体及其制备方法
WO2015135432A1 (zh) * 2014-03-13 2015-09-17 上海吉贝医药科技有限公司 靶向脂质体的制备及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102188713A (zh) * 2011-05-09 2011-09-21 中山大学 一种肝靶向药物组合物及其制备方法
CN103143033A (zh) * 2013-03-24 2013-06-12 山西医科大学 一种靶向肝脏细胞的运载体及其制备方法
WO2015135432A1 (zh) * 2014-03-13 2015-09-17 上海吉贝医药科技有限公司 靶向脂质体的制备及其应用

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADRIAN G. TORRES等: "Exploiting cell surface thiols to enhance cellular uptake", 《TRENDS IN BIOTECHNOLOGY》 *
ANTOINE KICHLER等: "Efficient gene delivery with neutral complexes", 《BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN.》 *
ANTOINE KICHLER等: "TARGETED TRANSFECTION OF HUMAN HEPATOMA CELLS WITH A COMBINATION OF LIPOSPERMINE AND NEO-GALACTOLIPIDS", 《JOURNAL OF LIPOSOME RESEARCH》 *
DEAN A. HANDLEY: "Preclinical and Clinical Pharmacology of Platelet-Activating Factor Receptor Antagonists", 《MEDICINAL RESEARCH REVIEWS》 *
KAZUO MARUYAMA等: "Immunoliposomes bearing polyethyleneglycol-coupled Fab" fragment show prolonged circulation time and high extravasation into targeted solid tumors in vivo", 《FEBS LETTERS》 *
KAZUO MARUYAMA等: "Targeting efficiency of PEG-immunoliposome-conjugated antibodies at PEG terminals", 《ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS》 *
TIANSHU LI等: "A novel application of maleimide for advanced drug delivery: in vitro and in vivo evaluation of maleimide-modified pH-sensitive liposomes", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF NANOMEDICINE》 *
ZHIQIANG YAN等: "Tumor-Penetrating Peptide Mediation: An Effective Strategy for Improving the Transport of Liposomes in Tumor Tissue", 《MOL. PHARMACEUTICS》 *
温守明: "肝细胞半乳糖（H-Gal）受体导向药物的研究进展", 《药学研究》 *
王亚莉等: "基因治疗中肝靶向研究的进展", 《华西医学》 *
贾长库: "肝特异性抗原在同种肝移植免疫反应中作用的实验研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)医药卫生科技辑》 *

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